Unidad 2: Introducción al Cultivo Celular - Universidad Politécnica Salesiana

UNIDAD 2 Introducción al cultivo celular Células madre Un poco de historia….. Extensión de la Teoría Celular → Afirmaba que todas las células se originan a partir de una célula madre...

UNIDAD 2 Introducción al cultivo celular Células madre Un poco de historia….. Extensión de la Teoría Celular → Afirmaba que todas las células se originan a partir de una célula madre única. PROMETEO Concepto de regeneración y reparación tisular Ernst Haeckel Generalidades Son células que se encuentran en todos los organismos multicelulares. Tienen la capacidad de dividirse a través de la mitosis Pueden diferenciarse en diversos tipos de células especializadas. En los mamíferos, existen diversos tipos de células madre que se clasifican de acuerdo a su potencia. En los organismos adultos, las células madre actúan en la regeneración o reparación de los tejidos. Definición de célula madre Célula indiferenciada que presenta el potencial de autorrenovarse (proliferación) y generar un linaje celular con capacidad de diferenciarse. Terminología Autorenovación Diferenciación Tipo de división mitótica en el que las células Proceso en el cual las células se dividen o sufren hijas son idénticas a la célula que les dio origen. cambios morfológicos graduales y controlados para generar células especializadas (cambios de su expresión génica) Simétrica Asimétrica Células hijas 1 Células hijas idénticas. idénticas. Bajo pool de 1 Célula hija células comprometida con la diferenciación. Pero como ocurre la diferenciación? Nicho Microambiente instructivo especializado, en el que las células madre residen. Matriz extracelular (biomoléculas y factores de crecimiento) Factores físicos (topografía de los NICHO compartimentos anatómicos) CELULAR Factores necesarios para regular el desarrollo, Metabolismo especialización, funcionamiento celular y supervivencia. Sistema de células madre Células con cero Renovación o recambio celular (Rápido o lento) capacidad de autorrenovación Cumplen una función en especificó Células con limitada autorrenovación Células comprometidas con la diferenciación Partes profundas del tejido, lejos de zonas de estrés físico-químico y desgaste Células madre Clasificación de células madre Diferentes criterios Potencial para Estado de Tejido de origen formar diferentes desarrollo tipos de células Totipotentes Pluripotente Embrionarias Adultas Hematopoyéticas Cordón umbilical Multipotente Unipotente  Blastocisto→ Bola formada por 50 a 100 células, Clasificación, estado de desarrollo constituido por una capa externa de células, un espacio lleno de líquido y un grupo de células llamadas la "masa interna celular". Células madre embrionarias (ESC) Se extraen de la parte interna del blastocisto (masa cellular interna) Alta capacidad de proliferación → forman cualquier tejido del cuerpo Pluripotentes →Células fetales y adultas (in vivo e in vitro) Clasificación, estado de desarrollo Células madre adultas Presentes en el feto en desarrollo, RN, niños y adultos Limitados y especializados → origen a uno o dos tipos de tejidos (células madre hematopoyéticas) Constante Reemplazo o regeneración→ células o dañadas Clasificación de células madre Diferentes criterios Potencial para Estado de Tejido de origen formar diferentes desarrollo tipos de células Totipotentes Pluripotente Embrionarias Adultas Hematopoyéticas Cordón umbilical Multipotente Unipotente Clasificación, según su potencial Totipotencia 1.) Del latín "toti" = todo 2.) Estas células vienen de la unión de un óvulo y espermatozoide, por lo tanto estas células pueden formar un organismo. Pluripotencia 1.) Del latín "pluris"= muchísimo 2.) Capaces de generar todos los tejidos del organismo (endodermo, ectodermo y mesodermo). Recalcando el hecho de que “no pueden formar un organismo”. Clasificación, según su potencial Multipotente 1.) Del latín "multi“ = varios. 2.) Capaces de generar un número pequeño, reducido o limitado de de tipos celulares. 3.) Permite recambio o reparación celular → Reemplazo de células muertas. 4.) Células hematopoyéticas. Unipotente 1.) Capaces de generar a una célula especializada o una sola línea celular dentro de un órgano o tejido especifico. Aplicaciones Trasplantes autólogos → Reinserción de células madre del mismo paciente o donante Trasplantes alógenos → Uso de células madre provenientes de un donante con cierto grado de parentesco. Aplicaciones Reprogramación celular → Células somáticas a través de la introducción retroviral de 4 genes OCT4, SOX2, KLF4 y c-Myc. Casete de Reprogramación LTR EF-1α OCT4 KLF4 SOX2 C-Myc LTR Parámetros a evaluar para aplicación de la terapía Eficacia y seguridad (estudios de viabilidad y funcionalidad en modelos animales) Determinación de riesgos (Estudios de estabilidad genética) Aplicaciones Reprogramación celular → Células somáticas a través de la introducción retroviral de 4 genes OCT4, SOX2, KLF4 y c-Myc. Casete de Reprogramación LTR EF-1α OCT4 KLF4 SOX2 C-Myc LTR Retos de la tecnología Ventaja al evitar problemas de rechazo. No obstante no se conoce en detalle el mecanismo de acción en la desdiferenciación a células pluripotentes Desarrollo de mejores protocolos de reprogramación y uso de otros vectores Aplicaciones Restaurar la fusión tisular Células o sustituir tejidos enfermos y/o dañados Cultivo Biomateriales de tejidos Biomoléculas activas Aplicaciones Células cancerígenas Progenitoras → Diferenciadas y con capacidad tumorogénica (estadio del cáncer / tumor) Aplicaciones Conocimiento de células madre tumorales y sus mecanismos de proliferación Tumor → Populación celular capaz de autorrenovarse (origen de progenitores de amplificación rápida) Cultivo de tejidos Un poco de historia….. Cáncer Cérvico-Uterino (Carcinoma → VPH) Henrieta Lacks Características → Genes llenos de errores, lo cual deriva en un Crecimiento acelerado y agresivo. Células inmortales “Reproducción constante” in vitro Investigación → Cáncer, enfermedades y expresión génica. Consideraciones Bioéticas no respetadas. Definición de cultivo celular Conjunto de técnicas → Aislar, crecer, mantener y reproducir de manera in vitro células de origen animal o vegetal. Con la finalidad de sostener al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Obtención 1.) Explantes de biopsia (Fragmento escindido desde un órgano o tejido) 2.) Por perfusión de órganos 3.) Disgregación de tejidos 4.) Fluidos orgánicos (sangre) Infraestructura Incubadora de con y sin CO2 → Atmosfera Área especializada únicamente controlada de para cultivo celular cambio gaseoso y (independiente) → Cabina de humedad. bioseguridad (FILTROS HEPA). Almacenami ento→ Cadena de frio (Nitrógeno liquido) Condiciones cultivos Nutrientes pH Temperatura esenciales (Ejemlpo: aminoácidos, carbohidratos). Condiciones de cultivo Factores de varían Vitaminas y crecimiento dependiendo minerales del tipo celular Presión Anclaje Gases Osmótica  Mayor Medio fresco confluencia (pH: 7.6) (pH: 6.5) Inicio del cultivo (pH: 7.4) Clasificación Cultivos celulares Línea Primarios celular Cultivo celular primario Cultivo de células que provienen de manera directa de un organismos (tejido u órgano con o sin su fraccionamiento previo). Subcultivos o pases Constituidos por (Transferir un distintos tipos de Proliferación limitada pequeño número de células “Coculitivo” células a un nuevo medio) Clasificación Adherencia a superficies Presencia de Integrinas / proteínas Cadherinas / presentes en Fibronectina superficie. Monocapa Suspensión Cultivo en Monocapa También denominadas células de anclaje-dependientes a soportes (solido o plástico) → Agrupación celular que requiere de un sustrato para iniciar su proliferación, se presenta en forma de una sola capa uniforme que empieza a extenderse sobre la superficie del fondo de la placa. Confluencia → Porcentaje de la Senescencia → Perdida paulatina de superficie del soporte cubierto u capacidad de dividirse por mitosis ocupado por células. dando origen apoptosis. Cultivo en Monocapa PASES DE CÉLULAS Fase “lineal”: Período de crecimiento celular balanceado (mantenimiento de un metabolismo basal y/o activo). Fase Plateau Fase (estacionaria): Período “exponencial”: Período en donde la tasa de de crecimiento celular proliferación empieza a acelerado (tiempo de disminuir. Agotamiento CONFLUENCIA generación). de nutrientes esenciales y acumulación de sustancias de desecho. Fase “lag”: Período en el cual el inóculo empieza a adaptarse a las condiciones del medio (ajuste metabólico). Cultivo en Suspensión Células capaces de proliferar sin necesidad de adherirse a un sustrato → Disminución de la síntesis de proteínas de proteínas de anclaje. Células hematopoyéticas / Células tumorales. Matraces giratorios de cultivo estériles (intercambio de gases y permite cultivar volúmenes de células) Cultivo Líneas celulares Posterior al primer subcultivo, el cultivo primario adquiere el nombre de línea celular o subclon. Células tumorales, Presenta capacidad Línea celular presencial de de subcultivarse 70 continua anomalías veces o más genéticas Línea celular Grado de Presenta un uniformidad Línea celular finita numero limitado de genotípica y subcultivo fenotípica. Ventajas y Desventajas -Susceptible a contaminación -Inestabilidad genética debido a pases o subcultivos -Presencia de homogeneidad a diferencia de modelos animales. -Control de los factores que se ven envueltos en su crecimiento -Económico para producción de medicamentos. Uso del Cultivo celular Virología y Estudio de biología farmacología: Producción celular: Dogma celular, de vacunas y ensayos metabolismo, ciclo celular, preclínicos. apoptosis, diferenciación, estructuras celulares. Toxicología: Citotoxicidad celular y OMICAS: Genómica, efecto de agentes que Transcriptómicas, Proteómica, alteran la estructura metabolómica, Epigenómica, celular. Nutrigenómica. Inmunología y Ecología celular: Nicho, Biotecnología: diferenciación celular y Respuestas cinética celular inflamatorias y producción industrial de fármacos (biorreactores)  UNIDAD 3 Aplicaciones Biotecnológicas del cultivo celular Temario Parcial 3 Unidad 3. Bioinstrumentación y Biomateriales 1.) Contenido 1.1 Terapia génica 1.2 Tipos de terapia génica 1.2 Medicina Regenerativa 1.3 Farmacogenética: medicina personalizada 1.4 Terapia génica y edición del genoma Definición Biotecnología Humana La Biotecnología → Conjunto de tecnologías que implican el uso de herramientas moleculares en los organismos vivos para la obtención de vacunas, proteínas recombinantes y anticuerpo monoclonales de uso para el hombre Proteínas recombinantes → Anticuerpos monoclonales Biotecnología → Ingeniería genética → Proteínas recombinantes (Proteína terapéutica). Proteínas: 1.) Biomoléculas con bioactividad. 2.) Participan en todos los procesos de la célula. Estructura de las proteínas Descrita en términos de 4 niveles de organización jerárquica Estructura primaria Estructura secundaria Estructura secundaria Conformaciones Secuencia aminoacídica. Alfa hélice. →Determina su generadas por una Hojas local distribución beta de los plegamiento. →Criterio de identidad átomos de aminoácidos proximales. Estructura terciaria Estructura cuaternaria Organización estructural Arreglo espacial de completa que adopta la organizaciones cadena polipeptídica en estructurales que el espacio. interaccionan entre sí. Cadenas polipeptídicas (multímeros) Estructura de las proteínas Plegamiento → Proceso por el cual las proteínas alcanzan su estructura tridimensional. → Esencial para su función biológica. Desnaturalización → Proteína desnaturalizada es una cadena amorfa de aminoácidos. En algunos casos los procesos de plegamiento y desnaturalización son REVERSIBLES. Desnaturalización de las proteínas Proceso donde ocurre la perdida de la conformación nativa o biológicamente activa de una proteína. - Temperatura. - Cambios de pH. - Agentes desnaturalizantes (cloruro de guanidina) - Agentes reductores (DDT o B- mercaptoetanol) - Detergentes SDS Desnaturalización de las proteínas Rompe los enlaces no covalentes - Detergente. (perdida de la conformación nativa). Esto ocurre porque el SDS se une a las zonas apolares del polipéptido. orgánicos y sales Solventes → Interaccionan con el interior hidrofóbico de las proteínas y desorganizan - Solventes la estructura terciaria. Sales → compiten con las proteínas para la atracción de moléculas de agua. (solvatación) Aumenta su solubilidad, se agregan y precipitan. Desnaturalización de las proteínas - Temperatura. Aumento de la energía y el movimiento de los átomos→ desestabiliza al conjunto de interacciones débiles, responsables del mantenimiento de la conformación de la proteína. Los iones H+ y OH- afectan a la envoltura acuosa de las proteínas y también a la carga - pH. eléctrica de los grupos ácidos y básicos de las cadenas laterales de los aminoácidos. Esta alteración de la carga superficial elimina las interacciones electrostáticas que estabilizan la estructura terciaria. Definición de términos a usar Sustancia que aplicada a un ser Principio activo vivo, desencadena en una respuesta farmacológica, inmunológica y/o (PA) metabólica Principio activo usado para el Fármaco tratamiento y prevención de enfermedades Fármaco preparado para ser administrado a pacientes en dosis Medicamento conocidas y estudiadas (concentración, forma farmacéutica y excipientes). Definición de términos a usar Definición de términos a usar Principio activo (PA) → Acido acetilsalicílico → ácido orgánico que pertenece a la familia de los