Bioquímica Grado en Biología 2024-2025 (PDF)

Bioquímica Grado en Biología, curso 2024-2025 José María Pérez Freije Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, 4.15 Tel. 985 10 6281 [email protected] http://degradome.uniovi.es/jmpf/ 1...

Bioquímica Grado en Biología, curso 2024-2025 José María Pérez Freije Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, 4.15 Tel. 985 10 6281 [email protected] http://degradome.uniovi.es/jmpf/ 1 2 1 “Las viejas barreras que separaban las ciencias de la vida se están desmoronando y la Bioquímica se está convirtiendo, cada vez más, en su lenguaje común” Murray, R.K., en Harper's Biochemistry, 25th Ed (2000). 3 BIOQUÍMICA OBJETIVO DE LA ASIGNATURA Conocimiento básico de: – la estructura, – la organización y – la función de la materia viva en términos moleculares 4 2  PROGRAMA DE LA ASIGNATURA 1.‐ Estructura y función de las proteínas. 2.‐ Las proteínas fibrosas. El colágeno. 1 3.‐ 4.‐ Las proteínas globulares. La mioglobina y la hemoglobina. Los enzimas y la regulación de la actividad enzimática. 5.‐ Las membranas biológicas. 20 h CE, 4 h PA, 1h TG 13.‐ Estructura del DNA. Organización del material genético. 14.‐ Replicación del DNA. 15.‐ Los ácidos ribonucleicos. La transcripción. 2 16.‐ Regulación de la transcripción. 17.‐ La síntesis de proteínas. 18.‐ Tecnología del DNA recombinante. 20 h CE, 4 h PA, 1h TG 6.‐ Introducción al Metabolismo. 7.‐ Metabolismo de carbohidratos. 3 8.‐ 9.‐ Ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Transporte electrónico mitocondrial. 10.‐ Metabolismo de lípidos. 11.‐ Metabolismo de aminoácidos. 12.‐ Metabolismo de nucleótidos. 25 h CE, 6 h PA, 2h TG 5 BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA PRIMER BLOQUE “Lehninger. Principios de Bioquímica.” David L. Nelson y Michael M. Cox. 7ª edición. 2019. Editorial Omega. “Bioquímica.” L. Stryer, J. M. Berg y J. L. Tymoczko. 7ª edición. 2013. Editorial Reverté. “Bioquímica” Mathews, C.K., Van Holde, K.E., Ahern, K.G. 4ª edición. 2014. Pearson Ed. 6 3  “Principios de Bioquímica” Donald Voet. 4ª edición. 2016. Editorial Panamericana. “Biología Molecular de la Célula” Alberts, B. et al. 6ª edición. 2016. Ed. Omega “Bioquímica. Curso Básico” J. L. Tymoczko, J. M. Berg y L. Stryer. 2ª edición. 2014. Editorial Reverté. 7 PRÁCTICAS Las Prácticas son obligatorias. Quienes las hayan realizado otro año, no tienen que volver a hacerlas Se realizan en el Edificio Santiago Gascón, laboratorio 5. El primer día de Prácticas, los alumnos han de llevar impresos los guiones que se encuentran en Campus Virtual. Hay que llevar bata y calculadora. Se realizará un examen escrito sobre las Prácticas. No se conserva la nota de un curso para otro 8 4  EXÁMENES Tanto después de finalizar el primer bloque (Temas 1-5) como el segundo (Biología Molecular), se realizarán sendos exámenes que serán eliminatorios si se aprueban (nota igual o superior a 5). Examen con preguntas de test de respuesta múltiple, preguntas cortas y/o problemas. Las fechas de los exámenes se encuentran disponibles en la web del Grado de Biología 9 EVALUACIÓN DEL APRENDIZAJE DE LOS ESTUDIANTES (GUÍA DOCENTE) Evaluación continuada: clases de teoría, problemas, tutorías, pruebas escritas, prácticas y asistencia a clase. Tres pruebas escritas: 1. Bloque A 2. Bloque B 3. Examen final: Bloque C y examen del bloque o bloques que no se hayan superado en las dos pruebas anteriores. Valoración comprendida entre 0 y 10 puntos. Cada bloque de la asignatura se aprobará si se obtiene una puntuación ≥ 5 y para su cálculo se tendrá en cuenta la nota de la prueba escrita y de la evaluación continuada. Para aprobar la asignatura será necesario aprobar al menos dos bloques y en el restante una calificación ≥ 4 puntos. La nota final se obtendrá de calcular la media ponderada de las tres notas y representará un 90% de la nota final de la asignatura. Es necesario haber asistido a los dos turnos de prácticas. La valoración de las prácticas se realizará mediante evaluación continuada y una prueba escrita única. La nota obtenida representará un 10% de la nota final de la asignatura. Se mantendrá la nota de los bloques aprobados en mayo y del examen de prácticas para la convocatoria de junio. En las convocatorias extraordinarias adelantadas y en la evaluación diferenciada (enero o noviembre), los alumnos deberán examinarse de los tres bloques de la asignatura. La nota final de la asignatura se obtendrá utilizando el mismo criterio que para la convocatoria de mayo. 10 5  EVALUACIÓN CONTINUA: Campus virtual, participación en CE, PA, TG. 11 EVALUACIÓN Bloque A: Evaluación continua: 20 % Examen: 80 %. La evaluación continua no reduce la nota del examen. Nota parcial = Max(Nota examen, (EC*0,2 + Nota examen*0,8) Ejemplo 1. Nota EC=8, nota examen=4,5  Nota parcial = 8*0,2 + 4,5*0,8 = 1,6 + 3,6 = 5,2 Ejemplo 2. Nota EC=5, nota examen=7  Nota parcial = 5*0,2 + 7*0,8 = 1,0 + 5,6 = 6,6 Nota parcial = 7 (Nota examen) 12 6  13 Elementos esenciales para los seres vivos H + O + N +C = >99% de la masa de la mayoría de las células 14 7  Enlaces covalentes formados por el carbono 15 BIOMOLÉCULAS Inorgánicas – H2O: 50-90% del contenido en peso de una célula – Iones (Na+, K+, Ca2+,…): 1% Orgánicas – Formadas principalmente por C, H, O, N, P y S. Aminoácidos (Proteínas) Hidratos de carbono Ácidos grasos Nucleótidos (DNA, RNA) 16 8 BIOMOLÉCULAS 17 18 9  TEMA 1 ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LAS PROTEÍNAS 19 TIPOS DE ENLACES Enlaces covalentes. Son los más fuertes. Enlaces no covalentes. Esenciales en todos los procesos bioquímicos. – Interacciones electrostáticas. – Enlaces de hidrógeno. – Interacciones de Van der Waals. 20 10  INTERACCIONES ELECTROSTÁTICAS E = k q1. q2 / D r2 (Ley de Coulomb) q1 ____________________ q2 r D: constante dieléctrica. La del agua es mucho mayor que la de un disolvente apolar. K: constante de proporcionalidad. 21 ENLACES DE HIDRÓGENO 22 11 INTERACCIONES DE VAN DER WAALS 23 GECKO 24 12  PROPIEDADES DEL AGUA Disolvente en el que tienen lugar la mayoría de las reacciones bioquímicas. Molécula polar. Capaz de formar puentes de H con muchas especies moleculares. Efecto hidrofóbico. Las moléculas apolares tienen tendencia a asociarse unas con otras, excluyendo al agua, en un proceso favorable termodinámicamente. 25 EFECTO HIDROFÓBICO 26 13 MACROMOLÉCULAS QUE FORMAN PARTE DE LOS SERES VIVOS – PROTEÍNAS. Son las más abundantes. Constituyen más del 50% del peso seco de la mayoría de las células. Son polímeros lineales formados por aminoácidos unidos entre sí mediante un enlace de tipo amida, denominado enlace peptídico. - LÍPIDOS – HIDRATOS DE CARBONO – ÁCIDOS NUCLEICOS 27 FUNCIONES DE LAS PROTEÍNAS Estructural. Proporcionan la matriz para los tejidos óseo y conectivo que dan la estructura y forma a los organismos. Ej. Colágeno y elastina. Forman la matriz de los huesos y ligamentos. Transporte. Son las proteínas encargadas de llevar determinadas sustancias de un lugar a otro del organismo. Ej. Hemoglobina. Transporta CO2 y O2 en hematíes. Protección. Constituyen el ejército de defensa ante el ataque de cualquier microorganismo. Ej., las inmunoglobulinas. El interferón es otra proteína de defensa que se produce en respuesta a determinados agentes víricos. 28 14  FUNCIONES DE LAS PROTEÍNAS Catálisis. Son los enzimas, que son los catalizadores biológicos. Comunicación celular. La comunicación entre puntos alejados en nuestro organismo se realiza, entre otros, por las hormonas, muchas de las cuales tienen naturaleza proteica, como la insulina o la hormona del crecimiento. Actividad como tampón. Las proteínas están formadas por aminoácidos con cadenas laterales con grupos ácidos y básicos, que son capaces de actuar como tampón a pH fisiológico. 29 LA ESTRUCTURA DICTA LA FUNCIÓN 30 15 La combinación de sólo 20 aminoácidos da lugar a millones de proteínas funcionales existentes en la naturaleza. Estructura primaria Residuos de aminoácidos Estructura terciaria Estructura secundaria 31 RELACIÓN ESTRUCTURA‐FUNCIÓN Secuencia de aminoácidos Estructura Función La secuencia de aminoácidos contiene la información necesaria para determinar la estructura y la función de una proteína 32 16 Proteínas de los alimentos 33 Estructura tridimensional de la mioglobina. Diagrama de varillas. 34 17  AMINOÁCIDOS – Estructura general – Clasificación – Aminoácidos no estándar – Estereoquímica – Propiedades ácido‐base 35 ESTRUCTURA DE LOS AMINOÁCIDOS Constan de un átomo de C central, denominado C (carbono adyacente al grupo carboxilo) al que están unidos covalentemente un grupo ácido carboxílico (denominado grupo -carboxilo porque está unido al C),  un grupo amino (denominado -amino por la misma razón), un átomo de hidrógeno y una cadena lateral denominada R, que es diferente para cada uno de los 20 aminoácidos estándar o aminoácidos proteicos. 36 18  LOS AMINOÁCIDOS SON ANFÓTEROS A pH fisiológico (aprox. 7), tanto el grupo carboxilo como el grupo amino se encuentran ionizados. Los aminoácidos se encuentran en forma de ión dipolar o zwitterion. Son anfóteros, es decir, pueden comportarse como ácido o como base. 37 CLASIFICACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS PROTEICOS Las proteínas de todos los seres vivos se construyen a partir de 20 aminoácidos, que se distinguen en sus cadenas laterales. Cadenas laterales R apolares alifáticas. Cadenas laterales R aromáticas. Cadenas laterales R polares sin carga. Cadenas laterales R polares cargadas positivamente. Cadenas laterales R polares cargadas negativamente. 