Técnica Histológica - Dr. Montalvo PDF

TÉCNICA HISTOLÓGICA CÉSAR EDUARDO MONTALVO ARENAS Agosto de 2010. INTRODUCCIÓN. Parece factible que, si deseamos estudiar una célula o una asociación de ellas, para conocer su estructura morfológica microscópica y deducir, en lo posible sus funciones, bastaría Fig Tec. de tinción: Micr...

TÉCNICA HISTOLÓGICA CÉSAR EDUARDO MONTALVO ARENAS Agosto de 2010. INTRODUCCIÓN. Parece factible que, si deseamos estudiar una célula o una asociación de ellas, para conocer su estructura morfológica microscópica y deducir, en lo posible sus funciones, bastaría Fig Tec. de tinción: Micromanipulación mecanica (microelectrodos que a traviesasn la emembran celular) examinarlas a través de los instrumentos que amplían imágenes de los objetos observados (microscopios fotónicos COLORACIÓN VITAL Puede ser de dos tipos: y electrónicos); este procedimiento no es factible de 1. Coloración intravital, consiste en la administración de realizar; al intentar hacerlo se presentan serias dificultades colorantes vitales a través de las vías digestiva o en la manipulación de los especimenes y el inicio de los intratraqueal; mediante inyecciones sanguíneas, procesos propios de desarreglo molecular (autólisis) y linfáticas, subcutánea, o intraperitoneal. Las soluciones celular que suelen presentarse después que las células y los de uso más frecuente son: tinta china, carmín de litio, tejidos abandonan su hábitat natural. Por lo tanto, es azul tripan (partículas colorantes que demuestran la necesario utilizar una serie de procedimientos y artificios capacidad fagocítica). que nos permitan describir, comprender y analizar la estructura microscópica de las células, tejidos y órganos. 2. Coloración supravital, En este procedimiento se emplean colorantes que se aplican a células o tejidos Se denomina TÉCNICA HISTOLOGICA al conjunto de provenientes de organismos vivos. Se demuestran: procedimientos aplicados a un material biológico (animal o mitocondrias con el verde de Jano, los gránulos de las vegetal) con la finalidad de prepararlo y conferirle las células cebadas con el rojo neutro, la sustancia condiciones óptimas para poder observar, examinar y granulofilamentosa de los reticulocitos con el azul analizar sus componentes morfológicos a través de los brillante de cresyl, ramificaciones nerviosas con el microscopios fotónicos y electrónicos. azul de metileno; o el ADN y el ARN de las células con naranja de acridina (empleando el microscopio de fluorescencia). PROCEDIMIENTOS INMEDIATOS O VITALES Permiten la observación y el estudio de protozoarios, células sanguíneas, células descamadas o disociadas, células en cultivo de tejidos; estructuras muy delgadas y translúcidas como la membrana peritoneal de animales pequeños o epidermis de vegetales, granos de polen etc. suspendidas en los líquidos de su hábitat natural o solución salina balanceada. Para una observación óptima suele utilizarse tipos especiales de microscopios fotónicos como el de campo oscuro o el de contraste de fases: observación al estado fresco. Fig Tec. de tinción 1: Tinción supervital de macrofagos de tejido conectivo por agregado de Carmin de litio a una preparación de Tejido En ciertos casos, cuando se requiera destacar alguna Vivo. estructura celular o tisular se pueden emplear colorantes inocuos para la vida de las células, no modifican la PROCEDIMIENTOS MEDIATOS O POSTVITALES estructura de ellas ni interfieren en sus funciones. A este Tienen por finalidad preparar células, tejidos y órganos procedimiento se le conoce como coloración vital. procedentes de seres en los que los procesos vitales se han detenido y es necesario conservar la estructura que tenían en Para el estudio de las manifestaciones vitales de las vida. muestras suelen emplearse una serie de microinstrumentos De manera general, para alcanzar este objetivo es necesario que facilitan la introducción, al interior de las células, de realizar los siguientes pasos: sustancias o la extracción de ciertos componentes mediante microinyectores, micropipetas, microelectrodos o instrumentos que emiten haces sumamente delgado de - Toma de la muestra radiaciones de alta energía (rayos laser). - Fijación - Inclusión - Microtomía - Coloración o tinción - Montaje 1 A) TOMA DE LA MUESTRA b) mediante la necropsia, las muestras se obtienen de La calidad y la fidelidad con que una célula o un tejido seres muertos: En este caso es recomendable que muestren una imagen al microscopio, con las los tejidos y órganos se obtengan inmediatamente características morfológicas que poseían cuando después de producida la muerte. estaban con vida, dependen esencialmente de la prontitud y el cuidado que se aplicó para obtener la Recomendaciones para la toma de las muestras. muestra a ser procesada mediante los pasos Los tejidos y los órganos provenientes de biopsias y mencionados anteriormente. necropsias se seccionar empleando bisturís o navajas de afeitar nuevos, sin hacer presión sobre ellos. No es Existen diversos procedimientos que permiten obtener recomendable el uso de tijeras para cortar los tejidos pues muestras de tejidos y órganos para conseguir éstas ocasionan compresiones y jalonamientos de los preparaciones histológicas de buena calidad. Estos son: tejidos y órganos que distorsionar su estructura microscópica. El tamaño de las muestras no debe exceder de a) Mediante la biopsia: (del griego bios = vida y 10 mm por lado con un grosor de 5 mm. opsis = visión), consiste en la toma de un fragmento de tejido u órgano de un ser vivo. realiza B) FIJACION. a través de una operación quirúrgica hecha Es un procedimiento cuya finalidad, al aplicarlo es exprofesamente o durante la intervención quirúrgica efectuada en pacientes y corroborar así Detener la vida de las células e impedir las modificaciones un diagnóstico de una determinada lesión. La post morten que pueda sufrir la célula (procesos autolíticos), biopsia puede ser: manteniendo la estructura morfológica de células y tejidos  incisional sin que ocurran cambios notables en ellos.  