Técnicas de Amplificación de Ácidos Nucleicos.9
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Questions and Answers

¿Qué se requiere antes de realizar la RT-PCR?

  • Aislar el mRNA del tejido (correct)
  • Aislar el DNA del tejido
  • Desnaturalizar el cDNA
  • Realizar una PCR común

    • ¿Cuál es la principal diferencia entre RT-PCR y RT-qPCR?

  • RT-PCR es más rápida que RT-qPCR
  • RT-PCR no requiere retrotranscripción
  • RT-qPCR permite análisis cuantitativos (correct)
  • RT-qPCR utiliza cebadores generales

    • ¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre los cebadores en RT-PCR es cierta?

  • Se pueden utilizar oligo-dT para amplificar todos los mRNA (correct)
  • Los cebadores son siempre específicos para un solo mRNA
  • Los cebadores se añaden después de la PCR
  • Los cebadores no influyen en el resultado de la PCR

    • ¿Qué indicador se utiliza en RT-qPCR para medir la cantidad de DNA amplificado?

    <p>Una sonda específica marcada con un fluoróforo</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué técnica proporciona información sobre la presencia o ausencia de fragmentos de RNA?

    <p>RT-PCR</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el propósito de la retrotranscripción en RT-PCR?

    <p>Transformar mRNA en cDNA</p> Signup and view all the answers

    Durante la RT-PCR, ¿qué sucede si los cebadores no son específicos?

    <p>Se obtendrá señal de fragmentos no deseados</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué se puede analizar a partir del mRNA en comparación con el genoma utilizando PCR?

    <p>La expresión de un gen en tejidos específicos</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es la ventaja principal del fluoróforo SYBR Green?

    <p>Es de bajo precio y tiene alta sensibilidad.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué indica un mayor número de ciclos necesarios para superar el umbral de fluorescencia?

    <p>Menor cantidad de RNA en la muestra.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué caracteriza a las sondas con un fluoróforo y un secuestrador?

    <p>Solo emitirá fluorescencia en presencia de productos específicos.</p> Signup and view all the answers

    En la RT-qPCR cuantitativa relativa, ¿con qué se relativiza la medida?

    <p>Con la expresión de un gen control que tiene expresión constante.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué significa Ct en el contexto de la RT-qPCR?

    <p>Ciclo en el que se supera el umbral de fluorescencia.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es un inconveniente de usar SYBR Green?

    <p>Si hay productos inespecíficos de la PCR pueden dar señal.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué técnica se utiliza para la cuantificación absoluta en RT-qPCR?

    <p>Curva patrón con muestras de cantidades conocidas.</p> Signup and view all the answers

    ¿Por qué el SYBR Green no emite fluorescencia en DNA de cadena simple?

    <p>Porque no puede unirse a DNA de cadena simple.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es la principal función de la horquilla molecular en una sonda durante la RT-qPCR?

    <p>Hibridar solo con la secuencia diana</p> Signup and view all the answers

    ¿Cómo se genera fluorescencia con las sondas tipo TaqMan?

    <p>Cuando la sonda se asocia a la cadena de ADN y el secuestrador se separa</p> Signup and view all the answers

    Qué gen se amplifica para verificar la calidad de la PCR en la detección de COVID-19?

    <p>gen humano RNaseP</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el rango de Ct que indica que una muestra no es infectiva en la detección de COVID-19?

    <p>Entre 30 y 35</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué se utiliza para inactivar el fluoróforo en la horquilla molecular?

    <p>El secuestrador Q</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál de las siguientes afirmaciones es verdadera sobre la RT-PCR in situ?

    <p>Permite identificar en qué células se expresa un gen</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál de las siguientes características diferencia las sondas tipo TaqMan de las sondas tipo horquilla?

    <p>Las sondas TaqMan tienen un secuestrador que impide la fluorescencia en formación libre</p> Signup and view all the answers

    En el proceso de amplificación con sondas tipo horquilla, ¿qué ocurre cuando la sonda no hibrida con el DNA diana?

