Tema 3. Laboratorio de Microbiología en Patología Infecciosa (1) PDF

INFECCIOSA E INMUNOLOGÍA 2023/24 APUNTANDO GALLINAS 🐔❤️‍🔥 1. RESPONSABILIDADES DEL CLÍNICO a. Conocer la batería de pruebas que los microbiólogos ofrecen, ya que en la hoja de petición vienen mencionadas las distintas pruebas (mucha...

INFECCIOSA E INMUNOLOGÍA 2023/24 APUNTANDO GALLINAS 🐔❤️‍🔥 1. RESPONSABILIDADES DEL CLÍNICO a. Conocer la batería de pruebas que los microbiólogos ofrecen, ya que en la hoja de petición vienen mencionadas las distintas pruebas (muchas veces en siglas, los nombres de bacterias). También debemos conocer cómo son las pautas de recolección (útiles para recogerlas) y transporte de muestras; es decir como son los métodos de obtención de muestras, que viales o útiles se deben usar para hacer una toma correcta y, sobre todo, saber cómo se tienen que solicitar esas muestras. Se puede tomar una muestra perfecta pero si esta no se almacena en la nevera (se deposita encima durante 3 días), se pierde. Hay algunas que se pueden filtrar, otras se pueden retirar… b. Colaborar en la visualización de las mismas en la historia clínica electrónica y en la implantación y mantenimiento de sistemas de apoyo a la decisión clínica en relación con las pruebas de laboratorio. c. Notificar al laboratorio cuando se busca un microorganismo específico o concreto (prueba especial). d. Priorizar las solicitudes cuando solo se pueda recoger una cantidad limitada de muestras o si son escasas. Por ejemplo, hay que indicar si preferimos una tinción o un cultivo de un microorganismo concreto. En casos de espondilodiscitis, la mejor forma de curarlo es saber el microorganismo causante para lo cual se necesita una muestra obtenida generalmente a nivel quirúrgico e. Lo más sensato es establecer una comunicación abierta siempre con el laboratorio, orientar acerca de lo que se debe hacer, indicar cómo se puede hacer tal o tal cosa. f. Alertar al laboratorio cuando se sospeche de alta contagiosidad en la manipulación de la muestra. 2. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO El diagnóstico microbiológico tiene dos vertientes: ➔ DIRECTO: nos permite obtener resultados rápidos, nos da mayor seguridad y es la que más se ha desarrollado en los últimos años. Detectamos antígenos y nos ayuda a detectar el agente causal, buscando la bacteria, el virus o el parásito en la muestra, ya sea: - Visualización: macroscópica (pus, color herrumbroso, aspecto verdoso) o, lo más común microscópica (si tiene características especiales, tonicidad especial, ser maloliente...) - Se puede cultivar, hacer crecer e identificar la especie. Se puede incluso hacer un estudio de sensibilidad para los antimicrobianos. IMP: Sólo lo permite el cultivo, y en la época en la que estamos es primordial saber la sensibilidad. Los virus no se suelen cultivar en laboratorios de rutina. - Detección de sus componentes estructurales y/o metabolitos microbianos: un trozo de su genoma, un producto metabólico (algo muy característico), detección de antígenos, de ácidos nucleicos. 1 INFECCIOSA E INMUNOLOGÍA 2023/24 APUNTANDO GALLINAS 🐔❤️‍🔥 ➔ INDIRECTO: se detecta la respuesta específica del hospedador frente al agente causal o patógeno infeccioso ya que este no se ve, no crece, no deja ningún rastro por medio de alguna porción de su estructura o de un metabolito microbiano. Es un diagnóstico serológico (anticuerpos). 