excisional  por sacabocados  por punción y absorción Esto se consigue inmovilizando (por coagulación o  por raspado precipitación) las moléculas proteínicas e inhibiendo  por trepanación principalmente las enzimáticas haciéndolas insolubles. Esta acción garantiza la integridad de las células y tejidos; se efectúa por mediante agentes químicos denominados fijadores. Los fijadores se clasifican en dos grandes grupos: a) Oxidantes: el tetraóxido de osmio (ácido ósmico), el bicromato de potasio, ácido crómico, bicloruro de mercurio o “sublimado corrosivo”, ácido pícrico, ácido acético. b) Reductores: el formaldehído, el glutaraldehído, el Fig Tec de tinción: Aguja de biopsia incisional (el embolo se retrae al alcohol etílico, el alcohol metílico. insertar la aguja El estudio de células de superficies epiteliales de renovación constante (mucosas bucal, gástrica, vaginal, uretral), se La acción oxidante o reductora de los fijadores le confieren realiza a través de la Citología Exfoliativa. En otros casos a las células ciertas condiciones que posibilitan una mejor células obtenidas mediante punción (células sanguíneas o de aplicación de las sustancias colorantes, por ejemplo: el la médula ósea) se extienden en una lámina portaobjetos alcohol etílico absoluto conserva el glucógeno, el bicloruro para hacer los “frotis”, colorearlas y examinarlas. de mercurio provoca que las anilinas coloreen de manera más brillante a las fibras colágenas, el bicromato de potasio facilita la coloración de las mitocondrias, el ácido acético permite una mejor tinción de los núcleos, el cloruro de calcio conserva e insolubiliza parcialmente a los lípidos. Los fijadores son: a) Gaseosos: como el formaldehído b) líquidos: como el ácido acético, al alcohol etílico, la acetona, etc. c) sólidos: como el bicloruro de mercurio, el bicromato de potasio, etc. Fig Tec. de tinción: Punción 2 Condiciones de un buen fijador. A continuación se presentan algunos ejemplos de fijadores Una sustancia fijadora para que ejerza de manera eficiente y compuestos o mezclas fijadoras que se emplean con mayor adecuada sus funciones debe poseer las siguientes frecuencia: condiciones:  Formol - fosfato (formol tamponado):  Matar inmediatamente a las células, impidiendo la - solución de formaldehído (37% a 40%)--------------100 ml aparición de los procesos autolíticos. Para tal fin el - agua destilada ------------------------------------------- 900 ml fijador debe poseer: - fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4 - H2O)-----4.0 gr Un buen poder de penetración, que en contados - fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)------------------6.5 gr instantes se introduzca con rapidez en el espesor de la muestra Un buen poder de difusión, que no fije sólo la porción Suele emplearse como un fijador de rutina, al igual que el superficial de la muestra sino que alcance las porciones formol al 10%. Posee un pH de 6.8 a 7.0 aproximadamente. más profundas de la misma. Es ligeramente hipotónico.  Producir cierta dureza a los tejidos sin que se  Formol - bicloruro de mercurio. provoque excesiva retracción o hacerlos quebradizos y - solución de formaldehído (37% a 40%)--------------150 ml friables. - agua destilada--------------------------------------------850 ml - bicloruro de mercurio-------------------------------------50 gr  Debe de ser de fácil manipulación.  No debe disolver componentes celulares. Es recomendable usarlo para fijar tejidos hematopoyético y linfáticoreticular. El material nuclear se fija de manera  Que sea fácil de conseguir y que sea barato. precisa y nítida. Facilita la tinción de fibras colágenas y células conjuntivas mediante el empleo de colorantes que Las soluciones fijadoras suelen ser fijadores simples, o tienen como base a las anilinas. Se utiliza para los tejidos en fijadores compuestos (mezclas fijadoras) en las que utilizan los que se aplicará técnicas inmunohistoquímicas. Los más de una sustancia fijadora. tejidos no deben mantenerse mucho tiempo en fijación (no más de 48 horas) porque se endurecen demasiado. HgCl2 es Ejemplo de fijador simple: una sustancia que corroe el instrumental metálico. Antes de Formol o formalina. Está considerado como la sustancia aplicar una tinción es necesario eliminar los pigmentos fijadora de mayor uso en los laboratorios que realizan precipitados del bicloruro de mercurio en los tejidos. técnica histológica. El formol comercial consiste en una solución acuosa del gas formaldehido al 39 - 40%. Se  Formol - cloruro de calcio. presenta como un líquido claro, incoloro, que emite vapores - solución de formaldehido (37% a 40%)---------------100 ml sumamente irritantes para la conjuntivas y la mucosa - cloruro de calcio--------------------------------------------10 gr respiratoria. Su acción fijadora se ejerce coagulando las - agua destilada----------------------------------------------900ml proteínas. Es un fijador que posee un buen poder de penetración y Se recomienda fijar las muestras en esta solución cuando se difusión. Mantiene de manera adecuada la estructura y desean preservar lípidos, especialmente fosfolípidos: Antes facilita la coloración posterior de los componentes celulares de obtener los cortes, las muestras se incluyen en gelatina o y tisulares. Endurece bien las muestras. Conserva bastante se congelan directamente para seccionarlas con empleando bien a las grasas. microtomos de congelación o el criostato. Se le emplea en una solución al 10% (10 del formol  Líquido fijador de Boüin. comercial y 90 partes de agua) - solución acuosa saturada de ácido pícrico-------------750 ml - solución de formaldehido (37% a 40%)---------------250 ml - ácido acético glacial--------------------------------------- 50 ml El tiempo de fijación de las muestras, dependiendo del tamaño de ellas, debe ser de 24 a 48 horas como mínimo y si es posible, en refrigeración. Es un buen fijador de uso rutinario. Tiene un buen poder de penetración y de difusión. Ofrece resultados satisfactorios Fijadores compuestos. con ciertos tricrómicos como el de Masson. Pueden fijarse Una sola sustancia fijadora difícilmente reúne todas las piezas de un centímetro de grosor y dos o tres centímetros condiciones para ejercer una buena fijación, por lo tanto es de longitud. Se le emplea con resultados óptimos en la aconsejable usar mezclas fijadoras a través de las cuales se fijación de embriones y fetos pequeños pues ejerce cierto acrecientan las cualidades de un fijador y se atenúan sus poder descalcificante. Dependiendo del volumen de la defectos y desventajas. muestra, el tiempo de fijación será de 12, 24 a 48 horas. 