Tema 4. Síntesis de fragmentos específicos de DNA PDF

Tema 4. Síntesis de fragmentos específicos de DNA  Tema 4. - Obtención de cDNA Síntesis de la primera cadena de un cDNA Síntesis de la segunda cadena Obtención de cDNA completos Construcción de genotecas de cDNA - Síntesis de fragmen...

Tema 4. Síntesis de fragmentos específicos de DNA  Tema 4. - Obtención de cDNA Síntesis de la primera cadena de un cDNA Síntesis de la segunda cadena Obtención de cDNA completos Construcción de genotecas de cDNA - Síntesis de fragmentos de DNA mediante PCR Síntesis de oligonucleotidos La reacción de PCR Factores básicos a considerar en la reacción de PCR Concentración de magnesio Temperatura de hibridación Características de los cebadores DNA polimerasas termoestables - Tipos de PCR PCR multiplex Nested PCR Assembly PCR PCR inversa PCR asimétrica  Tema 4. Generación de cDNA. Genotecas de cDNA Tema 9. Técnicas de Ingeniería Genética, pp. 290-294 Apartados 9.3 Síntesis de fragmentos de DNA mediante PCR Tema 5. Técnicas de Ingeniería Genética, pp. 129-170 Apartado 5.1, 5.2, 5.3,  Clonación 1. Fragmentos de restricción Tanto para la síntesis de cDNA como para la PCR, las DNA polimerasas van a necesitar CEBADORES. 2. cDNA En los dos casos, los cebadores van a ser oligonucleótidos cortos obtenidos por síntesis 3. Fragmentos de PCR química SINTESIS DE OLIGONUCLEÓTIDOS  Síntesis química de oligonucleótidos Los oligonucleótidos se han convertido en una herramienta esencial como cebadores en diferentes reacciones (PCRs, RTs…) y como sondas. ¿Qué necesitamos saber sobre su síntesis? Dado que la síntesis de oligonucleótidos es un proceso que llevan a cabo, por encargo, laboratorios especializados, nos limitaremos a entender en qué consiste el proceso.  Síntesis química de oligonucleótidos Es un proceso cíclico en el que se añade en cada uno de los ciclos un nuevo nucleótido Método desarrollado por Khorana - Se utilizan 3’ NMP - El 1º nucleótido se encuentra unido a un soporte sólido - Para evitar reactividades no deseadas todos los grupos reactivos excepto el que queremos que reacciones deben de estar bloqueados - Esto implica reacciones intermedias de bloqueo y desbloqueo Síntesis química de oligonucleótidos -se avanza en sentido 3’-5’.  Síntesis química de oligonucleótidos Se pueden añadir nucleótidos modificados con distintas finalidades VENTAJA Añadir grupos que sirvan *para detectarlos (p.e. un fluoróforo) *Para purificarlas (Cr. Afinidad)  Síntesis química de oligonucleótidos En realidad, lo que importa saber es cómo pedirlos. Síntesis química de oligonucleótidos  Síntesis enzimática de oligonucleótidos Palluk, S. et al. De novo DNA synthesis using polymerase-nucleotide conjugates. Nat. Biotechnol. 36, 645–650 (2018). DNA complementario: cDNA  cDNA Las copias de DNA de los mRNAs se denominan DNA complementarios (cDNAs). Representan una fracción del genoma: las secuencias de DNA expresadas como mRNAs. Esta fracción puede ser diferente en cada tipo de células. Las secuencias de los promotores y de intrones no codificantes no forman parte del cDNA, tendremos que buscarlos en los clones de DNA genómico. La secuencia de aminoácidos de una proteína se puede determinar directamente a partir de la secuencia de nucleótidos de su cDNA correspondiente.  Síntesis de cDNA: aislamiento del mRNA El primer paso es aislar el RNA total a partir del tipo de célula o tejido de interés. Opcionalmente se puede purificar la fracción correspondiente a los mRNA  Síntesis de cDNA: aislamiento del mRNA El procedimiento es fácil dado que el extremo 3 ’ de casi todos los mRNAs eucarióticos contiene una cadena de 50 a 250 residuos adenilato, la cola poli(A). Los mRNA se puede separar fácilmente de los rRNAs y tRNAs mediante el uso de una columna a la que las cadenas cortas de timidilato (oligo-dT) unidos a una matriz. Cuando un extracto de células se pasa a través de una columna de oligo-dT, el mRNAm