2.1. TOMA DE MUESTRAS Esto no lo dio. Pero lo dejo para que lo leáis. - La indicación clínica ha de ser clara. - La muestra tiene que ser representativa del lugar de la infección. - Menor contaminación posible - Saber el volumen y el número de muestras que necesitamos. - Hay muestras que con un título nos apañamos y otras en las que es necesario mucho más. - A veces no es suficiente una muestra para poder hacer la evaluación, sino varias e incluso otras durante varios días diferentes o incluso en el mismo día. - Momento adecuado de toma de muestra, ya que depende de la evolución natural de la enfermedad y hay que tomarla antes del tratamiento antimicrobiano. - Utilizar la técnica adecuada, depende de la localización. No invasivas: frotis de esputo o toma de muestra oral o faríngea. No se rompe ninguna barrera física o mucosa. Invasivas. La más característica es el hemocultivo, en la cual rompemos la pared de la vena para llegar a sangre y obtener la muestra con el objeto de confirmar si hay infección. - Enviarla rápidamente al laboratorio y, en caso de que el laboratorio no se encuentre en el hospital, debemos conservarlas usando medios de mantenimiento, los cuales no permiten un crecimiento excesivo ni tampoco la muerte del microorganismo. 2.2. TIPO DE MUESTRAS REPRESENTATIVAS Lo dio todo muy por encima. Prácticamente nombró cada muestra. OJO: La obtención de una u otra muestra depende del diagnóstico clínico presuntivo. SANGRE: es una de las muestras más representativas. ➔ Para cultivo (hemocultivo): En dos o tres tomas separadas en media hora al menos hasta una hora. Importante el volumen y número de muestras (normalmente entre 10-20ml para repartir, depende del modelo que se tenga). ➔ Para examen microscópico. ORINA: ➔ Normalmente por emisión espontánea. Tenemos que informar de la técnica de recogida para impedir la contaminación. ➔ En el caso de una mujer, tener en cuenta que no vale la pena lavar, sino simplemente separar los labios mayores para evitar contaminación, ya que la uretra distal siempre está colonizada. Lo que hay que hacer es desechar el principio del chorro y también el final y nos quedamos con 3-4 ml de la parte media del chorro. ➔ No vale la pena sondar al paciente para obtener una muestra, pero si el sujeto está sondado, se puede obtener por punción iatrogénica, teniendo en cuenta que también hay que desechar el principio y el final. ➔ Aspirado suprapúbico. La muestra es más clara, pero hace poco ya que es una técnica muy agresiva, 2 INFECCIOSA E INMUNOLOGÍA 2023/24 APUNTANDO GALLINAS 🐔❤️‍🔥 por medio de punción-aspiración. Nos permite incluso el cultivo. HECES: Normalmente vienen en contenedores estériles y es común que estén en malas condiciones. Casi siempre vienen en recipientes con una sustancia fijadora que inactiva los parásitos, elimina parte del mal olor y permite conservar la muestra. EL RESTO DE MUESTRAS NO LAS HA NOMBRADO OTROS LÍQUIDOS ORGÁNICOS: distintos de sangre y orina: pleural, pericárdico, peritoneal… Se extraen aproximadamente 5ml si se puede y es conveniente ponerlos en caldos de cultivo. Hay un líquido delicado que es el LCR, cuya obtención es difícil, ya que es necesaria una cantidad adecuada y que exista una presión intramedular adecuada (evitando que se altere). Este líquido se procesa de forma diferente, ya que no se va a introducir en un líquido de cultivo sino que se va a procesar de formas diferentes según el patógeno que sospechamos (N. meningitidis, S.pneumoniae) ABSCESOS O FÍSTULAS: ➔ Los abscesos abiertos seguro que están contaminados, mientras que los cerrados se esterilizan con alcohol (absceso aséptico) y se puncionan con una jeringa para obtener la muestra. Sobre todo, debemos puncionar los márgenes externos del absceso, puesto que es donde encontramos una mayor cantidad de bacterias. ➔ Un absceso o una fístula en realidad no vale la pena pincharlos porque es muy difícil que no salga contaminada la muestra. 3. DIAGNÓSTICO DIRECTO El diagnóstico directo se basa en: 1. Diagnóstico directo macroscópico 2. Diagnóstico directo microscópico. 