3 Antes de la inclusión, es conveniente eliminar el ácido se empleará la solución de formol al 10% ó 15% que pícrico de las muestras (tiñe de color amarillo intenso a los permite obtener resultados satisfactorios. Líquido tejidos)El lavado se hace con una solución de alcohol etílico considerado como el “fijador universal” pues facilita al 70% a la que se añaden algunas gotas de una solución al el empleo posterior de cualquier otro fijador 5% de carbonato de litio. El lavado finaliza cuando el (postfijación) capaz de complementar su acción. alcohol litinado ya no muestra color amarillento. b) Tamaño de las muestras. El tamaño y grosor de las muestras deben ser pequeñas y delgadas, de 1cm2 a 2  Líquido fijador de Zenker ( Solución madre o stock) cm2 y con un espesor de 2 mm a 5 mm, especialmente - bicloruro de mercurio-------------------------------------50 gr si se emplean fijadores con escaso poder de penetración - bicromato de potasio--------------------------------------25 gr y de difusión. - agua destilada ------------------------------------------1000 ml c) Volumen del fijador. Una proporción que es necesario La solución “madre” se puede guardar durante mucho emplear será de 1 a 20 (muestra – fijador). Será la más tiempo. Cuando a ella se le añade ácido acético forma el adecuada para garantizar una buena fijación. d) Tiempo de fijación. El tiempo en la fijación es  Líquido de Zenker (solución de trabajo): - solución madre (stock) de Zenker-----------------------95 ml importante en dos aspectos. I. El intervalo que media entre la interrupción del - ácido acético glacial-----------------------------------------5 ml aporte sanguíneo y la inmersión de las muestras en la solución fijadora. Lo deseable es que las En cambio, si a la solución “madre” de Zenker se le agrega muestras se fijen inmediatamente después de formol comercial se convierte en obtenidas mediante una biopsia o que la necropsia se efectúe al poco tiempo de producida la muerte.  Líquido fijador de Helly Mientras más largo es este lapso, los procesos - solución madre (stock) de Zenker-----------------------90 ml autolíticos que sufran los tejidos serán más - solución de formaldehido (37% a 40%)-----------------10 ml evidentes. II. Debe tenerse en cuenta el tiempo que permanecerán las muestras sumergidas en los El formol se debe agregar antes de usar la mezcla, pues la fijadores. Este tiempo varía con relación al tipo de acción reductora del formol inhibe la actividad fijadora del fijador que se utiliza; al tamaño y la naturaleza de bicromato de potasio. Las muestras deben ser pequeñas y la muestra y la temperatura de fijación. Por lo tanto fijarse por un lapso no mayor de 24 horas, porque se los lapsos de fijación varían en rangos muy endurecen en exceso, se disminuye la basofilia de los amplios. En cualquier circunstancia, siempre deben núcleos y se incrementa la acidofilia del citoplasma. Tiene respetarse los tiempos recomendados para cada una ventaja: preserva muy bien a los eritrocitos y a los tipo de fijador para garantizar la conservación de gránulos de las células de glándulas endocrinas. una buena estructura celular y tisular de los tejidos.  Fijador de Carnoy, e) Temperatura de la fijación. Es recomendable efectuar - alcohol etílico absoluto------------------------------------60 ml la fijación a bajas temperaturas ( 4o C.) dentro de un - cloroformo--------------------------------------------------30 ml refrigerador y con la solución fijadora enfriada - ácido acético glacial---------------------------------------10 ml previamente. Este procedimiento retardará el tiempo de fijación pero disminuirá de manera notable la autólisis de los tejidos. Posee un excelente poder de penetración y de difusión. Las muestras delgadas de tejidos y órganos se fijan en dos o tres Fijación por perfusión. horas. Produce lisis de los eritrocitos. Es el fijador adecuado Un método de fijación casi instantáneo es aquel que consiste cuando se desea demostrar glucógeno y la tinción de en perfundir los tejidos y órganos de un animal con una núcleos y especialmente cromosomas. solución fijadora. Este procedimiento se utiliza frecuentemente para fijar tejidos que serán procesados y CRITERIOS PARA OBTENER UNA BUENA examinados mediante el microscopio electrónico. La FIJACIÓN. perfusión consiste en anestesiar el animal y, mediante un a) Elección del fijador. La solución fijadora a utilizar sistema especial de inyección y drenaje, reemplazar la depende del estudio que se quiere realizar. Para las sangre con una solución salina y después se inyecta el preparaciones de tejidos y órganos, en las que interesan fijador. La fijación se hace en contados instantes para un estudio topográfico de los mismos, deben usarse garantizar que los tejidos se fijaron rápidamente. fijadores con un buen poder de penetración y de difusión. Para estos casos se recomienda utilizar los líquidos de Zenker, Boüin o Helly: En caso contrario 4  Cualquiera que sea el medio de inclusión a emplear es condición indispensable que la muestra a incluir se encuentre embebida en la sustancia que disuelve al medio de inclusión Inclusión en parafina. Después de la fijación y el “lavado” de las muestras, éstas se encuentran embebidas en agua o en alcohol, por lo que resulta imposible que se infiltren con parafina, medio de inclusión insoluble en agua y alcohol. Por lo tanto, para que los tejidos puedan ser incluidos en parafina se requiere deshidratarlos e infiltrarlos con el solvente de la sustancia de inclusión. Los pasos a seguir para la inclusión de las muestras en parafina son: Fig Tec. de tinción: perfusión f) Almacenamiento de las muestras. En ciertos casos los a) Deshidratación tejidos fijados no necesitan ser procesados b) Impregnación en el solvente ( a este paso inmediatamente para aplicarles otros pasos de la técnica también se le denomina aclaración o diafanización) histológica. Por lo tanto es conveniente almacenar y c) Inclusión y formación del bloque de parafina conservar los tejidos fijados para un uso posterior. Después de eliminar el fijador mediante un “lavado”, se a) Deshidratación. Significa