38 19 FÓRMULAS DE LOS 20 AMINOÁCIDOS PROTEICOS Gly. Es el aminoácido más pequeño. Ala, Val, Leu e Ile. Tienden a agruparse entre sí en las proteínas, estabilizando las estructuras proteicas a través de interacciones hidrofóbicas. Met. Es uno de los dos aminoácidos que contienen azufre. Tiene un grupo tioéter. Todas las proteínas recién sintetizadas comienzan en metionina o su derivado N- formilmetionina. Pro. Es el único aminoácido cíclico. Aunque no es reactiva químicamente, su anillo rígido provoca cambios bruscos en la dirección de la cadena polipeptídica. 39 FÓRMULAS DE LOS 20 AMINOÁCIDOS PROTEICOS Phe, Tyr y Trp. Tienen cadenas aromáticas. El grupo hidroxilo de la tirosina puede formar puentes de hidrógeno. La Phe y el Trp son aminoácidos apolares. La Tyr es un aminoácido polar. El Trp y la Tyr absorben la luz ultravioleta, con un máximo a 280 nm. 40 20 ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE TIROSINA Y TRIPTÓFANO 41 FÓRMULAS DE LOS 20 AMINOÁCIDOS PROTEICOS Asp, Glu. Son aminoácidos ácidos. Sus cadenas laterales R se encuentran des- protonadas a pH 7, confiriendo carga negativa a las proteínas. 42 21  FÓRMULAS DE LOS 20 AMINOÁCIDOS PROTEICOS Ser y Thr. Contienen grupos hidroxilo. Cys. Es única entre los 20 aminoácidos porque tiene un grupo tiol (sulfhidrilo) que puede formar un puente disulfuro con otra cisteína. Asn y Gln. Son las amidas de Asp y Glu. 43 FORMACIÓN DE PUENTES DISULFURO EN LA CISTEÍNA Por oxidación de dos moléculas de cisteína, se forma un enlace disulfuro, que estabiliza la estructura de muchas proteínas. 44 22 FÓRMULAS DE LOS 20 AMINOÁCIDOS PROTEICOS Lys y Arg. Ambos son aminoácidos básicos. La Arg, con su grupo guanidinio, es el aminoácido proteico más básico. Confieren carga positiva a las proteínas. His. Tiene un anillo de imidazol. Por su valor de pKa (6.0) tanto la forma protonada como la desprotonada están presentes a pH 6.8-7.2, más o menos ionizada dependiendo del entorno. 45 46 23  ABREVIATURAS DE LOS AMINOÁCIDOS 47 AMINOÁCIDOS NO ESTÁNDAR A) Aminoácidos modificados en las proteínas. Las modificaciones más frecuentes que sufren los aminoácidos una vez que forman parte de la cadena polipéptídica son: hidroxilación (4-hidroxiprolina, 5-hidroxilisina), metilación, acetilación, carboxilación y fosforilación (fosfoserina, fosfotreonina y fosfotirosina; la fosforilación es catalizada por unos enzimas denominados proteín quinasas). Impacto sobre la estructura Impacto sobre la función !! 48 24  AMINOÁCIDOS NO ESTÁNDAR B) Aminoácidos con funciones especializadas. - mensajeros químicos en la comunicación entre células:  Glicina  Glutamato  Histamina (derivado de la histidina). Mediador de reacciones alérgicas. - intermediarios metabólicos:  Citrulina  Ornitina 49 SELENOCISTEÍNA Cisteína Selenocisteína Cys, C Sec, U Contiene un átomo de Selenio Se incorpora como Selenocisteína durante la síntesis proteica Esencial para la vida, pero presente en sólo 25 proteínas humanas 50 25 ESTEREOQUÍMICA DE LOS AMINOÁCIDOS ESTÁNDAR En todos los aminoácidos estándar excepto la glicina, el C es un centro quiral. De todos los aminoácidos existen 2 enantiómeros, la forma D y la forma L, que son imágenes especulares entre sí y que son ópticamente activos. Uno de los enantiómeros desvía la luz polarizada hacia la izquierda (levo) y el otro la desvía el mismo número de grados hacia la derecha (dextro). En las proteínas, sólo se encuentra la forma L. No todos los L-aminoácidos son levógiros ni todos los D son dextrógiros. 51 ESTEREOQUÍMICA DE LOS AMINOÁCIDOS ESTÁNDAR: SISTEMA RS 52 26 ESTEREOQUÍMICA DE LOS AMINOÁCIDOS ESTÁNDAR: SISTEMA RS 53 PROPIEDADES ÁCIDO-BASE DE LOS AMINOÁCIDOS Los aminoácidos estándar tienen 2 ó 3 grupos ionizables, cada uno de los cuales tiene un pKa determinado. En relación con sus grupos ionizables, cada aminoácido viene caracterizado por su pI. El punto isoeléctrico es el pH al cual el aminoácido no presenta carga neta. Se calcula como la media aritmética de los pKas de los 2 equilibrios de disociación directamente implicados en la formación de la especie neutra. En el pI, la solubilidad de la proteína es mínima. A un pH inferior al pI, el aminoácido tiene carga positiva y en una electroforesis se desplaza hacia el polo negativo (cátodo). A un pH superior, la carga es negativa. 54 27 ESTADO DE IONIZACIÓN EN FUNCIÓN DEL pH 55 CURVAS DE TITULACIÓN DE LA GLICINA 56 28 CURVAS DE TITULACIÓN DE GLUTAMATO E HISTIDINA 57 58 29  59 TEST RESPUESTA MÚLTIPLE ¿Cuáles de los siguientes aminoácidos tienen una cadena lateral no cargada bajo condiciones fisiológicas?: ( ) Arginina; ( ) Aspartato; ( ) Lisina; ( ) Treonina. ¿Cuál de los siguientes aminoácidos tiene una cadena lateral cuyo pKa es más próximo al pH neutro?: ( ) Histidina; ( ) Isoleucina; ( ) Lisina; ( ) Tirosina. 60 30  TEST RESPUESTA MÚLTIPLE ¿Cuáles de los siguientes aminoácidos tienen una cadena lateral no cargada bajo condiciones fisiológicas?: ( ) Arginina; ( ) Aspartato; ( ) Lisina; () Treonina. ¿Cuál de los siguientes aminoácidos tiene una cadena lateral cuyo pKa es más próximo al pH neutro?: () Histidina; ( ) Isoleucina; ( ) Lisina; ( ) Tirosina. 