    <p>La sonda forma una horquilla</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es la función principal de los hexanucleótidos aleatorios en la retrotranscripción?

    <p>Retrotranscribir mRNA y cualquier otro tipo de RNA en la muestra.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué componente se usa para marcar el DNA amplificado en la PCR?

    <p>dUTP conjugado con un marcador fluorescente.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es la característica distintiva de la dPCR (PCR digital)?

    <p>Cuantificación absoluta mediante la contabilidad de moléculas.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cómo se genera la amplificación en la ddPCR?

    <p>Usando un capilar con aceite que forma gotas.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué ocurre en la reacción de RPA (recombinase polymerase amplification)?

    <p>Un complejo de carga ayuda a la recombinasa a unirse al cebador.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el principio de la retrotranscriptasa en la PCR?

    <p>Convierte RNA en DNA complementario (cDNA).</p> Signup and view all the answers

    El uso de sondas TaqMan en PCR digital es para:

    <p>Observar la amplificación en pocillos vacíos.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es la diferencia entre PCR y RPA?

    <p>RPA realiza la amplificación a temperatura constante, mientras que PCR requiere ciclos de temperatura.</p> Signup and view all the answers

    Study Notes

    Técnicas de Amplificación de Ácidos Nucleicos

    • RT-qPCR: Permite cuantificar la expresión génica mediante la detección de fluorescencia en cada ciclo de PCR.
      • SYBR Green: Fluoróforo que se une a DNA de doble cadena, emitiendo fluorescencia.
        • Ventajas: Bajo costo, detecta cualquier molécula de DNA amplificada, alta sensibilidad.
        • Desventajas: Los productos inespecíficos de la PCR dan señal.
      • Sondas con fluoróforo y secuestrador (Horquilla molecular y TaqMan): Emite fluorescencia solo cuando se une al producto específico.
        • Ventajas: Solo los productos específicos dan señal, se pueden analizar varios productos en la misma reacción.
        • Desventajas: Cada gen necesita una sonda específica (además de los cebadores), alto costo.
      • Ct (Ciclo de Umbral): Número de ciclos necesarios para superar un umbral de fluorescencia, indica la cantidad de RNA inicial.
      • Tipos de RT-qPCR:
        • Cuantitativa relativa: Se relaciona con la expresión de un gen control.
        • Cuantitativa absoluta: Se realiza una curva patrón con cantidades conocidas.
    • RT-PCR: Amplificación de DNA a partir de mRNA mediante transcripción reversa.
      • Procedimiento: Aislar los mRNA, realizar transcripción reversa con retrotranscriptasa, amplificar con PCR.
      • Aplicaciones: Detección de RNA viral (por ejemplo, VIH).
    • RT-PCR in situ: Permite visualizar la localización celular de la expresión génica.
      • Procedimiento: Se fija el tejido, se realiza RT-PCR con dUTP marcado, se detecta con anticuerpos.
      • Resultado: Señal que indica expresión génica en las células.
    • dPCR o PCR digital: Cuantificación absoluta del DNA mediante la detección de amplificación en cada pocillo.
    • ddPCR o PCR droplet digital: Similar a dPCR, pero se emplean gotitas para la amplificación.
    • RPA (recombinase polymerase amplification): Amplificación de DNA a temperatura constante.
      • Procedimiento: Un factor de carga facilita la unión de la recombinasa a un cebador, que hibrida con el DNA molde abriendo la doble cadena.
      • Aplicaciones: Diagnóstico rápido de enfermedades infecciosas.

    Detección del COVID-19

    • RT-qPCR: Se emplean cebadores específicos para los genes RdRp, N y E del SARS-CoV-2.
      • Interpretación: Un Ct superior a 30-35 indica una carga viral baja o nula.
    • Sondas con diferentes fluoróforos: Permiten la detección simultánea de diferentes genes.
    • RNaseP: Gen humano que se amplifica como control interno para asegurar la correcta extracción y amplificación del RNA.

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