salicilatos, extraído del sauce. Medicamento genérico VS biosimilar → Definición Medicamento genérico Medicamento biosimilar Aquel medicamento que tiene la misma Aquel medicamento desarrollado a partir de composición cualitativa y cuantitativa del uno de referencia presente en el mercado. principio activo. No obstante, su formulación Se caracteriza por tener diferencias en cuanto farmacéutica varia dependiendo de su a su estructura y método de producción. finalidad. Patente ha caducado. Medicamento genérico VS biosimilar → Diferencias Medicamento biosimilar Medicamento genérico Obtención Organismos vivos, fuente Síntesis química. biológica. Estructura molecular -Compleja y elevado -Sencilla y bajo peso peso molecular. molecular. -Similar al de referencia. -Idéntico al de referencia. -Capacidad -No provocan inmunogénica. inmunogenicidad. Principales vías de administración -Parenteral. -Parenteral y No parenteral. Desarrollo Tiempo 6 a 7 años. 2-3 años. Inversión 30 – 100 millones de 10 millones de dólares. dólares. Regulación Realización de ensayos El medicamento tiene que Ciertas fases, clínicos pasar por todas las fases. dependiendo de las modificaciones. Farmacovigilancia Seguimiento detallado en el plan de riesgos. Aplicación del Cultivo celular en Biotecnología Inmunología y Biotecnología: Respuestas inflamatorias y producción industrial de fármacos (biorreactores) Fases de Desarrollo de un medicamento Desarrollo de un medicamento Identificación y Identificación Investigación validación de de compuestos Optimización Básica la diana lideres Elección de un compuesto, Caracterización y que tiene el potencial de validación del Estudiar la Elección de la tratar la enfermedad compuesto líder Ejemplo: molécula se puede Biología, anatomía biomolécula, cuya unir, activar e inactivar la y fisiología de la función es esencial DT. Escoger aquel enfermedad en el desarrollo de compuesto, con la enfermedad mayor potencial Diversos candidatos de (DT) de convertirse en compuestos, para trabajar un medicamento en los ensayos preclínicos efectivo y seguro. Compuesto líder → Proteínas terapéuticas → A. Monoclonal - Tamaño. -Composición. Se expresa a partir de un gen. -Complejidad estructural. -Inmunogenicidad. -Producción. Clonación y expresión a través del uso de vectores -Purificación. y células hospederas. -Contaminantes. -Efectos secundarios. Proteínas heterólogas. -Estabilidad. -Formulación. -Aspectos regulatorios. Compuesto líder → Proteínas terapéuticas → A. Monoclonal - Tamaño. -Composición. -Complejidad estructural. -Inmunogenicidad. -Producción. -Purificación. -Contaminantes. -Efectos secundarios. -Estabilidad. -Formulación. -Aspectos regulatorios. Pasos de la obtención de la Proteína terapéutica Desarrollo del medicamento Almacenamiento y biotecnológico en manipulación células hospederas - Elevada pureza. -Estable Masificar la producción Formulación → Banco celular farmacéutica -Seguro -Efectivo Producción de Purificación de proteínas terapéuticas proteínas y análisis Desarrollo de un medicamento → Fase 0 o Preclínica Preclínica: Denominada también como fase 0 en donde se caracterizara el perfil de seguridad del compuesto líder, a fin de reducir y anticipar el riesgo existente para humanos. - Estudios de farmacodinámica y farmacocinética → Evalúa la interacción del medicamento con el cuerpo. Vía de administración → Biodisponibilidad Ruta mediante la cual el medicamento es suministrado. Parenteral No Parenteral Idónea para dosis Idónea para dosis únicas de sistémicas de los fármacos fármacos Vía de administración → Biodisponibilidad Fase 0 o Preclínica Biodisponibilidad: Velocidad a la cual la dosis administrada de un fármaco alcanza su diana terapéutica (Diseminación y efecto sobre el tejido). Concentración del fármaco T max: Tiempo al que la concentración es máxima. C max: Concentración máxima del principio activo. Cantidad del fármaco en el tejido. Tiempo (h) Vía de administración → Biodisponibilidad Ruta mediante la cual el medicamento es suministrado. Parenteral No Parenteral 1.Liberación lenta de la droga desde el sitio de ubicación hasta Menos invasivas y menos el torrente sanguíneo dolorosas -Tópico Inyección Inyección Inyección Intravenosa intramuscular -Transmucosal (Pulmonar/ Nasal) subcutánea (IV) (SC) (IM) -Oral -Transdérmica  Vía de administración → Biodisponibilidad Subcutánea Ventajas: 1.) Permite la asimilación de medicamentos proteicos. Administración de un medicamento al interior 2.) Tejido con pocos receptores de dolor y presenta abundante del tejido celular subcutáneo o hipodermis vascularización. (formado por adipocitos) → arrastrado al 3.) Absorción lenta y constante del mismo. torrente sanguíneo. Desventajas: 1.) Administración de volúmenes reducidos de medicamentos. 2.) Formación de abscesos. 3.) Reacciones cutáneas. Intravenosa Ventajas: 1.) Biodisponibilidad total → Acción total. Ubica el medicamento directamente al torrente 2.) Mayor asimilación del compuesto por los tejidos diana. sanguíneo, lo cual elimina la necesidad de a Desventajas: atravesar barreras biológicas. 1.) Administración de soluciones acuosas. 2.) Presencia de complicaciones como la flebitis, infecciones e infiltraciones del tejido que pueden llegar a ser tóxicos → necrótico. Intramuscular Ventajas: 1.) Administración de grandes volúmenes. Ubica el medicamento al interior del músculo 2.) Asimilación del compuesto líder de manera idónea. de cualquiera de las extremidades. Desventajas: 1.) Producir lesiones y su aplicación constante en la zona ocasionaría fibrosis local. Vía de administración → Biodisponibilidad Tópica o cutánea Ventajas: 1.) Fácil uso del medicamento y buena tolerancia → Menos efectos Aplicación del medicamento sistémicos (leves irritaciones). sobre la piel o dermis presenta un 3.) Absorción rápida. efecto local Desventajas: 1.) Acción únicamente en capas externas de la piel, (limitando tratamiento). 2.) Dificultad para controlar la dosis y riesgos de contaminación. Transdérmica Ventajas: 1.) Rápida absorción sistémica y duración de acción prolongada → Administración del medicamento Biodisponibilidad 50% a partir de parche o cualquier 2.) Indolora (mayor aceptación) otro material que va a contener 3.) Disminución de dosis secuenciales de administración (niveles una sustancia medicinal, plasmáticos estables) cuya difusión es clave para Desventajas: alcanzar la circulación. 1.) Requiere atravesar ciertas barreras biológicas. 2.) Efectos de irritación dérmica. 