extraer o remover el agua de guardan en una solución de alcohol al 70%. Así los los tejidos fijados. La deshidratación debe ser completa tejidos pueden guardarse por un tiempo bastante largo porque, de lo contrario, el solvente no actúa de forma sin que sufran modificaciones morfológicas notorias. adecuada y el bloque de inclusión no alcanza la dureza requerida. Para tal fin se utilizan líquidos g) Lavado de las muestras fijadas. Al concluir la fijación, deshidratadores en los cuales se sumergen los tejidos. el fijador debe ser eliminado de las muestras. Para tal Los deshidratadores más usados son el alcohol etílico, fin se procede al lavado de los tejidos mediante agua o el alcohol isopropílico, el dioxano y el cloroformo. alcohol. Se evita, así, que los tejidos se endurezcan demasiado o que ciertos componentes del fijador En el caso de la inclusión en parafina, las muestras se introduzcan modificaciones en los tejidos e impidan deshidratan en baños sucesivos en soluciones de una adecuada obtención de secciones delgadas o la concentración crecientes de alcohol etílico. El coloración correcta de sus componentes celulares. procedimiento de rutina es el siguiente: C) INCLUSION. Los tejidos fijados adquieren cierta consistencia y 1) alcohol etílico al 70 % ------------------- 12 horas dureza, pero no la suficiente para que, de ellos, se 2) alcohol etílico al 70 % ------------------- 12 horas obtengan secciones delgadas. Estas secciones, del orden 3) alcohol etílico al 95 % --------------------- 1 hora de algunas milésimas de milímetro (5 a 10 m), se 4) alcohol etílico al 95 % --------------------- 1 hora conseguirán cuando los tejidos se infiltren con 5) alcohol etílico al 100 % (absoluto) --------1 hora sustancias denominadas “de inclusión” y adquieran tal 6) alcohol etílico al 100 % (absoluto)---------1 a 1.5 horas. dureza que sometidos al filo de una navaja produzcan secciones, cortes o láminas sumamente delgados y Nota: En cada caso es necesario agitar de vez en cuando transparentes. los frascos que contienen las muestras Las sustancias de inclusión tienen la propiedad de Los tiempos indicados son los que se aplicarán a las incorporarse e infiltrarse al interior de las células y muestras de tamaño mediano (1 cm2 x 0.5 cm. de grosor). tejidos con la finalidad de servirles de soporte. Así los Los tiempos pueden disminuirse o incrementarse si las tejidos y la sustancia de inclusión forman un bloque piezas son más pequeñas o más grandes. homogéneo en dureza y consistencia, a pesar que sus componentes tuvieron originalmente distinta dureza. La deshidratación incompleta de los tejidos se comprueba Existen una serie de sustancias de inclusión que se han cuando éstos al sumergirse en el líquido diafanizador empleado o se utilizan actualmente. Unas son solubles muestran un aspecto turbio blanquecino en agua (gelatina, carbowax, glicol metacrilato) otras, solubles en solventes orgánicos (parafina, celoidina, resinas epóxicas). 5 b) Diafanización. Las muestras deshidratadas se grumos pequeños. Las parafinas, se disuelven usando encuentran totalmente embebidas en alcohol etílico estufas que las mantienen en ese estado. Las estufas absoluto; pero la parafina tampoco es soluble en permanecen a una temperatura constante, generalmente de alcohol por lo que es necesario reemplazarlo por 2o C a 4o C por encima del punto de fusión de la parafina a sustancias que sean capaces, simultáneamente, de emplear. mezclarse con el alcohol y disolver la parafina. Estas se La parafina diluida se coloca en tres recipientes dentro de la denominan líquidos diafanizadores o intermediarios. estufa. El primero, con una capacidad de 1000 a 1500 cc, Ejemplos: xilol, tolueno, benceno, y el cloroformo. recibirá a las muestras embebidas en xilol; la parafina reemplazará el xilol de las muestras y se infiltrará al interior de las mismas. Los otros dos recipientes son más pequeños (500 cc. de capacidad) y, de manera consecutiva recibirán a El líquido diafanizador de uso más frecuente es el xilol los tejidos. El último de ellos servirá para contener a las muestras antes del proceso de formación de los “bloques” de parafina. En el interior de la estufa debe existir otro La actividad aclaradora o diafanizadora del xilol se emplea recipiente conteniendo parafina líquida pura, que se también en el procedimiento de coloración. La diafanización empleará para la formación de los “bloques”. de los tejidos deshidratados se debe a que estas sustancias El tiempo que permanezcan las muestras dentro de los poseen un alto índice de refracción y al interactuar con los recipientes de parafina dependerá de la naturaleza del tejido tejidos los vuelven transparentes. y el tamaño de las muestras. Se sugieren los siguientes El procedimiento de diafanización se realiza de la siguiente lapsos: manera: 10) Primer baño de parafina------------------1 a 1.5 horas 7) alcohol absoluto (50%) - xilol (50%)--------1 hora 11) Segundo baño de parafina----------------1 a 1.5 horas 8) xilol-----------------------------------------------1 hora 12) Tercer baño de parafina-----------------30 a 60 minutos 9) xilol-----------------------------------------------1 hora Nota: agitar las muestras con cierta frecuencia Nota: las muestras deben agitarse continuamente para permitir la renovación de los líquidos. La inclusión o formación del bloque de parafina se efectúa empleando moldes de diversos materiales y diferentes áreas c) Inclusión y formación del bloque de parafina. Las y profundidades. Pueden ser de papel, metal o plástico. El parafinas son hidrocarburos saturados provenientes de bloque de parafina debe contener la muestra correctamente la destilación del petróleo. Generalmente son sustancias orientada para facilitar la obtención de las secciones o sólidas a temperatura ambiente. Existen diferentes tipos “cortes”. de parafina que se caracterizan por sus puntos de fusión. Estos oscilan entre 40o y 60o C. La parafina El molde elegido se llena con parafina caliente pura; con hierve a 300o C. y emite vapores que son muy una pinza calentada en un mechero se toma una pieza de inflamables. Las parafinas se clasifican en: tejido del tercer recipiente y se orienta una de sus superficies (aquella que se pondrá en contacto con el filo de  Blandas. tienen un punto de fusión de 45 o C - la navaja) se sumerge al interior del molde, en el que la 52o C. Son recomendables para incluir tejidos en parafina ha empezado a solidificarse y se le aplica una leve los se detectarán antígenos mediante presión. Después los moldes se enfrían de inmediato (se inmunohistoquímica. sumergen en agua fría o se introducen en el refrigerador) para que la parafina se solidifique de manera homogénea.  