poli(A) queda retenido en la columna mientras que rRNAs, tRNAs, y otras moléculas no se unen a la columna, pueden ser lavados. Los mRNAs unidos se recuperaron mediante elución con un tampón bajo en sal o agua  Síntesis de cDNA: síntesis de la primera cadena Con transcriptasa reversa (por ejemplo, de Mo-MLV- Moloney Murine Leukemia Virus- o AMV –Avian Myoblastoma Virus-). Procesividad mejorada mediante la adición de la proteína del gen 32 de fago T4. Fidelidad mejorada mediante la adición de trehalosa Oligo dT (de 12 a 18) Síntesis de cDNA: síntesis de la primera cadena  Síntesis de cDNA: síntesis de la primera cadena TTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTT CAP AAAAAAAAA.AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTT  Síntesis de cDNA: síntesis de la primera cadena ¿Se puede elegir un cebador mejor que el oligo(dT) para la síntesis de cDNAs?  Síntesis de cDNA: síntesis de la primera cadena CAP AAAAAAAAA.AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA ? ¿Qué nucleótido hay antes de la cola poli(A)?  Síntesis de cDNA: síntesis de la primera cadena CAP AAAAAAAAA.AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA CAP U CAAAAAAAAA.AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA G 3’ 5’ oligodT modificado: (A,C,G)TTTTTTTTTTTTTTTTTT  Síntesis de cDNA: síntesis de la primera cadena CAP AAAAAAAAA.AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA CAP AU UCAAAAAAAAA.AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA GC C 3’ 5’ oligodT modificado: (A,C,G,T)(A,C,G)TTTTTTTTTTTTTTTTTT Síntesis de cDNA: síntesis de la primera cadena Pediré el siguiente oligo: TTTTTTTTTTTTTTTTTTVN 5’ 3’ Síntesis de cDNA: síntesis de la primera cadena  Síntesis de cDNA: síntesis de la segunda cadena ¿Qué necesito para sintetizar la segunda cadena de DNA?  Síntesis de cDNA: síntesis de la segunda cadena ¿Qué necesito para sintetizar la segunda cadena de DNA? Conocer la secuencia del extremo 3’ de la primera cadena de cDNA para diseñar un cebador específico que permita a una DNA pol DNA dependiente sintetizar la segunda cadena utilizando como molde la primera cadena  Síntesis de cDNA: síntesis de la segunda cadena Hay varias posibilidades Una de ellas es la adición de una cola homo-oligomérica con terminal desoxynucleotidil transferasa (TdT) y un solo dNTP (por ejemplo, dGTP) en la reacción Síntesis de cDNA: síntesis de la segunda cadena  Síntesis de cDNA: síntesis de la segunda cadena Antes de ver el siguiente paso vamos a plantearnos el siguiente paso tras la síntesis de los cDNAs, que es insertar los cDNAs sintetizados en el vector de clonación (plásmidos o fago).  Síntesis de cDNA: generación de extremos cohesivos Una de las alternativas es pegar en los extremos “adaptadores” o “linkers”; pequeños fragmentos de DNA duplex que incluyen la secuencia de un sitio de restricción (los veremos en el tema 5 en las estrategias de clonación) ¿Qué pasa si un cDNA tiene secuencias de reconocimiento para EcoRI?  Síntesis de cDNA: generación de extremos cohesivos Podemos evitar su corte M-EcoRI modificando las secuencias de reconocimiento por metilación Síntesis de cDNA: variaciones Síntesis de cDNA: variaciones Podemos utilizar oligo (dT) modificado en su extremo para incluir la secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción Síntesis de cDNA: variaciones Con 5-metil citosina modificamos las bases de forma que los sitios de restricción ya no serán reconocidos Síntesis del cDNA: alternativas Eliminamos la segunda cadena con RNasaH que introduce nicks en el RNA de los híbridos DNA:RNA que pueden ser utilizados como cebadores por la DNA pol I Síntesis del cDNA: alternativas Añadimos adaptadores EcoRI en los extremos y digerimos con XhoI de forma que generamos cDNA con extremos diferente, que son más fáciles de clonar en el vector  Síntesis del cDNA “completos” Uno de los principales problemas en la síntesis de cDNAs es la baja