3.) Permite la administración de moléculas de bajo peso molecular y adecuada liposolubilidad. Vía de administración adicionales Sitio de Administración Cavidad Rectal Cavidad Vaginal Deposita el medicamento en el recto, para que Deposita el medicamento en la vagina para se genere disolución y posterior absorción a que sea absorbido por el tejido epitelial través de la mucosa rectal. mucoso. Ótica Ocular u oftálmica Deposita el medicamento (en solución) en la Deposita el medicamento (en solución) por parte interna del odio, este es absorbido por el sobre la mucosa conjuntival. tejido epitelial. Vía de administración → Biodisponibilidad Vía Oral: También denominada vía enteral, ruta por la cual un medicamento es deglutido y posterior absorción gastrointestinal. Características: Segura, meno costosa y más aceptada por los pacientes. Desventajas: 1.) Inactivación del medicamento (compuesto líder + excipientes) → Ácido estomacal y degradación de proteasas (pepsina y tripsina). 2.) Moléculas con un alto tamaño molecular no logran pasar intactas a través de la mucosa intestinal → Baja biodisponibilidad (menos del 50%). Estrategias para vencer las limitaciones: 1.) Protección física del medicamento → Encapsulación 2.) Inclusión dentro de la formulación de inhibidores de proteasas y potenciadores de la permeabilidad. Vía de administración → Biodisponibilidad Vía pulmonar: Ruta por la cual un medicamento ingresa al organismo a través de vías respiratorias (aire inspirado) y posterior liberación gradual al torrente sanguíneo. Ventajas: 1.) Elevados niveles de absorción de moléculas con un alto peso molecular (hasta 500 kDa) → Biodisponibilidad mayor al 50%. 2.) Pulmones se traducen en un área de superficie muy grande en donde existen inhibidores de proteasas que ayudan a su asimilación. 3.) Nebulizadores → Liberación de dosis exactas Desventajas: 1.) Se debe atravesar ciertas barreras biológicas → Mejor absorción del medicamento. - Surfactante pulmonar presente en los alveolos - Diferentes estratificaciones de células pulmonares y luego el endotelio vascular. Fase 0 o Preclínica Bioequivalencia: Evaluación comparativa in vivo de dos formulaciones de un mismo medicamento que presente el mismo principio activo. - Biosimilares y genéricos. - Biodisponibilidad, eficacia y seguridad deben ser semejante. Fase 0 o Preclínica Toxicidad: Respuesta fisiológica debido a la lesión celular a corto y largo plazo. Toxicidad aguda Toxicidad crónica 1.) Uso de dosis altas. 1.) Administración diaria de la droga. 2.) Analiza a través de 2.) Analiza a través de distintas distintas vías de vías de administración. administración. 3.) Monitoriza a los animales 3.) Monitoriza a los Dosis letal más de 2 años. animales 7 a 14 días. media (LD50) 4.) Monitoreo de signos clínicos y verificación de 4.) Análisis del LD50 biomarcadores Toxicidad reproductiva 1.) Dosis no toxicas y ligeramente toxicas 2.) Ciclos de espermatogénesis y en el desarrollo folicular. Fase 0 o Preclínica Teratogenicidad: Capacidad del medicamento para causar daño y malformaciones en el feto, durante cualquier etapa de su desarrollo. Mutagenicidad: Capacidad del medicamento para inducir daño en el ADN, ya sea alterando la estructura cromosomal o generando cambios en las secuencias de nucleótidos. Fase 0 o Preclínica Carcinogenicidad: Capacidad del medicamento para provocar cáncer, debido a la alteración del ADN (mutaciones). Esto se produce por consumo prolongado del mismo. Inmunotoxicidad: Capacidad del medicamento de desencadenar una respuesta alérgica o de hipersensibilidad. Desarrollo de un medicamento → Ensayo Clínico Solicitud a entidades regulatorias Entrega de Dossiers. Compuesto satisface competentes: FDA las pruebas (Food and Drug farmacológicas, Compuesto líder → Administration), toxicológicas y Medicamento nuevo EMEA (European bioquímicas. de investigación. Medicines Agency), entre otros. Inicio de fase Clínica Ensayo Clínica 1.) Estudio médico enfocado testear los efectos de un medicamento en la morfofisiología de los seres humanos. Definición de un 2.) Objetivo → Conocer la eficacia del fármaco ensayo clínico mediante un análisis experimental con sujetos de prueba, los cuales se engloban en grupos de tratamiento. 3.) Ensayo se debe realizar bajo parámetro establecidos de bioética, que rijan la participación y protección. Ensayo clínico → Fase 1  Evalúa la seguridad del medicamento atreves de parámetros de farmacocinética y farmacodinámica → Evaluaciones de la dosis máxima tolerada y efectos secundarios.  Estudio corto que puede envolver días o meses.  Numero pequeño de voluntarios 10 a 80 personas.  Alrededor del 70% de los fármacos pasan esta etapa. Ensayo clínico → Fase II  Evaluar el efecto terapéutico del producto y determinar la dosis eficaz (posología).  Estudio con larga duración que pueden darse en meses e incluso años (2 años).  Numero intermedio y homogéneo de voluntarios 100 a 300 personas.  Solo un tercio de los fármacos experimentales logran pasar de manera exitosa las fases I y II. Ensayo clínico → Fase III  Determinación de la relación riesgo / beneficio.  Comparación entre un placebo o con un medicamento de referencia.  Tiempo del estudio: 1 a varios años.  Estudio comparativo para un número mayor de personas: 1000 a 3000 individuos.  Del 70 al 90% de los fármacos que ingresan a esta fase son candidatos a ser aprobados para su comercialización. Ensayo clínico → Fase IV  Determinación de los efectos a largo plazo en la calidad de vida del paciente.  Determinar coste - efectividad del tratamiento con respecto a otros. Vigilancia post  Comparación del producto con otros presentes comercialización. en el mercado.  Estudio involucra a toda la población.  Estudios nunca finalizan y permiten a la industria farmacéutica en obtener datos fiables para la revisión de la aprobación de comercialización, que se actualiza cada cierto tiempo. Resumen del ensayo clínico Desarrollo de un medicamento → Aprobación y Registro  UNIDAD 3 Aplicaciones Biotecnológicas del cultivo celular Temario Parcial 3 Unidad 3. Bioinstrumentación y Biomateriales 1.) Contenido 1.1 Terapia génica 1.2 Tipos de terapia génica 1.2 Medicina Regenerativa 1.3 Farmacogenética: medicina personalizada 1.4 Terapia génica y edición del genoma Obtención de una proteína recombinante → Anticuerpo monoclonal Desarrollo del medicamento Almacenamiento y biotecnológico en manipulación células hospederas Masificar la producción Formulación → Banco celular farmacéutica Producción de Purificación de proteínas terapéuticas proteínas y análisis Desarrollo del medicamento en células hospederas. Conocimiento de la enfermedad → Selección del gen blanco o de interés. Bases de datos publicas Bases de datos Desarrollo del medicamento en células hospederas. Cultivo de células primarias Extracción del material genómico de interés Clonaje del producto de PCR Desarrollo del medicamento en células hospederas → Clonación Definición RAE → Acción y efecto de clonar Clonar → Definición RAE → Copiar de modo exacto, algo ya existente Nivel de conocimiento. Facilidad de manipulación y