Semiduras. Sus puntos de fusión son de 54o C - 58o C. Es la parafina que se emplea con mayor Todos los procedimientos mencionados, desde la frecuencia en los laboratorios donde se realiza deshidratación hasta la infiltración en los dos o tres técnica histológica. De acuerdo a la temperatura recipientes de parafina líquida, se pueden efectuar de del medio, se recomienda su uso pues se pueden manera automática. Existen una serie de “procesadores obtener secciones de 5 a 7 de m. automáticos” que facilitan estas tareas.  Duras. Tienen un punto de fusión de 60o C - 65o Igualmente existen instrumentos que contienen parafina C. Son parafinas que deben usarse en ambientes fundida que la dispensan a voluntad del usuario para luego con climas de temperaturas altas. formar los bloques. Tienen anexos a ellos áreas o superficies que se mantienen calientes o frías, con la finalidad de La penetración de la parafina al interior de los tejidos se orientar correctamente las piezas de los tejidos y efectúa cuando ésta se encuentre en estado líquido. En el posteriormente producir el enfriamiento rápido, la comercio las parafinas se expenden en forma de bloques solidificación de la parafina y la formación del bloque. discoidales, escamas, tabletas rectangulares o en forma de 6 D) MICROTOMIA (OBTENCIÓN DE LOS CORTES) Los microtomos tipo Minot permiten obtener secciones En esta etapa, los tejidos y la parafina integran un solo delgadas, del orden de 4 a 7m de espesor. Producen cortes bloque que, posee la dureza y la consistencia suficientes seriados, es decir, cuando se obtiene un corte, éste queda para obtener secciones delgadas y transparentes. adherido por su borde anterior al borde posterior del que lo precedió; formándose de esta manera una cinta de cortes que va descendiendo por la superficie anterior de la navaja. Las secciones delgadas o “cortes” se obtienen utilizando instrumentos mecánicos diseñados para que en forma mas o Los cortes seriados se emplean cuando se desea realizar menos automática, seccionen el bloque de parafina en cortes reconstrucciones tridimensionales del órgano procesado, delgados y de grosor uniforme. Los instrumentos se cuando se requieren comparar secciones vecinas, del tejido denominan “microtomos” u órgano, coloreadas por diversas técnicas de tinción o cuando se hace el estudio microscópico topográfico en embriones y fetos. El sistema de funcionamiento de los microtomos consta de Existen dos condiciones indispensables que garantizan la cuatro mecanismos principales: obtención de secciones delgadas, uniformes y seriadas:  sujeción del bloque de parafina.  sujeción de la navaja.  El que permite que el filo de la navaja seccione al a) Que la deshidratación, impregnación e inclusión hayan bloque en cortes delgados y de grosor uniforme. sido realizadas correctamente.  El de avance del bloque en un número determinado de micrómetros después que se ha obtenido un corte. b) El empleo de una navaja o cuchilla muy bien afilada y asentada y que el filo de la misma ofrezca la Los microtomos se clasifican de acuerdo a la manera como inclinación adecuada hacia la superficie del bloque. se desplaza el bloque que contiene el tejido incluido; así, existen: Las navajas o cuchillas de microtomía requieren de un a) Microtomo de rotación tipo Minot. afilado y un asentado muy cuidadoso, pues el Mediante una manivela circular denominada volante, el mantenimiento del filo de ellas depende que se obtengan, mecanismo que sujeta al bloque de parafina se desplaza con éxito, buenos cortes. frente al filo de la navaja, de arriba hacia abajo y Las navajas se afilan utilizando afiladores automáticos que viceversa en un movimiento vertical. efectúan la operación en forma rápida y garantizan un afilado uniforme. b) Microtomo de deslizamiento. El movimiento que se Para el afilado de las cuchillas se requieren una placa de realiza para obtener los cortes es horizontal, es decir de vidrio despulida finamente y sustancias abrasivas. atrás hacia adelante y viceversa. Generalmente el Existen varios modelos de afiladores automáticos, pero mecanismo que sujeta al bloque de parafina es el que todos ellos funcionan bajo ciertos mecanismos: se desplaza y a la navaja permanece estática. a) movimiento y deslizamiento de las cuchillas sobre la superficie del vidrio despulido (movimiento rotatorio o de atrás hacia adelante y viceversa) b) movimiento y rotación periódica de las dos superficies de la cuchilla para enfrentarse de manera alternativa y similar a la superficie del vidrio con el abrasivo c) En ciertos modelos, la placa de vidrio también puede realizar movimientos restringidos de rotación Fig Tec. de tinción: Microtomo Las sustancias abrasivas suelen estar disueltas en agua o en aceite. Generalmente se emplean dos tipos de abrasivos: Los microtomos tipo Minot son los de uso más frecuente Unos, de grano grueso, utilizados para desgastar algunas en cualquier laboratorio donde de realiza técnica melladuras visibles de las navajas y otros, de grano fino que histológica, especialmente cuando los tejidos están incluidos sirven para afilar verdaderamente las navajas. en parafina. Los microtomos de deslizamiento, en cambio, se emplean cuando los tejidos están incluidos en celoidina o La perfección del afilado se obtiene cuando el filo de las cuando la inclusión en parafina contiene porciones navajas se asienta empleando, para tal fin, una superficie de voluminosas de tejidos y órganos. cuero para “asentar”. Esta operación se realiza momentos previos a la obtención de los cortes. 