Tema 9 - Aplicaciones de la PCR en la expresión génica y detección de RNA viral PDF

Tema 9 1. RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) La RT-PCR es un tipo de PCR en la que previamente hacemos una transcripción reversa a partir del mRNA para generar un cDNA (con la retrotranscriptasa) y después con cebadores específicos amplificar a DNA por medio de una PCR “común”...

Tema 9 1. RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) La RT-PCR es un tipo de PCR en la que previamente hacemos una transcripción reversa a partir del mRNA para generar un cDNA (con la retrotranscriptasa) y después con cebadores específicos amplificar a DNA por medio de una PCR “común”. Para realizar todo esto, es necesario aislar los mRNA del tejido de interés, lo que podemos hacer de dos formas distintas. La primera sería añadiendo oligo-dT a la reacción de retrotranscripción y se unirán a todos los mensajeros, lo cual sirve para amplificar todos los mRNA que tenemos en la muestra; mientras que la segunda es añadiendo directamente un cebador específico que reconozca la secuencia del extremo 3 ́del mRNA que nos interesa, amplificando solamente el mRNA del gen de interés. Con esta técnica podemos ver dónde se expresa un gen, ya que, si nosotros cogemos el genoma y hacemos PCR nos dará señal en todos los tejidos, pero a partir del mRNA podemos saber en qué tejidos se expresa. El resultado es cualitativo porque vemos la presencia o ausencia de fragmentos pero no se sabe la cantidad de RNA que se expresa, por lo que tampoco podemos saber en qué tejidos se expresa más nuestro gen. Este tipo de PCR se puede utilizar para detección de RNA viral en muestras biológicas. Se extrae sangre y se eliminan las células por centrifugación. Después se coge el RNA y se retrotranscribe. Amplificamos con PCR y si hay banda es que había presencia viral de HIV. 1.1. RT-qPCR (quantitative reverse transcription PCR) (real-time PCR) Este sistema nos sirve para solucionar el problema del análisis cuantitativo ya que permite detectar la cantidad de DNA fabricado en cada momento por PCR. En esta técnica hacemos igual que en el anterior, mediante retrotranscripción transformamos los mRNA en DNA2c y los amplificamos por PCR. Los fragmentos amplificados se van a detectar con sondas específicas marcadas con un fluoróforo. En la bandeja del termociclador se ponen los tubos que se han retrotranscrito previamente. Conforme aumenta el producto de PCR, aumenta la cantidad de fluorescencia y esta señal es recogida por el detector pudiendo medir así cuánto se amplifica. Sin embargo, si los cebadores no son muy específicos pueden amplificar otras cosas y se obtendrá también señal. La detección se realiza generalmente mediante dos tipos de sondas que, si las añadimos en la PCR a medida que se va amplificando el DNA irá aumentado la fluorescencia. - Fluoróforos que se unen al DNA de cadena doble de forma inespecífica (SYBR Green). Ventajas: bajo precio, detecta cualquier molécula de DNA amplificada y tiene alta sensibilidad. Podemos usar la misma sonda para muchas reacciones distintas. Inconveniente: los productos inespecíficos de la PCR dan señal. - Sondas con un fluoróforo y un secuestrador (horquilla molecular y TaqMan). Las que más se usan actualmente, también emiten fluorescencia pero su emisión está oculta en determinadas condiciones por una molécula. Ventajas: solo los productos específicos dan señal y pueden analizarse varios productos en la misma reacción utilizando fluoróforos distintos. Inconvenientes: cada gen necesita una sonda específica (además de los dos cebadores) de elevado precio. 1.1.1. RT-qPCR con SYBR Green SYBR Green es un fluoróforo que emite fluorescencia cuando se une a DNA de doble cadena. Si el DNA solo tiene una cadena la fluorescencia no aparece. Conforme se va amplificando, hay más fluorescencia. 1.1.2. Detección de DNA amplificado por RT-qPCR en cada ciclo de PCR Si se detecta más producto de PCR significa que en el tubo había más cDNA y por tanto, la muestra tenía más RNA. Sabemos si la muestra tiene mayor o menor cantidad de RNA según en qué ciclo supere el umbral de fluorescencia que detecta el aparato como mínimo. Si tenemos poco RNA inicial va a costar muchos ciclos superarlo. El número de ciclos necesarios para superar el umbral recibe el nombre de Ct (Threshold Cycle o Ciclo de Umbral). Así, la muestra A tiene un Ct de 20 y la B de 28, lo que significa que en el tejido A hay más RNA que en el B. Además la RT-qPCR puede ser: - Cuantitativa relativa: se relativiza con la expresión de un gen control que tiene expresión constante. - Cuantitativa absoluta: se realiza una curva patrón con muestras de cantidades conocidas. 