cultivo. Niveles altos de expresión, mayor al 50% Desarrollo del medicamento en células hospederas → Expresión Desarrollo del medicamento en células hospederas → Expresión Vector Vehículo que transporta un gen dentro de la célula receptora y es responsable de su replicación. Capaz de replicarse dentro de la célula receptora. Marcadores de selección específicos para las bacterias. Poseer una o varias secuencias de restricción. Análisis de promotores u otros elementos génicos Desarrollo del medicamento en células hospederas →Vector Estructura general del vector Desarrollo del medicamento en células hospederas →Vector Promotor: Una secuencia de ADN la cual dará inicio de la transcripción de un gen, sitio de unión de una enzima, Caja TATA Terminador: Una secuencia de ADN la cual dará final a la transcripción. Sitio de Clonaje múltiple o polylinker: Segmento de ADN que contiene sitios de restricción (reconocimiento de enzimas), donde se insertara un fragmento de gen blanco o de interés. Desarrollo del medicamento en células hospederas →Vector Desarrollo del medicamento en células hospederas →Vector Ori: Secuencia particular del genoma, en el que se inicia la replicación. Marcador de selección: Secuencia génica que confiere un rasgo especifico a la célula hospedera para su selección. - Genes reporteros: Lacz →B-galactosidasa (Blanca/azul) GFP→ Proteínas verde fluorescente luc → luciferasa - Genes de resistencia a antibióticos o auxotrófico. Desarrollo del medicamento en células hospederas → Operón Segmento de ADN que se encuentra formado por ciertas secuencias génicas y cuya regulación es esencial para metabolismo procarionte. Desarrollo del medicamento en células hospederas → Operón LAC Desarrollo del medicamento en células hospederas → Operón LAC Desarrollo del medicamento en células hospederas → Operón LAC Desarrollo del medicamento en células hospederas → Operón LAC Desarrollo del medicamento en células hospederas →Selección de transformantes Desarrollo del medicamento en células hospederas →Selección de transformantes Sustrato del medio: “X-Gal” → Análogo a la lactosa (sustrato para hidrolisis). Desarrollo del medicamento en células hospederas →Selección de transformantes Sustrato del medio: “X-Gal” → Análogo a la lactosa (sustrato para hidrolisis). Desarrollo del medicamento en células hospederas →Selección de transformantes Sustrato del medio: “X-Gal” → Análogo a la lactosa (sustrato para hidrolisis). Desarrollo del medicamento en células hospederas →Selección de transformantes Desarrollo del medicamento en células hospederas →Selección de transformantes Desarrollo del medicamento en células hospederas →Selección de transformantes Desarrollo del medicamento en células hospederas → Expresión Bacterias Levaduras Plantas Células animales y de insectos Procariotas Levaduras Células de mamíferos E. coli Pichia pastoris Células CHO Ventajas -Fácil manipulación. -Crece relativamente Realizar todas las modificaciones -Crecimiento rápido. rápido. postraduccionales requeridas. -Fácil escalamiento. -Fácil escalamiento. -Medios Baratos. -Realiza algunas -Alto rendimiento. modificaciones Postraduccionales. Desventajas -Pocas -Las modificaciones -Crecimiento lento. modificaciones postraduccionales -Medios y suplementos costosos. postraduccionales. pueden diferir de las -Difícil de escalar. -Proteínas se pliegan de los humanos incorrectamente y/o (especialmente la se agregan (cuerpos glicosilación). de inclusión). Desarrollo del medicamento en células hospederas → Transfección o transformación Transfección: Introducción del material Transformación: Transferencia del material genético externo en células eucariotas. genético a bacterias y hongos Biobalistica o gen pistola Electroporación Lipofección Choque térmico Transfección o transformación → Biobalistica Método de transferencia directa de genes mediante el bombardeo de una célula con micropartículas metálicas portadoras de ADN foráneo, a velocidades supersónicas. Partículas son esféricas (0,4 a 2,0 micrómetros de diámetro) → Oro o tungsteno y se recubren con el ADN de transferencia. Micropartículas son impulsadas a gran velocidad por explosión de pólvora seca, liberación de gas comprimido a alta presión (aire, helio, CO2 o N2), o por una descarga eléctrica. ADN se integra de forma estable por recombinación al azar → Transformación estable. Transfección o transformación → Electroporación Método por el cual se usa pulsos de corriente eléctrica para abrir canales o poros en la membrana celular de forma transitoria (despolarización de la membrana), el campo eléctrico genera afinidad por el ADN. Transfección o transformación → Liposomas / Método de lipofección Liposomas (complejos de lípidos catiónicos) que contendrán el ADN, tendrán afinidad por la membrana celular, ingreso se produce por un proceso de endocitosis. Transfección o transformación → Choque térmico y uso de sales Método que Combina temperatura y cationes divalentes (Ca2+) → Aumentar la porosidad de la membrana celular, para el ingreso del plásmido. Bacterias se incuban en solución de CaCl2 sobre hielo. - El frío sirve para ralentizar el movimiento molecular de la membrana plasmática mientras que los iones Ca2+ eliminan la repulsión carga-carga entre los fosfolípidos y el ADN cargado negativamente ingresa a la célula. Células se colocan por un corto periodo de tiempo a 42°C y posteriormente a 37°C, permitiendo que las células se recuperen del choque (caldo nutritivo). Comparaciones entre métodos de transformación Técnica Ventajas Desventajas Electroporación -Mayor eficiencia de -Daños irreparables de la transformación. membrana. -Técnica rutinaria no se encuentra estandarizada. Biobalistica -No existe la necesidad de usar -Baja tasa de transformación vectores de transformación -No se puede controlar el numero especializados de copias integradas -Mutagénesis directa. -Inestabilidad o silenciamiento génico Lipofección -Sencilla -Alto costo -Mantiene la integridad de la -Integración al azar célula hospedera. -Baja toxicidad Choque térmico -Sencillo -Daños a la célula hospedera. -Bajo costos -Técnica estandarizada Producción de proteínas terapéuticas → Anticuerpos monoclonales Acm o mAc → Son proteínas de carácter recombinante o no, dependiendo de su realización. Son fabricadas en laboratorio mediante ingeniera genética o técnica de hibridomas. Reconocer un antígeno diana especifico, es utilizado para el tratamiento de tumores sólidos y hematopoyéticos, trastornos inflamatorios e infecciones. Anticuerpos monoclonales → Tipos  Tipo específico de anticuerpos monoclonales producidos mediante la tecnología de hibridomas.  "Murinos" → Cadenas que las conforman son la traducción del 100% del genoma de roedores.  Medicamentos presentan la terminación “-omab” Ejemplo: Tositumomab, Ibritumomab, etc.  