Técnicas de Amplificación de Ácidos Nucleicos.9

Técnicas de Amplificación de Ácidos Nucleicos

• RT-qPCR: Permite cuantificar la expresión génica mediante la detección de fluorescencia en cada ciclo de PCR.
  • SYBR Green: Fluoróforo que se une a DNA de doble cadena, emitiendo fluorescencia.
    • Ventajas: Bajo costo, detecta cualquier molécula de DNA amplificada, alta sensibilidad.
    • Desventajas: Los productos inespecíficos de la PCR dan señal.
  • Sondas con fluoróforo y secuestrador (Horquilla molecular y TaqMan): Emite fluorescencia solo cuando se une al producto específico.
    • Ventajas: Solo los productos específicos dan señal, se pueden analizar varios productos en la misma reacción.
    • Desventajas: Cada gen necesita una sonda específica (además de los cebadores), alto costo.
  • Ct (Ciclo de Umbral): Número de ciclos necesarios para superar un umbral de fluorescencia, indica la cantidad de RNA inicial.
  • Tipos de RT-qPCR:
    • Cuantitativa relativa: Se relaciona con la expresión de un gen control.
    • Cuantitativa absoluta: Se realiza una curva patrón con cantidades conocidas.
• RT-PCR: Amplificación de DNA a partir de mRNA mediante transcripción reversa.
  • Procedimiento: Aislar los mRNA, realizar transcripción reversa con retrotranscriptasa, amplificar con PCR.
  • Aplicaciones: Detección de RNA viral (por ejemplo, VIH).
• RT-PCR in situ: Permite visualizar la localización celular de la expresión génica.
  • Procedimiento: Se fija el tejido, se realiza RT-PCR con dUTP marcado, se detecta con anticuerpos.
  • Resultado: Señal que indica expresión génica en las células.
• dPCR o PCR digital: Cuantificación absoluta del DNA mediante la detección de amplificación en cada pocillo.
• ddPCR o PCR droplet digital: Similar a dPCR, pero se emplean gotitas para la amplificación.
• RPA (recombinase polymerase amplification): Amplificación de DNA a temperatura constante.
  • Procedimiento: Un factor de carga facilita la unión de la recombinasa a un cebador, que hibrida con el DNA molde abriendo la doble cadena.
  • Aplicaciones: Diagnóstico rápido de enfermedades infecciosas.

Detección del COVID-19

• RT-qPCR: Se emplean cebadores específicos para los genes RdRp, N y E del SARS-CoV-2.
  • Interpretación: Un Ct superior a 30-35 indica una carga viral baja o nula.
• Sondas con diferentes fluoróforos: Permiten la detección simultánea de diferentes genes.
• RNaseP: Gen humano que se amplifica como control interno para asegurar la correcta extracción y amplificación del RNA.

Este cuestionario explora las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, centrándose en RT-qPCR. Se analizarán conceptos clave como el uso de SYBR Green y sondas moleculares, así como sus ventajas y desventajas. Ideal para estudiantes de biología molecular que desean profundizar en la cuantificación de la expresión génica.