61 PÉPTIDOS. ENLACE PEPTÍDICO En las proteínas, el grupo -carboxilo de un aminoácido está unido al grupo -amino de otro aminoácido por medio de un enlace amida, denominado enlace peptídico. En los seres vivos no hay ningún enzima único que catalice esta reacción de condensación tal como está escrita sino que es un proceso sumamente complejo (traducción del RNAm en los ribosomas). El proceso inverso, la hidrólisis del enlace peptídico, sí es realizado en los seres vivos por unos enzimas denominados 62 peptidasas o proteasas. 31  PÉPTIDOS Dipéptido: 2 aminoácidos. Tripéptido: 3 aminoácidos. Polipéptido: hasta 30 aminoácidos. Proteína: más de 30 aminoácidos. Pentapéptido 63 PÉPTIDOS Por convención, el extremo –NH3+ (-amino) se toma como el comienzo de la cadena polipeptídica y el extremo -carboxilo como el final. Pentapéptido serilgliciltirosilalanil-leucina. Los enlaces peptídicos están sombreados en gris y las cadenas laterales en rojo. El aminoácido que tiene su grupo a-amino libre es el residuo aminoterminal ( N-terminal, N-t); el aminoácido que tiene su grupo carboxilo libre es el residuo carboxilo terminal (C-terminal, C-t). 64 32  PÉPTIDOS Alanilglutamilglicil-lisina. (Ala-Glu-Gly-Lys) (AEGK) Tetrapéptido con un grupo -amino libre, un grupo -carboxilo libre, un grupo carboxilo lateral y un grupo amino lateral. Tiene, por tanto, 4 grupos ionizables. Es distinto del péptido lisilglicilglutamilalanina. 65 El tetrapéptido AVPI tiene: () 4 grupos carboxilo; () 1 grupo carboxilo; () 4 grupos amino libres; () 1 grupo amino libre; () 3 enlaces peptídicos; () 4 enlaces peptídicos; () es igual que el tetrapéptido IPVA. El tetrapéptido AVDI tiene: () 4 grupos carboxilo; () 1 grupo carboxilo; () 2 grupos carboxilo; () 1 grupo amino libre. El tetrapéptido AVDI: () tiene carga negativa a pH 7; () tiene carga positiva a pH 7; () no tiene carga a pH 7; () tiene un pI inferior a 7. 66 33  El tetrapéptido AVPI tiene: () 4 grupos carboxilo; () 1 grupo carboxilo; () 4 grupos amino libres; () 1 grupo amino libre; () 3 enlaces peptídicos; () 4 enlaces peptídicos; () es igual que el tetrapéptido IPVA. El tetrapéptido AVDI tiene: () 4 grupos carboxilo; () 1 único grupo carboxilo; () 2 grupos carboxilo; () 1 grupo amino libre. El tetrapéptido AVDI: () tiene carga negativa a pH 7; () tiene carga positiva a pH 7; () no tiene carga a pH 7; () tiene un pI inferior a 7. 67 69 34 Frederick Sanger, 1953: secuencia de aminoácidos de la insulina Estructura primaria: secuencia de aminoácidos + puentes disulfuro Enlaces covalentes 70 Estructuras resonantes del enlace peptídico 71 35 Las distancias de enlace en una unidad peptídica son intermedias entre un doble enlace y uno sencillo 72 Los grupos peptídicos son planos 73 36 Configuraciones cis y trans del enlace peptídico     Casi todos los enlaces peptídicos presentes en las proteínas tienen configuración trans 74 Enlaces X-Prolina en configuración cis y trans Los enlaces peptídicos cis más comunes son las uniones X-Pro, porque la diferencia estérica entre las configuraciones cis y trans es menor 75 37 Flexibilidad de la cadena polipeptídica: libertad de rotación de los enlaces fi y psi Enlace fi (): N-C Enlace psi (C-Carbonilo 76 Ángulos diedros o de torsión Ángulo fi (): Formado por los planos Carbonilo—1-N-C y N-C-Carbonilo Ángulo psi (Formado por los planos N-C-Carbonilo y C-Carbonilo-N+1 77 38 Ángulos diedros o de torsión 78 Diagrama de Ramachandran 79 39  El principio de Ramachandran Ángulos fi y psi http://biomodel.uah.es/model1j/prot/Ramachandran_present/inicio.htm 80 Fin Presentación y animaciones realizadas por Eric Martz Traducción al español realizada por Angel Herráez Licencia: Atribución‐NoComercial‐CompartirIgual 4.0 Visite la versión interactivaInternacional en bioinformatics.org/molvis/phipsi/ o en Proteopedia.Org Material relacionado: Ángulos diedros en las proteínas: una visualización sencilla de los ángulos fi y psi realizada por Angel Herráez. Tutorial: Ramachandran Plot Inspection: an interactive Ramachandran plot with many controls and details. Versión en español, representación de Ramachandran interactiva con numerosos controles y detalle. (Angel Herráez) Ramachandran Plot: detailed explanation with example proteins and their plots displayed in JSmol. Psi and Phi Angles: Determination and display of angles using JSmol. Another Interactive Ramachandran Plot by David Jollie. Backbone representations explains the relations between backbone traces and main chain polypeptide bonds, as well as smoothed traces and ribbons. 81 40 Para un péptido con la secuencia Glu-Lys-Trp-Ser-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly a) Escribir en código de una letra b)¿Cuál es la carga neta a pH 1, 7 y 14? c) ¿Qué pI aproximado tendrá? 82 +EKWSGLRPG(H) +3 H+ H + pKa=3.1 +EKWSGLRPG- +2 H+ H + pK =4.1 a +EKWSGLRPG- +1 -+ H + pK =8.0 a 8.0 + 10.3.EKWSGLRPG- 0 pI= 2 -+ H + pK =10.3 a.EKWSGLRPG- -1 -. H + pK =12.5 a.EKWSGLRPG- -2 -. H. pK =13.6 a.EKWSGLRPG- -3 -. -. 