TP MA 2024 - Cultivo de H. titanicae en Br.pdf

​ Rev. 240924 ​ ​ Guía de Trabajo Práctico ​ Producción sustentable de bioplásticos ​Introducción Los biorreactores de tanque agitado son sistemas de cultivo de amplia aplicación...

​ Rev. 240924 ​ ​ Guía de Trabajo Práctico ​ Producción sustentable de bioplásticos ​Introducción Los biorreactores de tanque agitado son sistemas de cultivo de amplia aplicación en investigación, desarrollo y producción. Estos dispositivos, de los que se dispone de adecuada experiencia, pueden ser operados en modo discontinuo, semicontinuo y continuo, según los objetivos perseguidos y las características del proceso particular. El polihidroxibutirato (PHB) es un polihidroxialcanoato (PHA), polímero perteneciente a la familia de los poliésteres. Estas macromoléculas pueden ser sintetizadas y utilizadas como reserva de energía, formando inclusiones celulares insolubles en el citoplasma. El PHB puede ser producido de manera natural por Halomonas titanicae y su relevancia biotecnológica reside en la posibilidad de producción de plásticos biodegradables en reemplazo de los petroplásticos tradicionales. Objetivos ​Adquirir destrezas en la operación de un biorreactor tanque agitado instrumentado de escala laboratorio. Desarrollar y monitorizar un cultivo bacteriano. Materiales y Métodos Microorganismo y medios de cultivo. Se empleará la cepa Halomonas titanicae KHS3 aislada del puerto de Mar del Plata perteneciente al Laboratorio de Microbiología Molecular (IAL, CONICET – UNL), que fue gentilmente cedida por la Dra. Claudia Studdert. Se utilizarán el medio de cultivo LB 2 modificado para el inóculo y el medio H1 (Corti Monzón et al., 2018) modificado para el cultivo en el reactor, según se describen en el Anexo. Cultivo en el biorreactor Se empleará un biorreactor tanque agitado (Biostat A Plus, Sartorius Stedim, Alemania) de 2 l de capacidad (ver Fig. 2 en el Anexo). El vaso del biorreactor consta de una tapa que contendrá puertos específicos para: i) la inoculación, conectado a su respectivo reservorio de 250 mL de capacidad; ii) el sistema para la toma de muestras; iii) la adición automática de antiespumante, conectado a su respectivo reservorio de 100 mL de capacidad; iv) la adición automática de NaOH 2 M, conectado a su respectivo reservorio de 500 mL de capacidad; v) la inserción de la sonda de temperatura; vi) la inserción del electrodo para la monitorización del pH; vii) la Microbiología Aplicada inserción del electrodo para la monitorización de la tensión de oxígeno disuelto (pO2); viii) la inserción de la sonda de nivel (para el sensado de espuma); ix) el burbujeador; x) el refrigerante para la salida de gases; xi) el refrigerante para el control de la temperatura del cultivo; xii) los bafles. El resto de los puertos no utilizados de la tapa del biorreactor, deberán cerrarse con los dispositivos herméticos previstos. En la Fig. 2 (Anexo) se muestra un esquema de la tapa del biorreactor y los usos de los diferentes puertos previstos durante el Trabajo Práctico. En la tapa se ubica, además, un acople que vincula el motor, encargado de la agitación, con un impulsor tipo Rushton de 6 paletas, a través de un eje. Cargar el vaso con 950 ml de medio de cultivo. Calibrar el electrodo de pH e insertarlo en su puerto correspondiente. Calibrar la bomba específica para la adición automática de base mediante el control de pH. Calibrar la bomba específica para la adición automática de antiespumante mediante el control por la sonda de nivel. Controlar las vías que deben cerrarse y las que deben permanecer abiertas a fin de evitar fugas del medio de cultivo o roturas del vaso durante la esterilización, a realizar en autoclave a 121°C, durante 20 minutos. Finalizada la esterilización y habiendo