procesividad de la transcriptasa inversa. Esto hace que muchos cDNAs estén truncados y no incluyan el extremo 5’ del gen Síntesis del cDNA “completos”  Síntesis del cDNA “completos” Podemos introducir etiquetas de biotina en el extremo 5’ de los mRNAs, a nivel del cap. Sintetizar la primera cadena y digerir con una RNasa de cadena sencilla. Los mRNAs cuya copia no haya sido completada en toda su extensión serán digeridos y perderán su marca de biotina y no se unirán a una columna de avidina, sólo lo harán los de longitud completa que habrán quedado protegidos de la digestión con la nucleasa de simple cadena  Síntesis del cDNA “completos” El marcaje se basa en la existencia de dos hidroxilos en posiciones 2’ y 3’ del anillo de ribosa en la primera base del cap  Síntesis del cDNA “completos” Pero también el último nucleótido de la cola poli(A) tiene estos dos grupos OH Al tratar con periodato sódico y biotin hidrazina los dos extremos resultan modificados  Síntesis del cDNA “completos” Pero si utilizamos un oligodT modificado que no hibride con el final de la cola poli(A) y una RNAsa de cadena sencilla, la marca de la cola poli(A) se perderá Obtención de fragmentos de DNA 1. Fragmentos de restricción 2. cDNA 3. Fragmentos de PCR LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)  PCR PCR: amplificación exponencial del molde PCR: equipamiento y material PCR: etapas  PCR: amplificación abuelas madres hijas La amplificación de hebras hijas es exponencial: 2n desde el tercer ciclo. La de madres es lineal: n.  PCR: amplificación Esta es la secuencia que vamos a obtener de la base de datos  PCR: amplificación Esta es la secuencia que vamos a obtener de la base de datos Este cebador tendrá la misma secuencia (y en el mismo sentido) que la obtenida en la base de datos  PCR: amplificación Esta es la secuencia que vamos a obtener de la base de datos Este cebador tendrá la misma secuencia (y en el mismo sentido) que la obtenida en la base de datos. Es el cebador directo o forward Este cebador tendrá la secuencia de la cadena complementaria a la presente en la base de datos y recordemos que hay que darla en dirección 5’>3’. Es decir, leyéndola de derecha a izquierda Directo (forward) GCA CAT GAA CAA ACA CCA REVERSO: GTA ATA ACT GAT ATA AAT  PCR: factores básicos Para que la reacción de PCR funcione adecuadamente hay que tener en cuenta tres factores básicos: -La concentración de Mg2+ -La temperatura de hibridación (annealing) -Los cebadores (primers) de la reacción  PCR: factores básicos Concentración de Mg2+ La concentración estándar es de 1.5 mM, pero puede variar en función del DNA a amplificar y los cebadores utilizados. Por ello, en ocasiones se requiere una optimización Temperatura de hibridación. Para determinar la temperatura de hibridación necesitamos conocer la Tm de los cebadores. Existen diversas fórmulas, la más sencilla por ejemplo Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T) La temperatura de hibridación se suele fijar CINCO grados por debajo de la Tm  PCR: factores básicos La temperatura de hibridación se suele fijar CINCO grados por debajo de la Tm  PCR: temperatura de annealing Si hay problemas, se puede recurrir al cálculo empírico con un termociclador de gradiente 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Figure 1: Experimental determination of optimal annealing temperature: The calculated primer annealing temperature was 56.5°C, the actual annealing temperature is 63.5°C. The ribosomal spacer region of mycoplasms from H9 cell cultures was amplified. Using the gradient function of the universal block, a gradient of 53 to 67°C was set. The following test parameters were selected: denaturation 10 s, annealing 15 s, elongation 20 s, Taq- Polymerase 0.75 units; duration of entire experiment: 95% >95% DNA 3’A 3’A 3’A 3’A Blunt n.a Blunt base Blunt Blunt Ends overhangs  PCR: polimerasas Taq/ Stoffel Vent VentR/ Deep UITm Ampli