Avance de en técnicas de producción de anticuerpos Monoclonal Murino → Potencial aplicación en campos terapéuticos y diagnostico.  Desventaja: -Alta inmunogenicidad y Nefrotoxicidad Anticuerpos monoclonales → Tecnología de Hibridomas Línea de mieloma Aislaron de un ratón → mutante Células esplénicas de ratón inmunizado Mezcla de células fusionados y sin fusionar Clones aislados derivados de células unicas Anticuerpos monoclonales → Tecnología de Hibridomas Anticuerpos monoclonales → Tipos Monoclonal quimérico Anticuerpos monoclonales → Tipos  Tipo de anticuerpos formado por dominios de diferentes especies →Región variable de origen murino y una región constante humana.  75% humano y 25% murino.  Medicamentos presentes en el mercado con la terminación “-ximab” Ejemplo: Infliximab, rituximab y abciximab  Potencial aplicación en campos terapéuticos Monoclonal quimérico y de diagnóstico.  Ventaja: -Inmunogenicidad moderada -Conserva especificidad y afinidad por un antígeno original Anticuerpos monoclonales → Tipos  Tipo de anticuerpos cuya zona de unión al antígeno proviene de la traducción de genes murinos, el resto de su estructura proviene de genes humanos.  90% humano y 10% murino.  Medicamentos presentes en el mercado con la terminación “-zumab” Ejemplo: bevacizumab, gemtuzumab, alemtuzumab y trastuzumab  Potencial aplicación en campos terapéuticos y de diagnóstico. Monoclonal humanizado  Ventaja: -Inmunogenicidad reducida. -Conserva especificidad y afinidad por un antígeno original. Anticuerpos monoclonales → Tipos Monoclonal humanizado Porción Humana Anticuerpos monoclonales → Tipos  Tipo de anticuerpos cuya estructura es el producto de traducciones de genes netamente humanos.  100% humano.  Medicamentos presentes en el mercado con la terminación “-umab” Ejemplo: Denosumab, Obinutuzumab, Ustekinumab, etc.  Potencial aplicación en campos terapéuticos y de diagnóstico.  Ventaja: -Mínimo riesgo de Monoclonal inmunogenicidad. humano -Mejor compatibilidad con el receptor de la medicación. Anticuerpos monoclonales → Inmunogenicidad  UNIDAD 4 INNOVACIONES BIOTECNOLÓGICAS APLICADAS A LA MEDICINA HUMANA Temario Parcial 2 Unidad 4. Innovaciones biotecnológicas aplicadas a la medicina humana 4.) Contenido 4.1 Marcadores moleculares en el diagnostico de enfermedades 4.2 Inmunogénica e inmunoensayos 4.3 Vacunas y anticuerpos terapéuticos 4.4 Biofarmacos 4.5 Enfermedades infecciosas, diagnóstico y tratamiento 4.6 Genética forense 4.7 Diagnostico prenatal Obtención de una proteína recombinante Desarrollo del medicamento Almacenamiento y biotecnológico en manipulación células hospederas Masificar la producción Formulación → Banco celular farmacéutica Producción de Purificación de proteínas terapéuticas proteínas y análisis Masificar la producción → Bancos celulares / Sistema de lotes de semilla Ventajas en la producción de biotecnológicos/biológicos → Aplicación de un sistema de lote semilla (subcultivos de células). Fuente de partida caracterizada y común para cada lote de producción → Prevenir cambios posibles de las propiedades bioquímicas y genéticas que se producen con subcultivos repetidos o de generaciones múltiples.  Bancos células primarias (BCP) / Sistema de lotes de semilla El banco de células primarias es una suspensión homogénea de células iniciales ya transformadas por el vector de expresión, almacenadas en envases individuales y en condiciones que garanticen su estabilidad genética. 1) Seleccionar la célula de mayor expresión Trabajar en ambientes controlados. 2) Tomar el cultivo en la fase logarítmica de crecimiento Mantener el custodio Preparación de un 3) Realizar una diferenciación celular del de sistema de trabajo. BCP se deberán medio (lavados). realizar los pasos Realizar estudios de 4) Adicionar crioprotectores (glicerol, estabilidad y recobrado siguientes: dimetil-sulfóxido) de semillas y bancos. 5) Distribuir en viales estériles y herméticos 6) Almacenar las alícuotas a -70 °C y -80 °C DOCUMENTADO Control de calidad a los bancos de células primarias (BCP) Pureza Microbiana. Viabilidad. Para la caracterización de los BCP se deben realizar diferentes ensayos como: Estabilidad plasmídica. Análisis de expresión de la proteína recombinante o terapéutica / Análisis de estructura (inmunogenicidad). Banco de células de trabajo (BCT) Se prepara a partir del BCP bajo condiciones definidas de cultivo. Estas células se utilizan directamente en el proceso productivo. La cantidad de viales va a depender del uso, tiempo de vida y condiciones de almacenamiento. Cada vez que se utilice un vial, este debe ser desechado, ya que los cambios de temperatura pueden afectar la estabilidad genética del banco, así como aumentar los riesgos de contaminación. Control de calidad a los bancos de células de trabajo Recomendaciones: Minimiza: -Separación de lotes -Riesgos de perdida total de los bancos en caso -Almacenar en lugares distintos de catástrofes. Preparación de bancos primarios o de reserva Conformar el Evitar o minimizar los Evitar alterar su expediente de la cepa riesgos de viabilidad, pureza e (historial / controles contaminación identidad sistemáticos) Control de calidad a los bancos de células de trabajo Mismos ARCSA Cumplimiento a controles de ensayos que a calidad FARMACOPEA los BCP Lotes se mantienen en cuarentena y se aprueban después de la revisión del expediente por parte de la Dirección de Aseguramiento de la Calidad. Después de liberados los lotes se termina el expediente del banco y se almacena. Obtención de una proteína recombinante Desarrollo del medicamento Almacenamiento y biotecnológico en manipulación células hospederas Masificar la producción Formulación → Banco celular farmacéutica Producción de Purificación de proteínas terapéuticas proteínas y análisis Producción → Proceso de fermentación Identidad propia (integración genética) Sobrevivencia y dichas características se manifiesta en su bioquímica. sean perpetuadas, se debe mantener y reproducir a través de su crecimiento. Expresión de la proteína Factores genéticos y fisiológicos Primer objetivo → Obtención de un producto de calidad a un costo de producción tan bajo como sea posible. Producción → Proceso de fermentación Amonio o sales / Suero de leche, soya o extracto Glucosa → Catabolismo de levadura → Biosíntesis donde se obtiene de novó de residuos elementos para los aminoacídicos, purinas, procesos de biosíntesis pirimidinas y vitaminas. y energía. Fuente de carbono y Fuente de energía Nitrógeno La temperatura varía en un amplio intervalo -Microorganismos psicrófilos: 0-25 °C Factor Factor pH Temperatura La velocidad de las -Microorganismos mesófilos: 25-45 °C reacciones enzimáticas depende del valor del pH y -Microorganismos termófilos: > 45 °C. varía de un microorganismo a