83 41 Para un péptido con la secuencia ELVIS a) Escribir en código de tres letras b) ¿Cuál es la carga neta a pH 1, 7 y 14? c) ¿Qué pI aproximado tendrá? 84 +ELVIS(H) +1 (H) (H) pKa=3.1 3.1 + 4.1 +ELVIS- 0 pI= (H) (H) 2 pKa=4.1 +ELVIS- -1 - (H) pKa=8.0.ELVIS- -2 - (H) pKa=13.6.ELVIS- -3 - - 85 42  TAMAÑO DE LAS PROTEÍNAS La longitud de los péptidos naturales varía entre 2 aminoácidos y varios miles de residuos. Las proteínas pueden estar formadas por una o por varias cadenas poli-peptídicas, denominadas subunidades, que pueden ser iguales o distintas. La masa molecular media de un residuo aminoácido dentro de una proteína se considera 110 dalton. 86 NIVELES DE ORGANIZACIÓN PROTEICA Estructura primaria. Secuencia de aminoácidos y localización de puentes disulfuro. Estructura secundaria. Disposición espacial de la cadena principal de la proteína. Estructura terciaria. Estructura tridimensional completa de la cadena polipeptídica. Estructura cuaternaria. Interacción entre subunidades de proteínas multiméricas. 87 43  SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS DE LA MIOGLOBINA HUMANA Y DE CACHALOTE Similares pero no idénticas. Similitud suficiente para que ambas tengan la misma función biológica. Pero no son iguales porque han pasado millones de años desde que los cachalotes y los humanos tuvieron un antepasado común. Las proteínas evolucionan mediante cambios en sus secuencias: - Cambios conservadores. Conservan la naturaleza de su cadena lateral. Ej. Glu a Asp (ambos son aminoácidos ácidos) - Cambios no conservadores. Asp a Ala (aminoácido ácido por aminoácido hidrofóbico). Todas las moléculas de mioglobina de un mismo ser humano o de distintos seres humanos tienen esta secuencia. La secuencia de aminoácidos de una proteína es la propiedad de la que derivan todas las demás, en particular, de la que 88 deriva su función. SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS DE LA MIOGLOBINA HUMANA Y DE CACHALOTE Proteínas homólogas / Genes homólogos: comparten un ancestro común. Ortólogos: el mismo gen en distintas especies Parálogos: dos genes homólogas de la misma especie Grado de similitud: refleja la proximidad evolutiva. La homología no es un término relativo, no tiene grados. 89 44  90 Arbol filogenético 91 45  SECUENCIA CONSENSO Se aplica a secuencias de DNA, RNA o proteínas. Cuando se compara una serie de secuencias de ácido nucleico o de proteína relacionadas, la secuencia consenso es la que contiene el nucleótido o el aminoácido más frecuente en cada posición. Aquellas partes de la secuencia en las que se observa mayor coincidencia, suelen representar dominios funcionales conservados evolutivamente. Se utilizan dos tipos de convenciones para representar una secuencia consenso. 92 Representación de secuencias consenso Lazo P Dominio de unión a ATP 93 46  ESTRUCTURA PRIMARIA Es importante conocerla para predecir el mecanismo de acción de la proteína. Las comparaciones de la secuencia de aminoácidos entre proteínas análogas del mismo individuo, de miembros de la misma especie y miembros de especies relacionadas han proporcionado hipótesis de cómo funciona una proteína y de la evolución que han seguido esas proteínas (y de los organismos) a lo largo de la historia. -Evolución molecular Los análisis de la secuencia de aminoácidos forman parte de la Patología Molecular porque las alteraciones en la secuencia de la proteína producen en muchas ocasiones alteraciones en la función de las proteínas y enfermedades. 94 ESTRUCTURA SECUNDARIA Disposición espacial de los átomos que forman el esqueleto o cadena principal de la proteína, sin tener en cuenta la conformación de sus cadenas laterales R. Esqueleto o cadena principal de una proteína: Formada por los átomos que participan en los enlaces peptídicos de esa proteína sin considerar las cadenas laterales de los aminoácidos. 95 47  ESTRUCTURA SECUNDARIA En las proteínas, se pueden presentar 3 tipos principales de estructuras secundarias regulares: – Hélice  – Hoja plegada  Hélice de colágeno 96 Hélice alfa Esqueleto polipeptídico enrollado dextrógiramente, con los grupos R dispuestos hacia el exterior Vuelta de hélice: 5.4 Å (0.54 nm) 3.6 residuos/vuelta Cada residuo rota 100º y avanza 1.5 Å con respecto al anterior 5,4 Å Estabilizada por puentes de hidrógeno entre el oxígeno carbonílico de cada residuo y el grupo amino del residuo situado 4 posiciones más adelante Cada residuo está unido por puentes de hidrógeno con el residuo n-4 y el residuo n+4 La prolina rompe la hélice alfa, introduce una curvatura. Tampoco suele contener glicina 97 48  HÉLICE ALFA Seforman puentes de hidrógeno entre el grupo C=O de un aminoácido situado en posición n y el grupo N-H de otro aminoácido situado 4 posiciones más adelante, en posición n+4. Excepto en los extremos, todos