el equipo tomado temperatura ambiente, realizar las siguientes maniobras: i) conectar las líneas de gases (aire); ii) conectar las líneas de agua (refrigeración y condensador) y abrir el paso; iii) conectar la manta calefactora; iv) conectar las sondas (pH, pO2, temperatura y nivel); v) conectar el motor verificando el correcto calce del mismo; vi) agregar el resto de componentes del medio de cultivo al vaso (que fueron esterilizados de manera independiente); vii) poner el equipo en régimen (velocidad de agitación, temperatura y pH); vii) calibrar el electrodo de pO2. Para operar el equipo (punto vii y demás), arrancar el software específico de control del biorreactor (PC-Panel MicroDCU, Sartorius Stedim, Alemania). Ajustar el flujo de aireación a 500 ml min-1. Introducir un set-point de pO2 de 20 %. El control de este parámetro se realizará automáticamente en modo cascada (velocidad de agitación: 200 – 800 RPM). El control de pH se realizará automáticamente manteniendo 7,0 unidades mediante el empleo de la solución de hidróxido de sodio. El valor de ajuste para la temperatura será de 30 °C. La inoculación se realizará con 50 ml de un cultivo de la cepa desarrollado medio LB 2 modificado (ver Anexo), en un frasco Erlenmeyer de 250 ml incubado a 30°C y con agitación orbital. Tomar una muestra luego de la inoculación (muestra de tiempo cero) y procesarla como se indica más adelante. Periódicamente, colectar muestras del cultivo y determinar la absorbancia a 600 nm (DO600). Llevar el espectrofotómetro a cero usando agua destilada. En caso de requerirse, diluir convenientemente una alícuota de la muestra con agua destilada a fin de que el valor de la Microbiología Aplicada absorbancia medido sea ≤ 0,8 unidades. Con el valor determinado, calcular el tamaño de la muestra a procesar (VM) aplicando la ecuación (1): 4800 𝑉𝑀(µ𝑙) = 𝐷𝑂600 (1) Centrifugar el volumen calculado de la muestra a 12.000 rpm, por 5 minutos. Separar el pellet del sobrenadante, conservando ambos en tubos Eppendorf a -20 °C para ser analizados durante el segundo encuentro de TP. Inmediatamente después de tomada la muestra determinar el consumo de oxígeno, procediendo de la siguiente manera: i) detener el control automático del oxígeno disuelto; ii) detener la aireación del cultivo cerrando el ingreso de aire desde su rotámetro; iii) computar la tensión de oxígeno disuelto inicial (pO2i) y final (pO2f) durante un lapso determinado (t); iv) reestablecer el flujo de aireación abriendo adecuadamente el rotámetro ; v) reactivar el modo de control automático de la pO2; vi) calcular el consumo global de oxígeno (QO2) aplicando la ecuación (2): 𝑖 𝑓 −1 𝑝𝑂2−𝑝𝑂2 ( 𝑄𝑂2 %𝑚𝑖𝑛. ) = 𝑡 (2) Determinaciones off-line Determinación del porcentaje de PHB acumulado (en el pellet) 1- Resuspender cada pellet conservado de las muestras con 6 ml de agua destilada. 2- Homogeneizar adecuadamente. 3- Tomar sendas fracciones de 2,8 ml de la suspensión celular y distribuirlas en sendos tubos para cada muestra. 4- Agregar a cada par de tubos de cada muestra los correspondientes volúmenes de agua destilada o lavandina, según se indica en la siguiente Tabla. Tubo 1 – Muestra X Tubo 2 – Muestra X 2,8 ml suspensión 2,8 ml suspensión 620 μl agua destilada 620 μl lavandina (*) (*) Usar agua lavandina de 55 g l-1 de cloro activo nominal. 5- Incubar los tubos en baño de agua a 37 °C durante 30 min. 6- Retirar los tubos del baño y dejar enfriar a temperatura ambiente 7- Determinar la absorbancia a 600 nm (DO600) de cada tubo, llevando a cero el espectrofotómetro con agua destilada. 8- Calcular el porcentaje de PHA acumulado en las células (PHA %) de cada muestra aplicando la ecuación (3): Microbiología Aplicada  𝐷𝑂600𝑇𝑢𝑏𝑜2 𝑃𝐻𝐴(%) = 𝐷𝑂600𝑇𝑢𝑏𝑜1 𝑥100 (3) Determinación de la concentración de glicerol (en el sobrenadante) 1- Descongelar la muestra conservada que se valorará, homogeneizándola adecuadamente. 