TECHNIQUES DE CHARGE VIRALE 2024.pptx

TECHNIQUES DE CHARGE VIRALE ET DE DIAGNOSTIC PRECOCE SENE Pauline Yacine LBV, Unité de biologie moléculaire Centre Hospitalier Abass NDAO RAPPEL PRINCIPES DE QUANTIFICATION TECHNIQUES CONVENTIONNELLES T...

TECHNIQUES DE CHARGE VIRALE ET DE DIAGNOSTIC PRECOCE SENE Pauline Yacine LBV, Unité de biologie moléculaire Centre Hospitalier Abass NDAO RAPPEL PRINCIPES DE QUANTIFICATION TECHNIQUES CONVENTIONNELLES TECHNIQUES POC LES CONTRAINTES POUR LA REALISATION DE LA CV  Glycoprotéines de l’enveloppe gp120 gp41 gag env LTR pol vif vpu nef LTR vpr tat tat rev rev p17 MA p24 CA p7 NC protéase RT intégrase Protéines virales Protéines virales de structure régulatrices METHODE DE QUANTIFICATION Trop PEU d’ARN VIH dans le plasma pour être détectés directement Il faut l’amplifier : c’est-à-dire l’augmenter en très… très …grande quantité ARN/ADN et amplification de l’ADN: RT qPCR Amplification suivie d’une détection ou en temps réel 5 METHODE DE QUANTIFICATION PCR Polymerase Chain Reaction METHODE DE QUANTIFICATION PCR EN Analyse PCR en TR TEMPS RÉEL Ligne de base Ct : Cycle seuil 0 1 6 1 16 21 26 31 36 1 Détection des amplicons durant l’amplification grâce à la mesure PRINCIPES DE LA QUANTIFICATION 1/2 Standard interne Virus ou ARN de concentration connue ajouté au plasma du patient Extraction et amplification simultanées dans le même tube. ====> Intérêt : contrôle de l’extraction et de l’absence d’inhibiteurs de PCR 8 PRINCIPES DE LA QUANTIFICATION 2/2 Standard externe - Virus ou ARN de concentration connue - Testé séparément comme s’il s’agissait du plasma d’un patient - La quantification est faite en comparant les signaux obtenus pour le VIH du patient et le standard 9 TECHNIQUES DISPONIBLES EN 2023 CONVENTIONNEL  Tests en série Nordiag( Arrow)/Amplix NG48 ( >20 échantillons ) Generic Charge virale VIH-2  Personnel qualifié ( Biocentric)  Résultats dans les 3 à 6 heures de temps POC:  Facilité d’installation / mobilité  Facilité d’utilisation Xpert HIV-1 VL m-pima HIV ½ VL  Robustesse Xpert HIV-1 QUAL m-pima HIV ½ Detct  Autonomie  Connectivité 10  Multifonctions  TECHNIQUES CONVENTIONNELS CAP/CTM Cobas Ampliprep /Cobas Taqman Test automatisé basé sur la RT- PCR en temps réel Cible: LTR /gag du VIH-1 20 à 10 millions de copies/ml d'ARN du VIH Vol : 1020 µl plasma 21 échantillons/run Durée : 5-6h Réactifs : +4°C 12 M2000sp/rt Abbott RealTime HIV-1 Abbott HIV-1 Real Time:Test automatisé basé sur la PCR en temps réel Cible: pol integrase du VIH-1 40 à 10 millions de copies / ml d'ARN du VIH Vol : 800 µl plasma 45 échantillons/run Durée : 5-6h Réactifs amplification: -20°C m-2000 sp/rt (Abbott) 13 BIOCENTRIC GENERIC VIH-2 CHARGE VIRALE ( Biocentric) 14  P.O.C ( Point Of Care) PRESENTATION DES POC Définition des « Point of care » Outil de diagnostic et de suivi au point de prestation de service Principales caractéristiques des POC :  Facilité d’installation / mobilité  Facilité d’utilisation  Robustesse  Autonomie  Connectivité  Multifonctions 16 POINT OF CARE: m-PIMA ( Abbott)  Système de diagnostic moléculaire utilisant la RT-PCR en temps réel  Prise d’essaie VL: 50 µl plasma , DP:25 µl sang total  Cartouches d’essai m-PIMA ™ destinées à la détection qualitative ou quantitative du Virus de l'immunodéficience humaine  Traitement d'échantillons et extraction d'acide nucléique entièrement automatisés  Amplification de cible à haute vitesse et détection multiplex  Fonctions d'exportation et d'archivage des données 17 POINT OF CARE: m-PIMA ( Abbott) 18 INTERPRETATION DES RESULTATS Pour VIH 1 M / N, VIH 1 O et VIH 2, des résultats indépendants sont donnés: 19 RESULTATS ET INTERPRETATIONS NEGATIF POSITIF INVALIDE 20 POINT OF CARE: Genexpert (CEPHEID) 21 POINT OF CARE: Genexpert (CEPHEID) 22 POINT OF CARE: Genexpert (CEPHEID) Détecte une cible - HIV-1 (Xpert VL: 5'-LTR du VIH-1 ; 40 à 10 millions de copies/ ml d'ARN du VIH) Test automatisé basé sur la PCR en Temps Réel Contrôles intégrés pour chaque échantillon individuel - Contrôle de vérification de la sonde(CVS) - Contrôle de traitement de l’échantillon ( CTE) - Adéquation du volume de l’échantillon ( AVE) Système de cartouche close réduisant au minimum le risque de contamination Accès aléatoire Résultats obtenus en environ 90 mn 23 POINT OF CARE: GeneXpert (CEPHEID)  Xpert HIV -1 Qual (EID) Preparation de l’échantillon et procedure d’analyse Type d’échantillon: Sang total Toujours utiliser les précautions de sécurité universelles! ❶ Préparer ❷ Procurez-vous ❸ Ouvrez le couvercle de la ❹ Mélanger ❺ Transférer l’échantillon et une cartouche pour cartouche. Utiliser la pipette de l'échantillon de Immédiatement 100ul de étiquetter la un test spécifique. transfert fournie (ou une pipette sang total en sang total en utilisant la bouteille de réactif Étiqueter le côté de automatique) pour transférer inversant le micropipette fournie (ou de l’échantillon la cartouche avec 750ul du SR dans la chambre tube au moins pipette automatique) dans la avec l’identité de l’ le même ID dans la d'échantillonnage de la cartouche 7-10 fois même chambre échantillon bouteille SR d'échantillon ❻ Fermez le couvercle ❽ Balayez le code- ❼ Pour commencer le ❾ Cliquez sur ❿ Jetez fermement et lancez le barres de la test, allez dans le Démarrer le test. Une correctement la test. L'échantillon doit être cartouche. Le menu système Xpert lumière verte cartouche usagée. traité dans les 30 minutes protocole et le et créez un test , et clignotera sur le Enregistrez les maximum après le module de dosage complétez les champs module. Chargez la résultats avant traitement. sont sélectionnés au besoin. cartouche dans le l'expédition. automatiquement module et fermez la Problèmes et dépannage "NE PAS LE porte. CHANGER". En cas de problème, un message s'affichera (souvent, avec un code d'erreur.) Vérifiez si l'erreur affecte un module particulier Reportez-vous au manuel de l'opérateur et recherchez le code d'erreur. Suivez les actions correctives 25 recommandées  Xpert HIV -1 Qual (EID) Préparation de l’échantillon et procedure d’analyse Type d’échantillon: Dried Blood Spot (DBS) Toujours utiliser les précautions de sécurité universelles! ❷ En utilisant les ❹ Procurez-vous une ❺ Ouvrez le couvercle de la ❶ Réglez le ❸ Placez un DBS dans la ciseaux stérilisés, cartouche pour un test cartouche. Utiliser la pipette de thermomixeur à bouteille SR et assurez-vous découpez DBS de la spécifique. Étiqueter le transfert fournie (ou une pipette 56˚C et étiquetez la qu'il est immergé dans le carte en suivant la côté de la cartouche automatique) pour transférer tout bouteille de réactif tampon. Incuber cette ligne. Si la ligne est avec le même ID dans le liquide du SR dans la chambre échantillon (SR) bouteille dans le thermomixer perforée, utilisez la bouteille SR d'échantillonnage de la cartouche. avec le code à 56 ° C à 500 tr / min échantillon une pince pour pendant 15 min. détacher le DBS ❻ Fermez le couvercle ❼Fermez la fenêtre pour ❽ Balayez le code- ❾ Cliquez sur fermement et lancez le commencer le test, allez dans le barres de la cartouche. ❿ Jetez Démarrer le test. Une test. L'échantillon doit menu du système Xpert et créez Le protocole et le correctement la lumière verte être traité dans les 30 un test, complétez les champs module de dosage sont cartouche usagée. clignotera sur le minutes maximum comme requis et lancez le test. sélectionnés Enregistrer les module. Chargez la après le traitement. L'échantillon doit être traité dans automatiquement "NE résultats avant cartouche dans le les 30 minutes maximum après PAS LE CHANGER". l'expédition. module et fermez la Problèmes et dépannage le traitement. porte. En cas de problème, un message s'affichera (souvent, avec un code d'erreur.) Vérifiez si l'erreur affecte un module particulier Reportez-vous au manuel de l'opérateur et recherchez le code d'erreur. Suivez les actions correctives 26 recommandées  Xpert HIV-1 Viral load (VL) Préparation de l’échantillon et procedure d’analyse Type d’échantillon: Plasma Toujours utiliser les précautions de sécurité universelles! ❶ Préparer au moins 1,2 ml ❷ Vortexer ❸ Procurez-vous une cartouche ❹ Pipeter au moins 1 ml de d'échantillon de plasma. Si l'échantillon pour un test spécifique. l'échantillon en utilisant la vous utilisez des échantillons équilibré pendant Étiquetez le côté de la cartouche pipette fournie. Puis vider congelés ou réfrigérés, 15 secondes. Si avec le même ID dans le flacon lentement la pipette dans la placez-les à température l'échantillon est d'échantillon. Puis ouvrez le chambre d'échantillon de la ambiante jusqu'à ce qu'ils trouble, le couvercle de la cartouche. cartouche soient complètement centrifuger pendant décongelés et équilibrés à quelques secondes température ambiante. ❺ ❼ Balayez le code- ❻ Pour commencer le ❽ Cliquez sur ❾ Jetez Fermez le couvercle barres de la test, allez dans le Démarrer le test. Une correctement la fermement et lancez le cartouche. Le menu Système Xpert lumière verte cartouche usagée. test. L'échantillon doit être protocole et le module et créez un test et clignotera sur le Enregistrer les traité dans les 4 heures de dosage sont complétez les champs module. Chargez la résultats avant maximum après sélectionnés si nécessaire. cartouche dans le l'expédition. traitement. automatiquement "NE module et fermez la Problèmes et dépannage PAS LE CHANGER". porte. En cas de problème, un message s'affichera (souvent, avec un code d'erreur.) Vérifiez si l'erreur affecte un module particulier Reportez-vous au manuel de l'opérateur et recherchez le code d'erreur. Suivez les actions correctives 27 recommandées ALGORITHME D’INTERPRÉTATION DE RÉSULTATS: Xpert QUAL 29 INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS : XPERT QUAL HIV-1 DETECTE HIV-1 NON DETECTE 30 INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS : XPERT QUAL RESULTAT INVALIDE 31 ALGORITHME D’INTERPRÉTATION DE RÉSULTATS: XPERT VL 32 INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS XPERT VL 33 INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS XPERT VL 34 INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS XPERT VL 35 TECHNIQUES DE CHARGE VIRALE: CONTRAINTES LIÉES AU PROCESSUS PRÉ- ANALYTIQUE 36 PRELEVEMENT  TUBE DE PRELEVEMENT 37 PRELEVEMENT  PRELEVEMENT INCORRECTE - PRELEVEMENT HEMOLYSÉ ( GAROT TROP SERRÉ) - PRELEVEMENT AVEC CAILLOT ( MANQUE D’HOMOGÉNÉISATION) - PRELEVEMENT INSUFFISANT 38 PRELEVEMENT  TRANSPORT DES ECHNATILLONS - DETERIORATION DU PRELEVEMENT ( ARN THERMOLABILE ) - CONTAMINATION INTER ECHANTILLON - CONTAMINATION DU PERSONNEL 39 PRELEVEMENT  PLASMA - MAUVAISE CENTRIFUGATION - CONTAMINATION INTER ECHANTILLONS - MAUVAISE CONSERVATION -ALIQUOT INSUFFISANT 40 TECHNIQUES DE CHARGE VIRALE: CONTRAINTES LIÉES AU PROCESSUS ANALYTIQUE 41 EXIGENCE TECHNIQUE  PERSONNELS - FORMATION - ELABORATION DE PROCÉDURE OU DE MODE OPERATOIRE -SUIVI ET EVALUATION ( CONTRÔLE DE QUALITÉ) EXIGENCE TECHNIQUE  ENVIRONNEMENT - CLIMATISATION -ORGANISATION DU LABORATOIRE - ELECTRICITÉ: ONDULEUR - MAINTENANCE EXIGENCE TECHNIQUE  METHODES : INHIBITION /CONTAMINATON Gants sans poudre Embouts à barriére anti-aérosol; Utiliser les embouts une seule fois! Eviter les éclaboussures durant le pipettage. Merci de votre attention