los grupos amino y carbonilo de la cadena principal están unidos por puentes de hidrógeno 98 HÉLICE ALFA Las cadenas laterales de los aminoácidos están situadas hacia fuera de la hélice, de manera que hay poco impedimento estérico entre ellas. Hélice alfa vista desde un extremo a lo largo del eje longitudinal 99 49 Hélice alfa Para tener una estructura regular, los ángulos de enlace son prácticamente constantes  =-60º;  =-45º a -50º 100 HOJA BETA Cadena polipeptídica extendida en zig-zag Varios segmentos dispuestos paralelamente Cadenas laterales protruyendo en direcciones alternantes Puentes de hidrógeno entre segmentos adyacentes 102 50  HOJA BETA 6,5 Å 7Å Hoja beta paralela Hoja beta antiparalela 103 Hoja beta: cadenas antiparalelas 2 puentes de hidrógeno conectan cada residuo con un único residuo en la hebra adyacente 104 51  Hoja beta: cadenas paralelas 2 puentes de hidrógeno conectan cada residuo con 2 residuos diferentes en la hebra adyacente 105 Hoja beta Cadenas antiparalelas:  =-150º;  =150º Cadenas paralelas:  =-120º;  =120º 106 52  107 Linus Pauling (1901-1994) Hibridación de orbitales: naturaleza del enlace covalente (The Nature of Chemical Bond, and the Structure of Molecules and Crystals (1939)) Complementariedad molecular antígeno-anticuerpo Hélice alfa / hoja beta Premio Nobel Química 1954 "for his research into the nature of the chemical bond and its application to the elucidation of the structure of complex substances." Premio Nobel de la Paz 1962 "for his fight against the nuclear arms race between East and West." 108 53 GIROS BETA Permiten el cambio de dirección de las cadenas polipeptídicas. Formado por 4 aminoácidos. El carbonilo del residuo i está formando un puente de hidrógeno con el -NH del residuo i+3. La Pro y la Gly suelen participar en estos giros. Los giros suelen producirse con más frecuencia en la superficie de las proteínas. 109 110 54 Contenido de hélice  y estructura β de algunas proteínas Proteína (residuos) % hélice  % hoja β Quimotripsina (247) 14 45 Ribonucleasa (124) 26 35 Carboxipeptidasa (307) 38 17 Citocromo c (104) 39 0 Lisozima (129) 40 12 Mioglobina (153) 78 0 111 ESTRUCTURAS SUPERSECUNDARIAS Plegamientos formados por varias estructuras secundarias conectadas, y presentes en distintas proteínas Lazo -- Vértice - 112 55  ESTRUCTURA TERCIARIA Es la estructura tridimensional completa de una cadena polipeptídica. La estructura terciaria especifica la posición espacial de cada átomo, incluidos los de la cadena lateral. Se determina mediante cristalografía de R.X, mediante resonancia magnética nuclear (RMN) o mediante criomicroscopía electrónica de alta resolución. 113 PROTEÍNAS GLOBULARES Estructuras características de proteínas globulares: la hélice azul indica hélice ; la flecha roja indica lámina . 114 56  ESTRUCTURA TERCIARIA Alcohol Aspartato Insulina Citocromo c Quimotripsina Calmodulina Hemoglobina Porina deshidrogenasa transcarbamoilasa colágeno La función de una proteína depende de su conformación, es decir, de la organización de sus átomos en una estructura tridimensional. La secuencia de aminoácidos es importante porque determina la conformación de la proteína. 115 FLEXIBILIDAD Y FUNCIÓN Lactoferrina 116 57  ESTRUCTURA TERCIARIA Mantenida por: – Puentes de H entre cadenas laterales de aminoácidos (Ej. Tyr-Asp) o átomos de la cadena principal (grupo peptídico). – Interacciones Electrostáticas (Ej. Lys-Asp) – Efecto hidrofóbico. Se producen muchas interacciones apolares en el interior de las proteínas porque la cadena polipeptídica se dobla espontáneamente de modo que sus grupos hidrofóbicos quedan enterrados en su interior y las cadenas polares hacia el exterior. Este fenómeno, que se denomina efecto hidrófobo, es el factor más importante que rige el plegamiento. – Puentes disulfuro. Esta es una interacción covalente, más fuerte que las otras. (Cys- S-S-Cys) – Fuerzas de Van der Waals. 117 DETALLE DE LOS ENLACES DE HIDRÓGENO DE UNA PROTEÍNA CARACTERÍSTICA Donadores o aceptores de enlaces de hidrógeno: hidroxilos de serina o treonina. grupos amino y oxígenos carbonilo de asparagina o glutamina. nitrógenos del anillo de histidina. protones o carbonilo del enlace peptídico. Mathews. Fig. 6.21. 118 58  ESTRUCTURA TERCIARIA Según su estructura terciaria, las proteínas pueden clasificarse en: – Fibrosas. Son alargadas, poco hidrosolubles y con función estructural. Constan mayoritariamente de un tipo único de estructura secundaria. Ej. Colágeno. Su estructura secundaria es la hélice de colágeno. La proteína -queratina (cabello, cuernos, lana, garras capa externa de la piel,…) está formada sólo por -hélice. La proteína fibroína de la seda está formada sólo por hojas . – Globulares. La mayoría de las proteínas no son fibrosas sino globulares. Son hidrosolubles, de forma globular, con función dinámica y pueden contener varios tipos de estructura secundaria como -hélice, lámina . Los átomos están perfectamente empaquetados, sin huecos entre ellos. (Structural insigths 2.16.1; 2.16.2). 