2- Tomar una alícuota de la muestra y diluirla 1/30 con agua destilada. 3- Rotular tres tubos como Blanco (B), Testigo (T) y muestra (M). 4- Agregar 10 μl de agua destilada al tubo B. 5- Agregar 10 μl de la solución del Testigo al tubo T. 6- Agregar 10 μl de la dilución de la muestra al tubo M. 7- Agregar 1 ml de solución de trabajo del kit comercial a cada uno de los 3 tubos, evitando la generación de espuma. 8- Incubar 20 min. a temperatura ambiente. 9- Agregar a cada tubo 2 ml de agua destilada. 10- Mezclar suavemente cada tubo, evitando la generación de espuma. 11- Determinar la absorbancia a 505 nm (DO505) de cada tubo, llevando a cero el espectrofotómetro con agua destilada. 12- Calcular la concentración de glicerol (Cglicerol) en la muestra aplicando la ecuación (4): −1 𝐷𝑂505𝑇𝑢𝑏𝑜𝑀−𝐷𝑂505𝑇𝑢𝑏𝑜𝐵 ( 𝐶𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙 𝑔𝑙 ) = 𝐶𝑡𝑒𝑠𝑡𝑖𝑔𝑜(𝑔𝑙−1)𝑥 𝐷𝑂505 𝑇𝑢𝑏𝑜𝑇−𝐷𝑂505𝑇𝑢𝑏𝑜𝐵 (4) Determinación de la concentración de amonio (en el sobrenadante) 1- Descongelar la muestra conservada que se valorará, homogeneizándola adecuadamente. 2- Rotular tres tubos como Blanco (B), Testigo (T) y muestra (M). 3- Agregar 10 μl de agua destilada al tubo B. 4- Agregar 10 μl de la solución del Testigo al tubo T. 5- Agregar 10 μl de la muestra al tubo M. 6- Agregar 0,5 ml de solución Reactivo A del kit comercial a cada uno de los 3 tubos. 7- Agregar 0,5 ml de solución Reactivo B del kit comercial a cada uno de los 3 tubos. 8- Mezclar suavemente cada tubo, evitando la generación de espuma. 9- Incubar 20 min. a temperatura ambiente. Microbiología Aplicada 10- Agregar a cada tubo 5 ml de agua destilada. 11- Mezclar suavemente cada tubo, evitando la generación de espuma. 12- Determinar la absorbancia a 610 nm (DO610) de cada tubo, llevando a cero el espectrofotómetro con agua destilada. 13- Calcular la concentración de amonio (Camonio) en la muestra aplicando la ecuación (5): −1 𝐷𝑂610𝑇𝑢𝑏𝑜𝑀−𝐷𝑂610𝑇𝑢𝑏𝑜𝐵 ( 𝐶𝑎𝑚𝑜𝑛𝑖𝑜 𝑔𝑙 ) = 𝐶𝑡𝑒𝑠𝑡𝑖𝑔𝑜(𝑔𝑙−1)𝑥 𝐷𝑂 𝑇𝑢𝑏𝑜𝑇−𝐷𝑂610𝑇𝑢𝑏𝑜𝐵 610 (5) ​Bibliografía Corti Monzón et al. (2018) New Findings on Aromatic Compounds’ Degradation and Their Metabolic Pathways, the Biosurfactant Production and Motility of the Halophilic Bacterium Halomonas sp. KHS3. Curr Microbiol 75: 1108 – 18. https://doi.org/10.1007/s00284-018-1497-x Macauley-Patrick, S., McNeil, B. (2008) Modes of fermenter operation. En: Practical Fermentation Technology. McNeil, B., Harvey, L. M. (eds.) Wiley. Págs.: 69 – 95. Matthews, G. (2008) Fermentation equipment selection: laboratory scale bioreactor design considerations. En: Practical Fermentation Technology. McNeil, B., Harvey, L. M. (eds.) Wiley. Págs.: 3 – 36. https://www.sartorius.com/ http://www.wiener-lab.com.ar/ Microbiología Aplicada Anexo Medio de cultivo H1 modificado Componente Concentración (g l-1) Glicerol 30,0 NaCl 20,0 K2HPO4 11,2 KH2PO4 4,8 (NH4)2SO4 2,0 Extracto de levadura 0,5 Disolver los ingredientes en agua destilada. Controlar el pH (7,00 unidades) y llevar a volumen final con el mismo solvente. Esterilizar a 121 °C durante 20 min. Suplementar con soluciones estériles de las siguientes sales, a fin de obtener las concentraciones finales que se indican: MgSO4 1 mM FeCl3 5 x 10-4 g l-1 Medio de cultivo LB 2 modificado Componente Concentración (g l-1) Peptona de caseína 10 Extracto de levadura 5 NaCl 20 Disolver los ingredientes en agua destilada y llevar a volumen final con el mismo solvente. Esterilizar a 121 °C durante 20 min. En relación a los medios de cultivo empleados, se deben analizar las diferencias entre las diversas fuentes de energía, carbono y nitrógeno en cada uno de los casos. Recordar que el medio LB 2 modificado se emplea para el