Tfl Tth (exo-)R Pfu Pwo Frag. Tli VentR aT Taq 5’→3’ Exonucl. Yes Yes No Yes No No No No No No Activity 3’→5’ Exonucl. No No No No No Yes Yes Yes Yes Yes Activity RT Weak Yes Weak Yes Weak No n.a. n.a n.a Weak Activity 70% Blunt; Resulting 30% Single >95% >95% DNA 3’A 3’A 3’A 3’A Blunt n.a Blunt base Blunt Blunt Ends overhangs  PCR: variaciones La elección de la polimerasa está en función de los objetivos de mi PCR Para obtener fragmentos con secuencias que pretendemos expresar (y, por lo tanto, no deben contener errores) elegiremos DNA polimerasas con alta fidelidad de copia (por ejemplo Acc Taq LA DNA pol de Sigma). Para amplificar fragmentos muy largos (hasta 30 o 40 kb) las casas comerciales ofrecen polimerasas muy procesivas (por ejemplo longAmp Taq pol de NE Biolabs) y tampones optimizados para este tipo de PCRs. También hay protocolos y polimerasas aconsejadas para amplificar DNA con alto contenidos en GCs (SuperFi II DNA pol de Thermo).  PCR “larga” Se suplementa la reacción básica de PCR (con Taq polimerasa) con una polimerasa con comprobación de lectura (Pfu pol). La función de PfuI es quitar los nucleótidos incorporados erróneamente y permitir que Taq continúe la síntesis.  Tipos de PCR Convencional (Cualitativa) PCR. Extensión de largos fragmentos Multiplex PCR. PCR anidada. PCR inversa Assembly PCR Dejaremos para la sección de Técnicas de Análisis de la expresión génica RT-PCR and qRT-PCR.  PCR inversa La PCR inversa es una variante que se utiliza identificar el sitio de inserción en el genoma de un fragmento de DNA de secuencia conocida Como no se conocen las secuencias que flanquean nuestro fragmento utilizamos oligos divergentes en lugar de convergentes. La PCR inversa es especialmente útil para la determinación de las ubicaciones de retrovirus y transposones que se integran aleatoriamente en el DNA genómico  Multiplex PCR Es un tipo especial de la PCR utilizada para amplificación o la detección de múltiples secuencias mediante el uso de múltiples parejas de cebadores cada una se dirige a una diana particular. Esto permite el análisis simultáneo de múltiples dianas (por ejemplo, de varios patógenos) en una sola muestra.  Multiplex PCR En el caso de las PCRs cuantitativas (Tema7). Podemos analizar varios productos al mismo tiempo utilizando sondas específicas para cada uno de los productos marcadas con fluoróforos distintos  Nested PCR Lo podíamos traducir como “PCR anidada”: Se utiliza para aumentar la sensibilidad y especificidad de la amplificación del DNA. -Se utilizan dos conjuntos de cebadores en dos reacciones sucesivas. -En la primera PCR, se usa un par de cebadores para generar productos de DNA, que serán el objetivo de la segunda reacción. -En la segunda PCR se utiliza uno (“hemi-nesting”) o dos cebadores (“nested”) diferentes cuyos sitios de unión se encuentran “anidados” dentro del primer producto, aumentando así la especificidad. Usos: Es utilizada para la detección de patógenos que se encuentran en muy poca cantidad. Nested PCR Nested PCR  Assembly PCR Otra modalidad, utilizada en los primeros pasos de la síntesis de genomas SINTÉTICOS, se empieza por colecciones de oligos parcialmente solapantes. En una primera reacción de PCR los cebadores se extienden y los fragmentos quedan unidos, aunque incluyen una serie de “gaps”. En una segunda reacción se utiliza una pareja de oligos que hibridan con los extremos del producto formado, para obtener el fragmento completo.  