7  Extensión y adhesión de los cortes al portaobjetos. los Se recomienda, para una misma cuchilla: cortes obtenidos, aislados o en forma de cintas, a) utilizar un solo afilador y si es posible la misma placa generalmente se presentan arrugados y muestran una área de vidrio despulido menor que la que poseen en la inclusión, por lo que es necesario extenderlos y luego adherirlos a las láminas b) marcarlas de tal manera que siempre deben sujetarse al portaobjetos ( esto facilita su manipulación posterior). mecanismo del afilador conservando una posición y orientación determinadas Los cortes se extienden al depositarlos sobre la superficie del líquido extendedor contenido en un recipiente Esto impide que se formen facetas desiguales en el filo de la denominado “baño de flotación” (éste mantiene la navaja produciéndose, con ello, un afilado deficiente. temperatura entre 40o a 45o C). Las secciones se depositan Efectuado el afilado de las cuchillas, éstas deben limpiarse en el líquido procurando que la superficie brillante (aquella prolijamente, pues cualquier partícula de abrasivo que se correspondiente al filo de la navaja) se ponga en contacto quede adherido al filo de la navaja lo dañará y también al con el líquido caliente. En caso que ciertas arrugas persistan, tejido, durante la microtomía. se emplean unas pinzas finas o un pincel de pelo de camello, para ejercer una ligera tracción entre los extremos de los En la actualidad se expenden en el mercado cuchillas cortes y así desarrugarlos totalmente. descartables. Se venden en gran cantidad, generalmente por cientos, son relativamente baratas. Se emplean para obtener algunos cortes y luego se descartan. Ofrecen dos ventajas: no se requiere afilarlas y siempre el usuario tendrá un instrumento bien afilado. Obtención de los cortes. Para alcanzar este propósito se deben seguir los siguientes pasos Fig. Tec de tinción: Baño de flotación Las secciones se extienden aisladas o formando cintas, a) Sujetar firmemente el bloque con el sistema de estas se recogen y adhieren al portaobjetos de la misma abrazaderas y la muestra orientada correctamente. forma; en el caso que se requiera recoger los cortes aislados, b) Alinear el sistema de sujeción de la navaja y el filo de extendidos previamente como una cinta, deben separarse la misma, con la superficie de corte del bloque. utilizando las mismas pinzas finas o agujas de disección. c) Desgastar la superficie del bloque de parafina hasta alcanzar el tejido y se tenga la certeza de abarcar toda Para garantizar una mejor adhesión de los cortes a los el área que se desea seccionar. portaobjetos, se recomienda incorporar sustancias d) Marcar en el dial del microtomo, el número de adherentes al líquido extendedor o, en ciertos casos, al micrómetros de grosor que deben alcanzar los cortes. portaobjetos. Estas sustancias suelen emplearse de dos e) Accionar la manivela que desplaza la abrazadera con el maneras: bloque de parafina para obtener los cortes (aislados o seriados). Obtenidos los cortes se recogen cuidadosamente con unas pinzas o pinceles finos. a) Extensión previa de la sustancia adherente a una de las superficies de la lámina portaobjetos, por ejemplo, la albúmina de Mayer, constituida por partes iguales de glicerina y clara de huevo, a la mezcla se le añaden algunos cristales de timol como ingrediente conservante. La mezcla se filtra y se guarda en refrigeración. Se le utiliza extendiendo una gota de la mezcla en el portaobjetos y se deja secar. Los cortes se recogen cuidadosamente sumergiendo, por debajo de ellos, el portaobjetos en forma oblicua. Otra sustancia adherente que se emplea de la misma manera es la poli- L-lysina (solución de 25 miligramos de la sustancia en 25 ml de agua destilada). Una gota de la solución se extiende en el portaobjetos y éstos se secan a 50 o - 55o C. durante toda la noche y está lista para su uso. Fig Tec. de tinción: Microtomo, cinta transportadora, Baño de flotación 8  Teoría de la coloración. b) Al líquido de flotación se le añaden sustancias Existen dos teorías que explican el procedimiento de la adherentes. Uno de los procedimientos más sencillos es coloración el que consiste en disolver, en el agua ya caliente del baño de flotación (dos litros) 0.5 g de gelatina. En otros a) Teoría física. Considera que la coloración es un casos se emplea una solución que posee los ingredientes proceso físico de adsorción. Así, las partículas de las siguientes: sustancias colorantes disueltas penetran en los - agua destilada --------------------------------- 1,000 ml espacios intra e intercelulares en los que se mantienen - bicromato de potasio--------------------------0.2 gramos adheridas en razón de la cohesión molecular. Por - gelatina -----------------------------------------0.2 gramos ejemplo, la coloración de las grasas o lípidos es una tinción por adsorción; los Sudanes III o IV tiñen las El agua destilada se calienta a 60 o C para disolver en ella grasas por la facilidad que tienen para disolverse en la gelatina y el bicromato de potasio, sucesivamente. Se ellas. filtra y está lista para su uso. Este líquido previamente filtrado se puede utilizar varias veces. (se recomienda guardarlo en el refrigerador). Recogidos los cortes, éstos aún se pueden orientar aprovechando de la capa de líquido que queda entre el portaobjetos y los cortes. Posteriormente las láminas se apoyan en forma oblicua para que escurra el líquido sobrante y luego se colocan horizontalmente dentro de una estufa o encima de una plancha caliente ( a 50o C aproximadamente). Después de unas 3 a 4 horas, el líquido se habrá evaporado totalmente y la sustancia adhesiva unirá firmemente el corte al portaobjetos. E) COLORACION O TINCION. Fig Tec. de Tinción: Tejido adiposo teñido con Sudán Los cortes de los tejidos adheridos a los portaobjetos están listos para ser coloreados. b) Teoría química. El colorante se une a la sustancia coloreable combinándose con ella íntimamente debido a la presencia de agrupaciones moleculares ácidas o básicas en los componentes celulares o tisulares que se El procedimiento de coloración o tinción consiste en que unen respectivamente a los cromógenos básicos y una estructura celular o tisular adquiere específicamente un ácidos de los colorantes, formando sales insolubles. color bajo la acción de una sustancia colorante. Una prueba de ello es el hecho de la casi imposibilidad de separar completamente el colorante de los Se considera que una estructura se ha coloreado o teñido componentes en donde ejerció su acción