119 DISTRIBUCIÓN DE AMINOÁCIDOS HIDRÓFOBOS E HIDROFÍLICOS EN LAS PROTEÍNAS GLOBULARES Residuo polar Residuo hidrofóbico Modelo estructura mioglobina Corte mioglobina Los residuos polares se localizan exclusivamente en la superficie de la proteína, en contacto con el agua. Los residuos hidrofóbicos ocupan el interior, que está compacto y sin agua. Aminoácidos hidrofóbicos de distintos tamaños. 120 59  ESTRUCTURA TERCIARIA Las proteínas relativamente grandes pueden plegarse en varias unidades globulares estables, denominadas dominios. A menudo, cada dominio tiene una función distinta dentro de la proteína. Dominios estructurales de la troponina C 121 ESTRUCTURA CUATERNARIA Las proteínas formadas por más de una cadena polipeptídica: presentan estructura cuaternaria. A cada una de las cadenas polipeptídicas que la componen se le denomina subunidad. Estructura cuaternaria de una proteína: – nº de subunidades – ordenamiento espacial de las subunidades – fuerzas que mantienen unidas las subunidades. Pueden ser covalentes (generalmente puentes disulfuro entre cisteínas) o no covalentes. Las subunidades pueden ser idénticas o diferentes. – Una subunidad: monomérica (no tiene estructura cuaternaria) – Dos subunidades: dimérica. – Tres subunidades: trimérica. – Cuatro subunidades: tetramérica. Ej. Hemoglobina. – Varias subunidades: polimérica, multimérica u oligomérica. 122 60  DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS Desnaturalización: Proceso en el que una proteína pierde su conformación nativa por calentamiento a altas temperaturas, por cambios a pHs muy ácidos o muy alcalinos o por adición de agentes desnaturalizantes como la urea, la guanidina o detergentes como SDS. Cuando una proteína se desnaturaliza pierde su estructura secundaria, terciaria, cuaternaria y su funcionalidad. No queda afectada su secuencia de aminoácidos. Cuando la proteína se renaturaliza (eliminando suavemente los agentes desnaturalizantes), recupera su estructura original y también su funcionalidad. 123 EXPERIMENTO DE ANFINSEN Urea + Eliminación 2-ME Urea y 2-ME Ribonucleasa Ribonucleasa Ribonucleasa nativa desnaturalizada renaturalizada (activa) (inactiva) (activa) La secuencia de aminoácidos de una proteína determina su estructura tridimensional y su función 124 61  EXPERIMENTO DE ANFINSEN Ribonucleasa Ribonucleasa nativa renaturalizada (activa) (activa) Urea + Eliminación 2-ME Urea y 2-ME Eliminación 2-ME, +Urea Eliminación Urea Eliminación Urea, + trazas de 2-ME Puentes S-S al azar Ribonucleasa desnaturalizada (inactiva) 125 EXPERIMENTO DE ANFINSEN El experimento de Anfinsen demuestra que el plegamiento de una proteína, es decir, su estructura tridimensional, viene determinado por la secuencia de aminoácidos de la proteína. Experimento de Anfinsen Cuando el enzima ribonucleasa se desnaturaliza pierde su funcionalidad. Si se eliminan los agentes desnaturalizantes, el enzima se pliega espontáneamente a su estructura tridimensional original y, de nuevo, recupera su función. En la célula no todas las proteínas se pliegan espontáneamente. Se requieren muy frecuentemente chaperones moleculares, proteínas que facilitan el plegamiento. 126 62  RUTAS DE PLEGAMIENTO PROTEICO El plegamiento de las proteínas es muy rápido porque tiene lugar en varias etapas, siguiendo rutas jerarquizadas. Voet, Fundamentos de Bioquímica 127 TERMODINÁMICA DEL PLEGAMIENTO PROTEICO Las proteínas se pliegan hasta alcanzar el estado de mínima energía libre. Los estados desplegados se caracterizan por valores elevados de energía libre y entropía. Pueden existir múltiples estados intermedios. Hay una conformación nativa única, de mínima energía. Voet, Fundamentos de Bioquímica 128 63  PLEGAMIENTO PROTEICO ASISTIDO Las chaperonas impiden la agregación de proteínas desplegadas. Hsp70 / Hsp40 (DnaK, DnaJ) Chaperoninas (GroEL/GroES procariotas, Hsp60 en eucariotas) Hsp90 (eucariotas) Proteína disufuro isomerasa (PDI) Peptido prolil cis-trans isomerasa (PPI) Lehninger, Bioquímica 129 DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA 3D DE LAS PROTEÍNAS Lehninger, Bioquímica Cristalización -> Difracción de rayos X Proteína soluble: Resonancia Magnética Nuclear (RMN) Criomicroscopía electrónica Predicción mediante Inteligencia Artificial: AlphaFold (Google) 130 64  Criomicroscopía electrónica (cryo‐EM) 131 BANCO DE DATOS DE ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS (PROTEIN DATA BANK, PDB) http://www.rcsb.org Archivo de estructuras tridimensionales de DNA, RNA y proteínas elucidadas hasta la fecha. A cada estructura se le asigna una etiqueta identificadora de cuatro letras. Ej PDB ID 4TNC troponina C, proteína muscular. Software para visualizar estructuras: Swiss-PdbViewer: https://spdbv.vital‐it.ch/ 132 65 ENFERMEDADES POR