desarrollo del inóculo mientras que el medio H1 modificado es el empleado en el reactor. Ambos medios son aptos para el crecimiento de Halomonas titanicae. No obstante, el medio H1 modificado fue diseñado buscando componentes alternativos que permitan el adecuado desarrollo del microorganismo pero que sean más económicos y de fácil acceso/disponibilidad al momento de plantear el escalado del proceso. Notar que la principal fuente de carbono es el glicerol, que suele ser un sustrato económico por su creciente oferta en el mercado al ser un subproducto del proceso de producción de biodiésel. Microbiología Aplicada En ambos casos los medios presentan elevadas concentraciones de NaCl ya que el microorganismo es halófilo. Las concentraciones de carbono y nitrógeno en este bioproceso son determinantes. Al inicio del cultivo es necesario asegurar concentraciones suficientes tanto de la fuente de carbono como la de nitrógeno para permitir que ocurra la duplicación celular y, así, obtener una concentración adecuada de biomasa, la cual pueda -eventualmente- acumular el bioplástico (producto de interés). La acumulación de PHB inicia cuando la concentración de nitrógeno en el medio se acerca a cero (sustrato limitante). En este momento, y por cómo fue diseñado el medio de cultivo, la relación C/N es elevada, es decir, la concentración de carbono es muy superior a la de nitrógeno. Gracias a ello, el metabolismo del microorganismo se vuelca hacia la producción del bioplástico y ya no a la de biomasa. Recordando que el PHB es un biopolímero que el microorganismo acumula como reserva de carbono y energía, se debe asegurar que, durante todo el proceso, nunca falte la fuente de carbono en el medio de cultivo ya que eso implicaría una pausa en el proceso de acumulación e, incluso, la reutilización de dichos gránulos por parte de la bacteria (pérdida del producto deseado). Consideraciones Respetar estrictamente las indicaciones de trabajo impartidas por los docentes. Evitar distracciones innecesarias durante la clase, manteniendo especial atención durante las distintas actividades a fin de lograr los objetivos de aprendizaje y evitar accidentes o inutilización de los materiales e insumos empleados. Finalizada la práctica experimental, acondicionar convenientemente el material empleado para su adecuado descarte (respetando la segregación de residuos), esterilización o reciclado, según corresponda. Guía para la elaboración del informe del Trabajo Práctico El informe de Trabajo Práctico deberá constar de los siguientes apartados: ​ Carátula. ​ Introducción. ​ Objetivo. ​ Materiales y métodos. ​ Resultados. ​ Conclusiones. ​ Bibliografía. Microbiología Aplicada  ​ Anexo. Podrá tener un máximo de 10 páginas en total. El archivo deberá ser presentado en formato.pdf con el nombre: “TP MA 2024 – Comisión ….”, completando la línea de puntos con el número correspondiente de comisión. La entrega se realizará vía Aula Virtual según el cronograma previsto (consultar fechas límites de entrega). 1- En el apartado de “Introducción” se deberá incluir: i) El microorganismo empleado y su importancia tecnológica. ii)Definición del bioproducto de interés y características más relevantes. Condiciones metabólicas en que ocurre la síntesis. iii) Breve descripción de la tecnología de la fermentación aplicada. 2- Identificar cuál es el “objetivo” principal del Trabajo Práctico. 3- En “Materiales y métodos”: i) Indicar la cepa de trabajo. ii) Indicar los medios de cultivo empleados y las características más relevantes de los mismos. iii) Adjuntar un esquema de la configuración del biorreactor utilizado en la práctica, señalando cada uno de sus componentes. iv) Adjuntar y completar el siguiente cuadro: Variable Tipo de Sensor Controlador Valor de Actuador/es analizada seguimiento setpoint (on line/off line) Aclaración: Tener en cuenta que las últimas cuatro columnas sólo podrán ser completadas si las variables analizadas corresponden a determinaciones on line. v) Para el caso de las determinaciones off line, mencionar las técnicas empleadas (sin ahondar en los detalles de protocolo). 