3. Cultivo, crecimiento e identificación 4. Detección de componentes estructurales y metabolitos microbianos. a. Detección de antígenos (látex, coaglutinación, CIE, ELISA, RIA, IFD) b. Técnicas de identificación de ácidos nucleicos. c. Detección de metabolitos microbianos. 3.1 EXAMEN DIRECTO MICROSCÓPICO ➔ Preparación en fresco y tinciones de contraste: en fresco, KOH, tinta china, yodo de lugol, azul de metileno. ➔ Tinciones diferenciales (son las que más se utilizan) - Tinción de Gram: bacilos Gram +, bacilos Gram -, cocos Gram +. Ej: cocos gram – en exudado uretral con conducta distraída en las últimas semanas (N. gonorrhoeae); o bien, un paciente con esputo con cocos gram + (Staphylococcus o Streptococcus). Con esto es suficiente ya para iniciar tratamiento antibiótico. - Tinción de Ziehl-Nielsen: es suficiente para poner tto antimicrobiano contra M.tuberculosis. 3 INFECCIOSA E INMUNOLOGÍA 2023/24 APUNTANDO GALLINAS 🐔❤️‍🔥 - Tinción de Giemsa: se usa para parásitos y para ver elementos microbianos. No es una tinción diferencial como tal. ➔ Tinciones fluorescentes: se usa un microscopio fluorescente de luz verde para visualizarlas. Se tiñe la bacteria y se la hace brillar. Ej: auramina-rodamina. 3.2 DETECCIÓN DE COMPONENTES ESTRUCTURALES Y METABOLITOS MICROBIANOS Lo dio por sabido de la micro de 2º. Muy por encima Destacamos: - Detección de antígenos (látex, aglutinación, CIE; ELISA, RIA, IFD). - También técnicas de identificación de ácidos nucleicos. - Detección de metabolitos microbianos. Las técnicas utilizadas son: - Aglutinaciones látex y otras (conglutinación), para ver por ejemplo una faringoamigdalitis. - Contrainmunoelectroforesis: se coloca un anticuerpo en cada pocillo y ante la presencia de corriente eléctrica se van a desplazar según su polaridad. - Inmunocromatografía. Se usa mucho en el embarazo, en el test de antígenos del SARS-CoV-2. Son técnicas donde se pone la muestra en cuestión en un sitio, por capilaridad se mueve a lo largo de toda la columna (de papel rugoso) y van a salir una o dos rayitas o una letra en el caso de que sea positivo. En la primera línea hay Ac específicos contra el microorganismo, en la segunda línea hay un anti-Ac, se llama línea control. Si se ven 2 rayas el test es positivo. Para comprobar si se ha realizado bien el test, tiene que aparecer la línea control. Ya es bastante más barato. Tiene una sensibilidad moderada y presenta varias ventajas: - Sencillez de ejecución - Manejo a temperatura ambiente - No necesita aparataje - Rápido (10-15 minutos) - Viene en diferentes formatos: dipstick, tiras, tarjetas, cassette. - Enzimoinmunoanálisis: al anticuerpo se le pone encima el antígeno y después el anticuerpo especifico. También se ha popularizado mucho el ELISA que son pocillos con Ac específicos fijados y echamos el Ag de estudio, vamos haciendo lavados y si hay unión, vamos a poner otro Ac específico marcado también para ese Ag por una enzima que hace una determinada fluorescencia. En la inmunofluorescencia, se marca el anticuerpo específico que se une al antígeno del microorganismo y nos permite ver la bacteria. - Inmunofluorescencia directa. Consta de Ac específicos marcados con fluorescente que si se une al Ag se produce la reacción de inmunofluorescencia. Esta prueba se puede realizar para virus, bacterias, … 4 INFECCIOSA E INMUNOLOGÍA 2023/24 APUNTANDO GALLINAS 🐔❤️‍🔥 4. NUEVAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO Ha dado todo muy por encima. Dice que en otra clase nos lo explicarán mejor. 