de tinción aún cuando al ser lavada con el líquido que disuelve al empleando sus líquidos solventes. colorante, no se decolora. De acuerdo a esta teoría los colorantes se unen (ligan) a los El proporcionar color a las estructuras que constituyen un tejidos por enlaces iónicos, covalentes o de hidrógeno. tejido o un órgano se hace con la finalidad de distinguirlas entre sí y facilitar su observación. Si se examina al microscopio una sección de tejido sin colorear, ya adherida al portaobjetos, se podrá constatar que El enlace iónico o electrostático ocurre cuando el colorante no es fácil discernir sus componentes, pues lo delgado de los y la sustancia que se va a teñir, desarrollan diferentes cargas cortes y la diafanización producida en los tejidos igualan sus eléctricas y entonces se atraen una a la otra, por ejemplo, el índices de refracción. La coloración proporciona diferencias citoplasma se colorea porque las proteínas citoplasmáticas evidentes entre las estructuras y al observar los cortes será poseen carga eléctrica ( + ) y las partículas del colorante fácil reconocerlas. tienen carga eléctrica (-). Clasificación de los colorantes. Se denomina sustancia colorante a aquella que puede Existen varios criterios para clasificar a los colorantes: transferir su color a otro cuerpo. a) Por su origen. pueden ser naturales y artificiales (sintéticos). 9  Colorantes naturales, se extraen de: Poseen una carga eléctrica positiva, por lo tanto son 1) Animales. Como el carmín, que se extrae de la colorantes catiónicos. Se les denomina también colorantes cochinilla, artrópodo parásito de los tallos del nucleares, pues tienen afinidad por los ácidos nucleicos nopal (tuna). El carmín (de color rojo intenso) es (ADN y ARN). uno de los colorantes naturales más empleado en Las sustancias teñidas por los colorantes básicos se la industria alimentaria y cosmética. denominan “basófilas” y están constituidas por En técnica histológica se utiliza el carmín de Best componentes ácidos. para demostrar glucógeno, el carmín de Mayer Ejemplos: la hematoxilina, el rojo nuclear, el azul de para demostrar mucina; las células fagocíticas se metileno, la tionina, el azul de toluidina, la fucsina básica. evidencian con el carmín de litio (colorante vital). c) Neutros. Son sales en las que tanto la parte básica 2) Vegetales. Como la hematoxilina, obtenida de la como la parte ácida proporcionan color. Por ejemplo el corteza de un árbol, el “palo de campeche” eosinato de azul de metileno o el eosinato de azur de (Haematoxilum campechanum), la safranina que metileno. se extrae de una liliacea ( pistilos de la flor de azafran) o la orceína que se obtiene de un liquen. Estos colorantes tienen la propiedad de teñir de manera simultánea, a los componentes nucleares y a los Colorantes artificiales o sintéticos. Son productos citoplasmáticos, inclusive pueden proporcionar colores derivados de la destilación de la hulla o carbón. distintos (metacromasia) a determinados componentes Genéricamente se les conoce como colorantes derivados de citoplasmáticos como las granulaciones específicas de los la anilina. granulocitos (cierto tipo de leucocitos). Forman parte de las fórmulas colorantes para frotis de Los colorantes artificiales son sales. Son compuestos sangre como los colorantes de Wright, May Grünwald, orgánicos formados por las modificaciones que experimenta Giemsa, Leischman, etc. el anillo bencénico cuando se reemplazan dos átomos de hidrógeno por un átomo de oxígeno o con otro átomo o por d) Indiferentes.- No forman sales. Son compuestos no un grupo químico que tenga enlaces de doble valencia en iónicos incapaces de la disociación electrolítica. vez de uno, dando como resultado un compuesto coloreado. Son insolubles en agua pero solubles en solventes orgánicos La anilina es incolora, pero las modificaciones químicas como el alcohol y también en las grasas o lípidos y, aunque producidas en el anillo bencénico le confieren, a los ellos poseen color, en realidad estrictamente hablando no compuestos nuevos, un color determinado. son colorantes. Los colorantes artificiales y sintéticos se clasifican en: Basándose en que son solubles en las grasas, estas sustancias se utilizan para demostrar la presencia de ellas en células y tejidos, pues tiñen selectivamente a los lípidos. a) Acidos: son sales cuya parte básica es incolora y el Los ejemplos son: El sudan negro, el sudán III y el sudán componente ácido posee color. Así, en el colorante IV, El rojo oleoso. eosina o eosinato de sodio, la propiedad colorante se debe al ácido eosínico y no a la base, el sodio. Los colorantes ácidos tienen carga eléctrica negativa, por lo tanto la designación correcta es la de colorantes aniónicos. También se les conoce como colorantes citoplasmáticos, pues tiñen al grupo químico, cargado eléctricamente, localizado en un extremo de la cadena de aminoácidos que integran las proteínas citoplasmáticas. Las sustancias que atraen eléctricamente a los colorantes ácidos se denominan “acidófilas” y químicamente están constituidas por componentes básicos o alcalinos. Ejemplos: la eosina, el amarillo de metanilo, la fucsina ácida, el ácido pícrico, el verde rápido, el naranja G, la safranina, el azul de anilina, etc. b) Básicos. Son sales que poseen la base coloreada e incolora la porción ácida; por ejemplo, el azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno, debe su Fig Tec. de Tinción: a) Dibujo esquematico de la metacromasia, propiedad colorante a la base azul de metileno y no al agregación de las moléculas colorantes sobre superpie de un polimero ácido clorhídrico que es incoloro. de alto peso molecular 10 Clasificación de las coloraciones. Existen procesos a través de los cuales células y tejidos son coloreados por las sustancias colorantes. De acuerdo a ellos, las coloraciones se clasifican en: a) Coloración directa o sustantiva. Se denomina así a la tinción que se ejerce sobre células y tejidos cuando éstos se ponen en contacto con la solución colorante, el resultado indica una verdadera afinidad entre el tejido y el colorante. Ejemplo: la tinción de los núcleos por el azul de metileno. Fig Tec de tinción: Método de Mallory (tinvión selectiva) b) Coloración indirecta o adjetiva. Para que lleve a Sucesiva, Consiste