otro. Producción → Variables a controlar en biorreactores También conocido como fermentador, es un dispositivo que alberga un sistema controlado para el crecimiento de células y tejidos. Estos llevan a cabo una conversión biológica de un sustrato debido a su actividad enzimática para la obtención de un producto de interés Producción → Variables a controlar en biorreactores (Variables) Velocidad especifica de crecimiento → Tipo de microrganismo, composición del medio, T, pH, concentración de sustrato, velocidad de agitación y aireación. Correlación entre la velocidad específica de crecimiento con respecto a la velocidad de producción del producto de interés. Manteniendo la velocidad específica de crecimiento cerca del valor óptimo para la formación del producto después de la inducción, se obtienen altos niveles de expresión de proteína. Producción → Variables a controlar en biorreactores (Variables) Efecto de la concentración de sustrato Velocidad máxima de crecimiento que depende del sustrato. Concentración del sustrato. Constante de saturación. Afinidad del microorganismo por el sustrato. Producción → Clasificación de biorreactores Tipos de fermentación Discontinua Semicontinuo Continua (Batch) (fed-batch)  Producción → Clasificación de biorreactores → BATCH Volumen constate Inicio del proceso se cargan los reactantes, el Condiciones del medio (pH, medio y los catalizadores. temperatura, la velocidad de agitación, etc.) son controladas por el operador. Permite que la reacción transcurra hasta su finalización → Retiran los productos. La células se cultivan en un recipiente con una concentración inicial, sin que esta sea alterada por nutrientes adicionales o el lavado. El proceso finaliza cuando todo el substrato es consumido por la biomasa. Forma de cultivo es simple y se utiliza extensamente tanto en el laboratorio como a escala industrial. Producción → Clasificación de biorreactores → FED - BATCH Nutrientes son alimentados al biorreactor de forma semicontinua, no existe efluente en el sistema. Adición intermitente de una solución de alimentación con una alta concentración de sustrato → Obtener elevadas concentraciones celulares y evitando la producción de compuestos secundarios Un proceso de este tipo esta restringido por la capacidad volumétrica del reactor. Mejorara la productividad de la fermentación. Producción → Clasificación de biorreactores → CONTINUA Alimentación de nutrientes y retiró de productos continuamente del tanque de agitación. (FLUJO DE ENTRADA = FLUJO DE SALIDA) Se obtiene un crecimiento celular constante. No obstante, su mantenimiento requiere de una alta inversión. De esta manera se puede utilizar para producir sustancias biológicas a condiciones óptimas y para estudios fisiológicos. Obtención de una proteína recombinante Desarrollo del medicamento Almacenamiento y biotecnológico en manipulación células hospederas Masificar la producción Formulación → Banco celular farmacéutica Producción de Purificación de proteínas terapéuticas proteínas y análisis Purificación Dependiendo del lugar de expresión se dividen en 2 grupos: Solubles e insolubles P. Insolubles son aquellas que son secretadas P. Solubles son aquellas que son en el espacio periplásmico o citoplasma secretadas al medio extracelular. celular. Cuerpos de Inclusión: Agregados insolubles de proteínas incorrectamente renaturalizadas (carecen de actividad biológica) Generalmente Generalmente más estables Observan microscópicamente → Partículas intracelulares son moléculas (como resultado oscuras con un tamaño de 0,2–0,6 mm. de mediano a de los puentes alto peso disulfuro). molecular. Purificación Electroforesis Western Inmunoensayos BLOT Identificación, cuantificación, Pureza, heterogeneidad y estabilidad Espectrometría Cromatografía de masas Purificación → Inmunoensayos → Inmuno precipitación Inmunoprecipitación → técnica en la que se usa un anticuerpo específico frente a un antígeno proteínico en una mezcla de proteínas para identificar al antígeno específico. Lisado de células especificas Purificación → Inmunoensayos → Cromatografía de afinidad Cromatografía →Posee el mismo principio que la inmunoprecipitación, excepto que el anticuerpo se encuentra fijado a una matriz o a microesferas insolubles dentro de una columna. Este método se emplea a menudo para aislar antígenos Solubles o anticuerpos específicos frente a un antígeno inmovilizado. Purificación → Inmunoensayos → ELISA Ensayo por inmuno adsorción ligado a enzimas. Técnica molecular → Detectar y cuantificar la interacción entre antígenos y anticuerpos. Principio → sistema enzimático para detectar la unión específica de un antígeno y su anticuerpo correspondiente. Secuencia en que se empleen los reactivos: ELISA directa, ELISA indirecta y ELISA sándwich. Purificación → Inmunoensayos → ELISA directa Adición de muestra con el Adición de anticuerpos ligados antígeno problema a la placa Adsorción del antígeno a la superficie del pozo a enzimas (peroxidasa o de microtitulación fosfatasa alcalina) Incubación y Lavado Visualización e Interpretación de Resultados Complejo antígeno-anticuerpo. “La intensidad del color o la absorbancia es proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra”. Lavado Adición de sustrato cromogénico (conversión del sustrato incoloro a un producto coloreado). Purificación → Inmunoensayos → ELISA directa  Purificación → Inmunoensayos → ELISA indirecta Adición de anticuerpos Adición de muestra (suero) → Adición de antígeno a los pocillos secundarios ligados a enzimas Presencia de anticuerpos de una placa de microtitulación. (peroxidasa o fosfatasa primarios alcalina) Complejo antígeno- anticuerpo. Antígeno Lavado Lavado Visualización e Interpretación de Resultados Lavado “La intensidad del color o la absorbancia es proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra”. Adición de sustrato cromogénico (conversión del sustrato incoloro a un producto coloreado) o la generación de una señal fluorescente / quimioluminiscente. Purificación → Inmunoensayos → ELISA sándwich Adición de anticuerpos de captura a Adición de anticuerpos secundarios Adición de muestra → Presencia del los pocillos de placa de ligados a enzimas (peroxidasa o antígeno. fosfatasa alcalina) microtitulación (inmovilización). Anticuerpo de detección. Lavado Lavado Complejo antígeno-anticuerpo. Visualización e Interpretación de Resultados Lavado “La intensidad del color o la absorbancia es proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra”. Adición de sustrato cromogénico (conversión del sustrato incoloro a un producto coloreado) o la generación de una señal fluorescente / quimioluminiscente. Purificación → Electroforesis de proteínas Se basa en la migración de las Biomoléculas bajo la acción de un campo eléctrico (movilidad electroforética). El