4.1 PCR El fundamento principal de la PCR consiste en: - Extracción de los ácidos nucleicos. El procedimiento general consiste en 3 etapas consecutivas: disgregación de las células (lisis celular), inactivación de las nucleasas intracelulares y separación de los ácidos nucleicos. - Amplificación de los ácidos nucleicos. Para ello necesitamos una enzima (transcriptasa inversa) que sintetiza el DNA a partir del ARN del virus. Luego, se producirán millones de copias de un fragmento determinado de ese DNA en cada ciclo de amplificación, gracias a un sistema de detección incorporado mediante sondas específicas marcadas con fluorocromos. Recuerdo: RT-PCR, tienen el mismo fundamento, pero entre medias existe una retrotranscripción. Es importante conocer bien la estructura y el genoma del virus porque en función de ello coma se van a desarrollar los primer o iniciadores moleculares. Son una secuencia de oligonucleótidos escritos siempre en la dirección 5´ →3´, que marcan las extremidades de las secuencias de ADN, es el proceso más crítico para que la PCR tenga éxito. 4. 2 MALDI-TOF IMP Es una técnica usada mucho en el hospital y, desde hace poco, en urgencias. Se basa en la espectrometría de masas mediante ionización suave, realiza un análisis de las proteínas que componen cada patógeno (detección de proteómica). Se utiliza comparando con una base de datos y nos da un % de similitud. Características: - Coste muy bajo (1,43 euros). - Buena concordancia con los métodos convencionales: elevada sensibilidad y especificidad. - Se puede realizar el análisis sobre las propias colonias, tanto las crecidas en medio de cultivo sólido como las crecidas en material clínico (no necesita amplificación previa de la diana). - Disminución radical en el tiempo de respuesta: desde unos minutos a 2h. Cuando está depositada la colonia y se ha dejado en la matriz, se da un pulso de láser que hace que dentro del tubo de vacío asciendan las partículas, lleguen a un detector y aquellas que tienen un mayor peso molecular llegarán después que las de menor peso molecular. Se crea una especie de espectro y se compara con el espectro que tiene la base de datos, la cual es muy amplia, lo que nos permitirá detectar bacterias/levaduras/hongos, excepto los virus. A parte de la identificación, puede ser muy útil para detectar resistencias bacterianas y utilizada de forma habitual en los hospitales, nos permite ver las curvas de Kaplan-Meier 🡪 Sus ventajas son: la disminución de la mortalidad en procesos infecciosos y la disminución del tiempo de administración del tratamiento correcto. 5 INFECCIOSA E INMUNOLOGÍA 2023/24 APUNTANDO GALLINAS 🐔❤️‍🔥 5. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO INDIRECTO Muy por encima (como todo el tema) Está basado en el reconocimiento de las respuestas específicas que desarrolla el organismo frente a la invasión de un tipo de huésped determinado. Usaremos sobre todo técnicas inmunológicas o, más bien, inmuno-serológicas. También tenemos en cuenta que no sólo se emplea para el diagnóstico, sino que muchas otras veces también se utiliza para el estudio de las situaciones epidemiológicas de una determinada enfermedad (como por ejemplo, la tuberculosis). Los métodos de diagnóstico indirecto se han visto muy beneficiados por los desarrollos recientes en el campo de la inmunología: - El uso de anticuerpos monoclonales. - La aparición de microtécnicas. - Técnicas rápidas. - Automatización, que aporta una mayor seguridad y comodidad. 5.1 INTERPRETACIÓN La aparición de las Ig es muy variable, no todas aparecen al mismo tiempo ni con la misma velocidad. Mientras que la IgM aparece en fases tempranas de la infección y nos permite diagnosticar una situación aguda, las IgG son signo de seroconversión (casi en el proceso de sanación de la enfermedad). Por esta razón siempre se suelen hacer dos estudios inmunológicos: uno durante la mayor actividad de la enfermedad y otra durante el periodo de convalecencia; muchas veces el diagnóstico serológico se hace a posterior. 6