4- En “Resultados”: i) Graficar las curvas de calibrado correspondientes a las determinaciones de la concentración de glicerol y amonio. Informar los parámetros de ajuste de la curva. (Nota: se entregarán los datos experimentales para la confección de estas gráficas). ii) Procesar convenientemente los resultados obtenidos en las determinaciones de glicerol, amonio y contenido celular de PHA. Analizarlos. Aclaración: Si bien durante el TP se emplearán testigos para el cálculo de las concentraciones de glicerol y amonio para un único punto en el Microbiología Aplicada tiempo (la muestra tomada por los alumnos durante el TP), para el informe se deberán calcular las concentraciones de todas las muestras (datos experimentales entregados por los docentes) empleando los parámetros obtenidos de las curvas de calibrado (punto 4-i). iii) Se brindarán gráficas de la evolución de las variables monitorizadas on line durante el cultivo. Analizar si el comportamiento en cada caso fue el esperado. De ser posible, relacionarlo con la evolución en el tiempo de las variables determinadas off line. 5- Elaborar “conclusiones” en base a los resultados analizados. 6- Informar la “bibliografía” empleada. 7-Incluir en el “anexo” los detalles de cálculos realizados y cualquier otra información/imagen/gráfico que considere pertinente. Microbiología Aplicada Figuras Figura 1: Fotografía de preparado de Halomonas titanicae con tinción simple (Cristal Violeta), observado en microscopio óptico con objetivo de inmersión de 100 X. El preparado se realizó con una muestra del cultivo a tiempo final. Se pueden apreciar bacilos cortos de agrupación irregular que presentan zonas en el interior celular que no se tiñen con el cristal violeta. Dichas zonas corresponden a los gránulos intracelulares de PHB. Figura 2: Fotografía del biorreactor a emplear en la práctica. Se puede observar el vaso (izquierda) con accesorios, la consola de control (centro) con rotámetros y bombas peristálticas y la computadora (derecha) para el control del proceso y almacenamiento de datos on-line. Fuente: BIOSTAT® Aplus The compact, autoclavable fermentor | bioreactor. Sartorius Stedim Biotech. Publication No.: SBI2014-e09073 · Order No.: 85032-534-47 · Ver. 07 (2009) Microbiología Aplicada Figura 3: Esquema de los puertos de la tapa del biorreactor Biostat A Plus (Sartorius Stedim) y los usos previstos en el TP. Referencias: N1: puerto para el refrigerante del sistema de termostatización; N2: puerto cerrado; N3: puerto para el bolsillo de la sonda de temperatura; N4: puerto para el sensor de pH; N5: puerto de 4 vías con conexiones al reservorio de NaOH 2M y al del antiespumante; N6: puerto cerrado; N7: puerto para el condensador salida de gases; N8: puerto para la conexión al sistema toma muestras; N9: puerto para la conexión al reservorio de inoculación; N10: puerto para el sensor de pO2; N11: puerto para el burbujeador; N12: puerto para el amarre del bafle; N13: puerto cerrado; N14: puerto para la sonda de nivel. Fuente: Sartorius Stedim Biotech. Figura 4: Esquema de actividades a realizar durante el Trabajo Práctico. Aclaraciones: i) la realización de los extendidos queda sujeta a disponibilidad de tiempo durante el TP y de realizarse se recordará en el momento el procedimiento a aplicar; ii) las Determinaciones analíticas indicadas en el esquema corresponden a las “determinaciones off line” explicadas en la Guía de TP. Microbiología Aplicada