tamaño del poro dependerá de la concentración Purificación → Electroforesis de proteínas Electroforesis Nativa Similitudes Electroforesis Desnaturalizante SDS-PAGE Se mantiene la conformidad nativa de Empleo dos tipos de geles: Agentes surfactante como el SDS la proteína → estudio de 1.) Gel concentrador ('stacking’) → Mayor (detergente aniónico) → Ruptura de conformación, carga y posteriores usos. porosidad interacciones hidrofóbicas 2.) Gel de separador (resolving) → Diferenciación (desnaturalización). de proteínas por su viaje con respecto a sus propiedades. Separación de las moléculas → forma, Migración de proteínas a través de un gel de Separación de las moléculas → Peso tamaño y carga poliacrilamida (resultante de la polimerización molecular. de monómeros de acrilamida y bis-acrialmida) Análisis bajo modificaciones de pH → Visualización → tinción con azul de coomassie. SDS → Carga negativamente a las Ligeramente alcalino, presentando una cadenas polipeptídicas (igual relación migración diferencial. carga/masa) Proteínas de carácter acido básicas se Proteínas desnaturalizadas desplazaran hacia el ánodo y cátodo independientes de su tamaño, viajan respectivamente hacia el ánodo. Purificación → Electroforesis de proteínas PASOS: 1. Adición de buffer a la muestra. 2. Preparación de geles. 3. Ensamblaje de la cámara de electroforesis. 4. Carga de muestras y Ladder. 5. Aplicación de corriente. eléctrica, para iniciar con la movilidad electroforética. 6. Revelado. Purificación → Electroforesis de proteínas Purificación → Western Blot El Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, es una técnica analítica usada para identificar proteínas específicas en una mezcla compleja de proteínas. Fundamento → Componentes de una mezcla proteica son separados por electroforesis en geles de poliacrilamida y se transfieren a una membrana, mediante el paso de la corriente eléctrica. Las moléculas antigénicas transferidas son identificadas por interacción con Ac específicos. Purificación → Western Blot PASOS: 1. SDS-PAGE. 2. Trasferencia hacia la membrana de nitrocelulosa. 3. Saturación o bloqueo de todos los sitios de unión de proteínas a la membrana no ocupados. 4. Incubación con la muestra de modo que ésta reaccione con el anticuerpo primario. 5. Ampliación o modulación por medio de un conjugado enzimático. 6. Revelado Purificación → Western Blot Purificación → Espectrometría de masas Permite la medición de iones derivados de moléculas. → identificación de las proteínas. Análisis de gran precisión sobre la composición de diferentes elementos químicos e isótopos atómicos, separando los núcleos atómicos en función de su relación masa-carga(m/z). Purificación → Espectrometría de masas Obtención de una proteína recombinante Desarrollo del medicamento Almacenamiento y biotecnológico en manipulación células hospederas Masificar la producción Formulación → Banco celular farmacéutica Producción de Purificación de proteínas terapéuticas proteínas y análisis Formulación Farmacéutica Proceso mediante el cual se mezclan distintas sustancias químicas (Principio activo + Excipientes) para obtener un medicamento final. Estudios de Estudios de Preformulación → formulación → dosificación → Caracterización de Factores Compatibilidad propiedades físico- característicos: con su vía de químicas, -Tamaño de la administración microbiológicas y partícula mecánicas de sus -Estructura en más Tableta →Aspecto, ingredientes. de una forma sabor, dureza y -pH y Solubilidad. desintegración. Formulación Farmacéutica → Formulación enteral Sustancia activa debe ser soluble en solución acuosa a una velocidad controlada. *Formas orales Principios activos puros Aditivos para un aporte de sabor (E420- liquidas: Sorbitol), color (E110-Amarillo Naranja S), conservantes (E211-benzoato sódico), -Jarabes viscosante (E405-alginato propilenglicolico). -Gotas Orales *Formas orales Formulación recubierta por capsulas de gelatina dura. solidas: Principios activos puros Aditivos para un aporte de sabor (E954 -Capsulas Sacarina), color (E162-betaina), conservantes -Comprimidos (E202-sorbato potásico sódico), regulador de -Granulados la acidez (E500-bicarbonato sódico) Formulación Farmacéutica → Formulación parenteral Formulaciones inyectables → Preparado estériles en solución y en menor medida en emulsión. Normalmente se administran proteínas. -Requieren de conservación bajo cadenas de frio. Líquidos se almacenan en viales, bolsas intravenosas, ampollas, cartuchos y jeringas precargadas. *Formas : Principio activo con 1.) Agua destilada apirógena. -Liquido 2.) Isotonizantes: NaCl. 3.)Antioxidante: Acido ascórbico. -Liofilizado 4.)Quelante: EDTA. 4.) Agentes de difusión: Hialuronidasa. 6.) Mejorar la solubilidad y estabilidad: Polietilenglicol 7.)Anestésico local: lidocaína Obtención de una proteína recombinante Desarrollo del medicamento Almacenamiento y biotecnológico en manipulación células hospederas Masificar la producción Formulación → Banco celular farmacéutica Producción de Purificación de proteínas terapéuticas proteínas y análisis Almacenamiento → Calidad, eficacia e inocuidad → Buena fabricación y conservación La etiqueta de cada unidad (bote, frasco, etc.) debe indicar de forma legible:  Nombre del producto.  Forma farmaceútica, dosificación y vía de administración.  Información del fabricante.  Número de lote, registro sanitario.  Fecha de elaboración y caducidad. Almacenamiento Exposición directa a la luz directa (soluciones) Congelador - 15 - 0 °C Cristales coloreados que Refrigeración 2 - 8 °C proporcionan una protección Ambiente 15 a > 35 °C ilusoria contra la luz. Temperatura Luz Aire y humedad Frascos deben encontrarse herméticamente sellados. Humedad relativa no debe de ser superior al 65%.  UNIDAD 4 INNOVACIONES BIOTECNOLÓGICAS APLICADAS A LA MEDICINA HUMANA Terapia Génica Temario Parcial 2 Unidad 4. Innovaciones biotecnológicas aplicadas a la medicina humana 4.) Contenido 4.1 Marcadores moleculares en el diagnostico de enfermedades 4.2 Inmunogénica e inmunoensayos 4.3 Vacunas y anticuerpos terapéuticos 4.4 Biofarmacos 4.5 Enfermedades infecciosas, diagnóstico y tratamiento 4.6 Genética forense 4.7 Diagnostico prenatal Definición general Conjunto de estrategias para el tratamiento de enfermedades humanas, basadas en la transferencia de material genético a un individuo. Definición específica Defecto Dotar a la Nueva congénito célula función Vehiculizar Modular la expresión secuencias de proteínas alteradas Técnica Célula Terapéutica Diana ADN o Paciente ARN humano Definición específica Técnica Vehiculizar ADN o Terapéutica secuencias ARN Célula Paciente Modular la expresión Diana humano de proteínas alteradas Defecto Dotar a la Nueva congénito célula función Técnica terapéutica que permite v