Tema 4

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Questions and Answers

¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre la síntesis química de oligonucleótidos es incorrecta?

Los nucleótidos se añaden en sentido 5'-3'. (correct)

El primer nucleótido se une a un soporte sólido.

Se realizan reacciones intermedias de bloqueo y desbloqueo.

Se añaden nucleótidos en cada ciclo del proceso.

¿Cuál de las siguientes opciones NO es un factor básico a considerar en una reacción de PCR?

Concentración de dNTPs (correct)

Características de los cebadores

DNA polimerasas termoestables

Temperatura de hibridación

En la generación de cDNA, ¿qué etapa sigue a la síntesis de la primera cadena?

Síntesis de la segunda cadena (correct)

Clonación de fragmentos de cDNA

Obtención de cDNA completos

Construcción de genotecas de cDNA

¿Qué tipo de PCR se caracteriza por utilizar múltiples cebadores en una sola reacción?

PCR multiplex Signup and view all the answers

¿Cuál es el método de síntesis de oligonucleótidos que fue desarrollado por Khorana?

Síntesis química de oligonucleótidos Signup and view all the answers

¿Cuál es la principal ventaja de la PCR anidada en comparación con la PCR convencional?

Aumenta la sensibilidad y especificidad de la amplificación del DNA. Signup and view all the answers

En la PCR de ensamblaje, ¿qué ocurre durante la segunda reacción?

Se hibridan oligos que completan los fragmentos generados anteriormente. Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos es correcta?

Suele realizarse a temperaturas constantes. Signup and view all the answers

¿Qué método se utiliza para la detección de patógenos en cantidades mínimas?

PCR anidada. Signup and view all the answers

¿Cuál es el principio detrás de la PCR multiplex?

Analizar varios productos de amplificación simultáneamente con sondas específicas. Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito principal de usar oligodT en la síntesis de cDNA?

Iniciar la síntesis de cDNA a partir de ARN mensajero Signup and view all the answers

¿Qué nucleótido está presente antes de la cola poli(A) en la secuencia de ADN?

Uracilo Signup and view all the answers

Durante la síntesis de cDNA, ¿qué tipo de oligodT se menciona como modificado?

(A,C,G,T)(A,C,G)TTTTTTTTTTTTTTTT Signup and view all the answers

¿Qué se necesita para sintetizar la segunda cadena de DNA?

Cebadores específicos y nucleótidos Signup and view all the answers

¿Qué representa la secuencia oligodT modificada: (A,C,G,T)(A,C,G)TTTTTTTTTTTTTTTTTT?

Un cebador que permite la unión a múltiples secuencias Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre la síntesis del cDNA es correcta?

La síntesis de cDNA se inicia con la hibridación del cebador. Signup and view all the answers

¿Por qué es importante la modificación del cebador oligodT?

Para permitir la unión a diferentes tipos de RNA Signup and view all the answers

Cuál es la principal característica de las polimerasas de alta fidelidad utilizadas en PCR?

Generan fragmentos con alta precisión en la secuencia Signup and view all the answers

Qué tipo de PCR es especialmente útil para identificar el sitio de inserción de un fragmento de DNA en el genoma?

PCR inversa Signup and view all the answers

Cuál es el propósito de usar oligos divergentes en PCR inversa?

Identificar secuencias flanqueantes desconocidas Signup and view all the answers

Cuál es una ventaja de la PCR múltiple?

Detecta secuencias múltiples en una sola reacción Signup and view all the answers

Las polimerasas que permiten la amplificación de fragmentos muy largos generalmente requieren:

Tampones optimizados Signup and view all the answers

Cómo se denomina el procedimiento que combina la Taq polimerasa con una polimerasa de comprobación de lectura?

PCR larga Signup and view all the answers

Qué tipo de PCR se utiliza para amplificar o detectar múltiples secuencias específicas simultáneamente?

Multiplex PCR Signup and view all the answers

Qué función tiene la polimerasa Pfu en la PCR larga?

Corrige errores en los nucleótidos incorporados Signup and view all the answers

Qué tipo de PCR utiliza múltiples amplificaciones utilizando diferentes cebadores para amplificar varias secuencias?