1.1.3. RT-qPCR con sondas tipo horquilla molecular La horquilla molecular es un tipo de sonda que va a hibridar en la secuencia que quiero amplificar y no en otra (pero no es un cebador). Se le llama horquilla porque a parte de la secuencia variable que hibrida con el gen, tiene una secuencia en 3’ y 5’ complementarias entre sí, por lo que si no se une a la diana se une consigo misma generando una horquilla. También tiene un secuestrador, Q, que cuando está cerca del fluoróforo lo inactiva, por lo que cuando la sonda está en forma libre e individual, da lugar a la horquilla y Q y F se aproximan y no hay fluorescencia. Solo habrá fluorescencia cuando la sonda se una al DNA diana, ya que F y Q estarán separados. Además, este tipo de sonda permite poner dos PCRs a la vez con dos fluoróforos de diferente color y así cuantificar el producto obtenido de cada una. Esto con SYBER Green no se puede hacer. 1.1.4. RT-qPCR con sondas tipo TaqMan Este tipo de sondas es similar pero son más cortas y, aunque no esté cerrada la molécula, el secuestrador impide que el fluoróforo exprese fluorescencia. Tanto la sonda libre como unida al DNA al principio no emitirá fluorescencia. La fluorescencia podrá ser emitida cuando en el proceso de amplificación, la polimerasa, que va copiando la cadena y que presenta actividad exonucleasa 5 ́→3 ́, rompa los enlaces de esta sonda pequeña y el grupo fluoróforo se separe del secuestrador. 1.1.5. RT-qPCR para detectar COVID-19 o SARS-CoV-2 Para la detección de COVID-19 se diseñan cebadores que vayan a hibridar en el cDNA de los genes RdRp (codifica la RNA polimerasa del virus), N (nucleocápside) y E (envoltura). Además, en algunas pruebas también se amplifica el gen humano RNaseP para ver si ha salido bien la PCR. Si este gen no se amplificara podría significar que no se ha cogido bien la muestra o que se ha ejecutado mal el experimento. Para la detección, habremos diseñado cada cebador unido a una sonda con un fluoróforo diferente. Entonces, veremos la fluorescencia obtenida y veremos cual es el Ct: si es superior a 30-35, la muestra no sería infectiva. 1.2. RT-PCR in situ Este tipo de RT-PCR nos permite ver en qué sitio, es decir, en qué células, se expresa el gen. Partimos de células o tejido fijados, los cuales permeabilizamos y tratamos con DNAsa e inhibidores de RNAsas para solo quedarnos con el ARN. Luego le añadimos los componentes de retrotranscripción: la retrotranscriptasa, dNTPs, oligo (TTTTTT…) que hibridan con las colas de adeninas del mRNA, hexanucleótidos aleatorios, etc. Cuando usamos hexanucleótidos aleatorios se incluyen todas las secuencias posibles de 6 nucleótidos y así se unen a todos los mensajeros y se retrotranscriben. Con el método de las colas de poliA solo se retrotranscriben mRNA, mientras que con el de los hexanucleótidos se retrotranscriben todos. Una vez obtenido el cDNA, añadimos los componentes típicos de la reacción de PCR, además de dUTP conjugado con dioxigenina, fluoresceína o biotina, lo que nos permitirá marcar el DNA amplificado, pues la retrotranscriptasa en algunos casos cuando encuentre una A pondrá una T y otras una U. Finalmente, detectamos los productos de PCR usando anticuerpos conjugados que se unen a la molécula con la que hayamos marcado el dUTP, aunque también se pueden usar anticuerpos conjugados con reacciones enzimáticas. Visualizaríamos al microscopio y la señal indicaría expresión génica. 2. dPCR o PCR digital Recibe el nombre de PCR digital porque, tras aislar el DNA, se puede contar, es decir, nos permitirá saber si hay o no amplificación en ese pocillo, lo cual es similar al código binario. Con este método tendremos cuantificación absoluta. Para usarlo debemos emplear una dilución adecuada para que caiga una molécula en cada pocillo. En los pocillos que no hubiera muestra no habrá amplificación, lo cual detectaremos con un lector de fluorescencia, pues habremos usado sondas TaqMan. 2.1. ddPCR o PCR droplet digital La diferencia con la anterior es que en lugar de usar una placa de pocillos, pasaremos la muestra por un capilar perpendicular a otro que contiene aceite, por lo que se generarán unas gotitas en las que se incluye el cDNA. En esas gotitas ya puede ocurrir la PCR. Se analizarán los resultados pasando la muestra por un capilar para que las gotitas vayan una detrás de otra y se usará un lector de fluorescencia. 3. RPA (recombinase polymerase amplification) PCR isotérmica Recibe este nombre porque el DNA se amplifica a temperatura constante. Para ello usamos un factor de carga que se une a la recombinasa y va a ayudarla a unirse a un cebador. Entonces ese complejo hibrida con el DNA molde por el interior de la hebra doble (formando un D-loop) y la recombinasa la abre, lo que permite que la polimerasa comience a replicar. Lo mismo ocurre con el otro cebador. Como este tipo de PCR es isotérmica, se usa en lugares en los que no disponemos de electricidad. Es útil en detección de enfermedades.