Genómica sintética El principio de la PCR de ensamblaje se basa en que los productos de cada ciclo pueden actuar como cebadores en ciclos posteriores, dando productos cada vez más largo. Al final, habrán productos que cubran toda la extensión, desde el primero hasta el último de los cebadores solapantes iniciales y estos son los que se amplifican en una segunda PCR con la pareja de oligos de los extremos Si (1) hibrida con (2) (1) En el siguiente ciclo se formará (2) Amplificación isotérmica de ácidos nucleicos  Amplificación isotérmica de ácidos nucleicos Por definición, las amplificaciones isotérmicas deben ocurrir a una temperatura más o menos constante. Según el procedimiento, la amplificación puede ser lineal o exponencial. Así, en la amplificación de círculo rodante (RCA), una secuencia diana se amplifica continuamente a partir de su molde de una forma LINEAL Para conseguir amplificaciones isotermas exponenciales las copias generadas deben, a su vez, convertirse en moldes. Sin embargo, a diferencia de la PCR, muchas de las amplificaciones isotermas exponenciales no generan estrictamente dos copias por etapa de iniciación/elongación de la polimerasa. El motivo es que en muchos procedimientos de amplificación isoterma se generan tipos de moléculas diferentes (RNA, ssDNA, dsDNA, heroduplex, etc) según la etapa del proceso.  Amplificación isotérmica de ácidos nucleicos Existen muchos procedimientos de amplificación que permiten la amplificación exponencial. - El 3SR “Self-sustained sequence replication” utiliza la transcripción dependiente de la RNA polimerasa del fago T7 y la RNasaH para permitir en cada ronda la hibridación de los cebadores - El SDA “strand displacement amplification” genera extremos 3’ mediante el uso de una nickasa. que pueden se extendidos por una DNA polimerasa - El LAMP “Loop-mediated AMPlification” se basa en la reasociación de las cadenas (autocebado) que implica la formación horquillas mediante el plegamiento del producto recién generado. Son procedimientos complejos. Su finalidad es la detección, generando una gran cantidad de producto que puede ser detectado de forma sencilla, por ejemplo, espectrofotométicamente. Vamos a ver con detalle un procedimiento basado en TRANSCRIPCIÓN y en un video un procedimiento basado en el DESPLAZAMIENTO DE CADENAS Self Sustained Sequence Replicarion (3SR)  Self Sustained Sequence Replicarion (3SR) Muchas metodologías de amplificación están basadas en la transcripción. Implican el uso de promotores que son reconocidos por polimerasas, es lo que se llama “origen de amplificación” (oriA). El más utilizado es el promotor de la polimerasa del fago T7, bien caracterizado y cuya polimerasa está disponible comercialmente En estos procedimientos se diseñan cebadores que tienen la secuencia promotora fusionada en 5’ a la región específica que hibrida con el molde. Región complementaria al molde Secuencia promotora para la T7 pol  Self Sustained Sequence Replicarion (3SR) Vamos a amplificar un RNA (por ejemplo, un virus de RNA como el coronavirus) En la reacción hay que añadir los siguientes enzimas: -Transcriptasa reversa -RNA pol del fago T7 -RNasa H Self Sustained Sequence Replicarion (3SR) Este enfoque es el que utiliza el método 3SR “Self- sustained sequence replication” Se parte de un RNA como molde. En un proceso similar a la síntesis de cDNA. Primero se retrotranscribe (síntesis primera cadena) y luego se sintetiza la segunda cadena para añadir dos secuencias promotoras de la T7 en los extremos del producto (en círculos) Cuando actúa la RT se genera un híbrido (RNA/cDNA- heteroduplex). En una reacción “tipo PCR” para la síntesis de la segunda cadena (con una DNA pol) habría que desnaturalizar para que pudiera unirse el cebador. Para evitar cambios de temperatura el procedimiento utiliza la RNasea H (cuadrado rojo).  Self Sustained Sequence Replicarion (3SR) El producto es un dsDNA simétrico (cuadrado azul) que se transcribe mediante la T7 pol para producir dos cadenas de RNA (1 y 2) (1) (2) Self Sustained Sequence Replicarion (3SR) Ambas cadenas de RNA se convierten en moldes para la transcripción reversa. La digestión con RNasa H y síntesis de la segunda cadena con DNA pol da como resultado la acumulación exponencial del producto dsDNA simétrico central. Amplificación isotérmica de ácidos nucleicos: LAMP Amplificación isotérmica de ácidos nucleicos