PCR multiplex Signup and view all the answers

Study Notes

Obtención de cDNA

Para la síntesis de cDNA y PCR, se necesitan cebadores que son oligonucleótidos cortos.
Los cebadores se obtienen por síntesis química.

Síntesis química de oligonucleótidos

La síntesis química de oligonucleótidos es un proceso cíclico en el que se añade un nuevo nucleótido en cada ciclo.
Se utiliza el método desarrollado por Khorana.
Se utilizan 3’ NMP.
El primer nucleótido se une a un soporte sólido.
Los grupos reactivos, excepto el que se desea que reaccione, se bloquean para evitar reacciones indeseadas.
Se requiere una reacción intermedia de bloqueo y desbloqueo.
El proceso avanza en sentido 3’-5’.
La fidelidad se mejora mediante la adición de trehalosa.
Se utiliza oligo dT (12-18).
La síntesis de la primera cadena de cDNA se inicia con un cebador oligo dT.
Se pueden utilizar cebadores modificados para optimizar la síntesis de cDNA.
El cebador oligo dT modificado se puede utilizar para la síntesis de cDNA.

Síntesis de la segunda cadena de cDNA

Se necesita una enzima con actividad de exonucleasa 3’→5’ para sintetizar la segunda cadena de cDNA.
Se requiere una enzima que pueda digerir el ARN:RNasa H.
Se requiere una DNA polimerasa con actividad de exonucleasa 3’→5’ para sintetizar la segunda cadena de cDNA.

PCR: Variaciones

La elección de la DNA polimerasa depende de los objetivos de la PCR.
Se utilizan DNA polimerasas de alta fidelidad para obtener fragmentos de secuencias que se pretende expresar.
Se utilizan DNA polimerasas muy procesivas para la amplificación de fragmentos largos (>30kb).
Existen protocolos y polimerasas optimizados para la amplificación de DNA con alto contenido en GC.
La PCR “larga” se complementa con una polimerasa con comprobación de lectura.

Tipos de PCR

Los tipos de PCR más comunes son: la PCR convencional (cualitativa), la PCR multiplex, la Nested PCR, la PCR inversa, la PCR asimétrica y la Assembly PCR.
Se utilizan cebadores específicos para cada diana.
La PCR multiplex permite analizar simultáneamente varias dianas.

Nested PCR

Utilizada también como PCR anidada.
Aumenta la sensibilidad y especificidad de la amplificación del DNA.
Utiliza dos conjuntos de cebadores en dos reacciones sucesivas.
Se utiliza para la detección de patógenos que se encuentran en muy poca cantidad.

Assembly PCR

Se utiliza para la síntesis de genomas sintéticos.
Se empieza con colecciones de oligos parcialmente solapantes.
Se utilizan oligos que hibridan con los extremos del producto formado para obtener el fragmento completo.
El principio de la PCR de ensamblaje se basa en que los productos de cada ciclo pueden actuar como cebadores en ciclos posteriores, dando productos cada vez más largos.

Amplificación isotérmica de ácidos nucleicos

Las amplificaciones isotérmicas deben ocurrir a una temperatura más o menos constante.
La amplificación puede ser lineal o exponencial.

Self Sustained Sequence Replication (3SR)

Se utiliza para ampliar un RNA.
Se necesita transcriptasa reversa, RNA pol del fago T7 y RNasa H.
Se parte de un RNA como molde.
El procedimiento es similar a la síntesis de cDNA.
Primero se retrotranscribe y luego se sintetiza la segunda cadena.
Se añaden dos secuencias promotoras de la T7 en los extremos del producto.
Se genera un híbrido (RNA/cDNA-heteroduplex).
Se utiliza RNasa H para evitar cambios de temperatura.
El producto final es un dsDNA simétrico.
Amba cadenas de RNA se convierten en moldes para la transcripción reversa.
Se obtiene la acumulación exponencial del producto dsDNA simétrico.

Amplificación isotérmica de ácidos nucleicos: LAMP

Es una técnica de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos.

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Description

Este cuestionario explora el proceso de síntesis de cDNA y la química de oligonucleótidos. Aprenderás sobre los cebadores utilizados, los métodos de síntesis y las consideraciones técnicas para optimizar la reacción. Ideal para estudiantes de biología molecular que buscan profundizar en estos temas.