PLEGAMIENTO INCORRECTO: ENFERMEDADES PRIÓNICAS Síndrome de Creutzfeldt-Jakob (EEB, encefalopatía espongiforme bovina o enfermedad de las vacas locas): plegamiento defectuoso de una proteína denominada prión. Individuos sanos: el prión tiene una estructura secundaria de alfa- hélice y ovillo aleatorio desordenado. Pacientes: el prión se deposita en los cerebros y su estructura secundaria es una mezcla de alfa hélice y hoja beta. Se destruye el sistema nervioso. Carácter infeccioso (enfermedad contagiosa): resulta de la capacidad del prión anormalmente plegado (prión de un animal enfermo) para inducir el plegamiento incorrecto de las proteínas normales de prión que entonces se agregan y precipitan. Primer caso de una enfermedad que se transmite sólo por una proteína y no por un virus o un microorganismo (portadores de DNA o de RNA). Stanley Prusiner: Premio Nobel en 1997. 133 LA PROTEÍNA PRIÓN -hélice Ovillo aleatorio desordenado Mathews, fig..27 134 66  LA PROTEÍNA PRIÓN 135 MODELO PROTEICO DE LA TRANSMISIÓN DE LA ENFERMEDAD PRIÓNICA El carácter infeccioso de los priones se cree que resulta de la capacidad del prión anormalmente plegado para inducir el plegamiento incorrecto de las proteínas normales de prión que entonces se agregan y precipitan 136 67  OTRAS ENFERMEDADES POR PLEGAMIENTO INCORRECTO Amiloidosis: Una proteína mal plegada que debería ser soluble se convierte en una fibra amiloide insoluble. 137 OTRAS ENFERMEDADES POR PLEGAMIENTO INCORRECTO Amiloidosis: Una proteína mal plegada que debería ser soluble se convierte en una fibra amiloide insoluble. – Síndrome de Creuztfeldt-Jakob – Enfermedad de Alzheimer – Enfermedad de Huntington – Enfermedad de Parkinson No amiloidosis: – Fibrosis quística. Deleción de un residuo de Phe en posición 508 Plegamiento incorrecto de un canal de cloruro  Degradación del canal. 138 68  DETERMINACION DE LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE UNA PROTEINA - Secuenciación de la proteína: Degradación de Edman Espectrometría de masas –Secuenciación de ácidos nucleicos 139 SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS 1. ETAPAS PRELIMINARES Purificación de la proteína Purificación de cada cadena polipeptídica si es que hay más de una. Ruptura de los puentes disulfuro entre cisteínas con ácido perfórmico o con -mercaptoetanol. 140 69  SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS 2. FRAGMENTACIÓN DE LA CADENA POLIPEPTÍDICA La cadena polipeptídica se corta en fragmentos más pequeños: – Ruptura química: – Bromuro de cianógeno CNBr. Rompe después de una metionina. Se obtienen n+1 péptidos, siendo n el número de metioninas de la cadena polipeptídica. – Ruptura enzimática con proteasas: – Tripsina. Rompe después de Lys o Arg. – Quimotripsina. Rompe después de Phe, Tyr y Trp. 141 DIGESTIÓN CON QUIMOTRIPSINA Escribir los péptidos que se obtienen al digerir con quimotripsina: Phe-Ala-Glu-Ser-Tyr-Tyr-Ile-Gly-Trp-Leu-Asp-Ala-Lys-Trp-Thr-Val Péptidos quimotrípticos: Phe Ala-Glu-Ser-Tyr Tyr Ile-Gly-Trp Leu-Asp-Ala-Lys-Trp Thr-Val Notar que todos terminan en Phe, Tyr ó Trp excepto el C-terminal! 142 70  SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS 3. SECUENCIACIÓN MEDIANTE DEGRADACIÓN DE EDMAN Este método se ha utilizado durante muchos años pero en la actualidad ha sido sustituido mayoritariamente por la espectroscopía de masas. 143 SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE DEGRADACIÓN DE EDMAN 145 71  SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS CON ESPECTROMETRÍA DE MASAS La técnica más moderna para secuenciar proteínas es la espectrometría de masas en tándem o MS/MS. Ventaja: Requiere mucha menos cantidad de proteína que el método de Edman. La proteína se hidroliza con tripsina en péptidos más pequeños. La mezcla de péptidos se inyecta en el primer MS, donde son ionizados. 1 péptido pasa a una cámara de colisión donde se fragmenta por impacto con argon. La mayor parte de las roturas se producen en el enlace peptídico y sólo en un sitio de cada molécula. La mezcla de fragmentos pasa al segundo MS donde se mide la relación m/z de los fragmentos cargados y se ordena por su valor. Cada pico sucesivo tiene un aminoácido menos que el pico anterior. La diferencia de masa/carga de pico a pico se compara automáticamente con un base de datos de los valores m/z de los 20 aminoácidos. De esta comparación se deduce la identidad del aminoácido perdido, revelando así la secuencia del péptido. 147 SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS FRENTE A PROTEÍNAS La secuencia de aminoácidos de una proteína se puede deducir a partir de la secuencia de su gen, es decir, de una secuencia de DNA. Ventajas de la secuenciación de DNA: – Fácil – Barata – Rápida Inconvenientes: – No se detectan modificaciones post-traduccionales. Ej. No se detecta hidroxiprolina en el colágeno. 148 72 149 150 73  151 http://ncbi.nlm.nih.org 152 74