en aplicar a los tejidos soluciones efecto la coloración es indispensable recurrir al empleo sucesivas de varios colorantes, con la finalidad que de sustancias intermediarias que faciliten la adhesión ciertos componentes se tiñan con algunos de ellos. El del colorante en las estructuras tisulares. La sustancia ejemplo más demostrativo es la coloración de intermediaria que se utiliza se denomina “mordiente”. hematoxilina. eosina, en ella los núcleos se tiñen con El mordiente se aplica antes de la utilización de la la hematoxilina y después la eosina se encarga de solución colorante o puede formar parte de ella. La colorear al citoplasma. combinación que se efectúa entre el mordiente y el colorante se denomina “laca”. La mayoría de las g) Coloración ortocromática. Es la acción de tinción que soluciones colorantes de hematoxilina requieren de un ejerce un colorante al colorear una determinada mordiente para que aquella proporcione color. estructura con su propio color. La gran mayoría de los colorantes producen coloración ortocromática. c) Coloración progresiva. Se refiere a la marcha misma de la coloración. Los tejidos se ponen en contacto con h) Coloración metacromática. Es la tinción en la cual, un la solución colorante para que, conforme transcurre el colorante además de ceder su propio color a una tiempo de coloración, el tejido, de manera progresiva, estructura celular o tisular también tiñe de color distinto alcance la intensidad de tinción deseada; en ese a otras estructuras. La tionina y el azul de toluidina momento se detiene la coloración mediante lavado y la colorean de azul a los núcleos y a otras estructuras eliminación del colorante sobrante. basófilas pero, al mismo tiempo, ciertos componentes tisulares como la mucina, la matriz cartilaginosa o el d) Coloración regresiva. En este caso los tejidos se ácido hialurónico se tiñen de violeta o rosado. sobrecolorean con el colorante para someterlos después a la acción de una sustancia denominada diferenciador, éste extrae parte del colorante y, mediante la observación al microscopio, se detiene el proceso de diferenciación cuando los componentes alcanzan la tinción deseada. e) Coloración simple. Es el procedimiento en el que se utiliza un solo colorante para teñir algún componente celular o tisular. Por ejemplo, teñir los núcleos con tionina. Fig Tec de tinción: Medula espinal teñida con Tionina. f) Coloración compuesta o combinada. Consiste en la i) Coloración pancromática. Es producida por la aplicación, a una muestra de tejido u órgano, de varios actividad tintorial de los colorantes neutros. En este colorantes con la finalidad de destacar, mediante caso, las porciones básicas y ácidas ejercen su acción de colores diferentes, estructuras específicas que forman tinción pero, además ciertos componentes celulares se parte de ella. Puede ser: tiñen de colores diferentes a los originales adquiriendo Simultánea, cuando en una misma solución de tonalidades que resultan de la mezcla de ellos. coloración se mezclan varios colorantes. En este caso los tejidos reciben la tinción en un solo evento, El ejemplo más evidente de esta coloración se produce Ejemplos: las soluciones colorantes de algunos cuando se tiñen frotis de sangre. La utilización de las tricrómicos como el de Van Gieson (fucsina ácida y soluciones colorantes de Wright, May Grünwald, Giemsa o ácido pícrico) o el de Mallory (azul de anilina y Leischman hace que las plaquetas y los leucocitos naranja G) o el de Shorr ( verde brillante, fucsina (granulocitos y mononucleares) muestren granulaciones ácida y naranja G). específicas e inespecíficas fácilmente diferenciables por esta capacidad pancromática del colorante. 11 COLORACION DE HEMATOXILINA -EOSINA 7. Colorear con una solución alcohólica o acuosa de (H&E) eosina------------------------------------------ 3 a 5 minutos La coloración de hematoxilina - eosina se considera como la técnica de tinción de uso más frecuente en el estudio de 8. Deshidratar en baños crecientes de alcohol etílico células y tejidos, a través del microscopio fotónico. - alcohol de 70o ------------------------------- 1 minuto - alcohol de 95o -------------------------------1 minuto Consiste en la tinción de: - alcohol de 95o --------------------------------1 minuto a) los núcleos mediante una hematoxilina, previamente - alcohol absoluto (100o ) --------------------1 minuto oxidada y transformada en hemateina a la que se le - alcohol absoluto (100o) ---------------------2 minutos añade una sustancia mordiente para formar una laca (para tal fin se usan sales metálicas de aluminio, plomo 9. Diafanizar o aclarar empleando xilol o fierro). Los núcleos se colorean de azul, azul - xilol ------------------------------------------- 1 minuto morado, violeta, pardo oscuro o negro, dependiendo de - xilol ------------------------------------------- 2 minutos los agentes oxidantes y mordientes que se utilizaron. En estas condiciones los tejidos están preparados para b) el citoplasma y material extracelular utilizando la realizar en ellos el montaje. eosina que les confiere diversos grados de color rosado. El procedimiento de coloración de H & E es el siguiente: 1. Desparafinar los cortes en - xilol -------------------------- 3 minutos - xilol -------------------------- 3 minutos Fig Tec de Tinción: gamas de color del método de tinción H&E 2. Hidratar los cortes en baños decrecientes de alcohol - alcohol absoluto (100o) ------3 minutos F) MONTAJE. - alcohol absoluto (100o) ------ 3 minutos Concluido el proceso de la tinción de los cortes, éstos - alcohol de 95o ---------------- 3 minutos se deben colocar en condiciones de protección y de - alcohol de 95o ----------------- 3 minutos poderlos utilizar infinidad de veces sin que se - alcohol de 70o ----------------- 3 minutos deterioren. Para alcanzar tales propósitos se recurre al - agua corriente ----------------- 5 minutos. último procedimiento que es el montaje. - agua destilada (2 baños)-------1 minuto (cada uno) Este procedimiento consiste en colocar encima del corte 3. Colorear con la solución de hematoxilina. En este paso coloreado y diafanizado una gota de una sustancia es conveniente respetar el tiempo de coloración que adherente, diluida, generalmente en xilol (resina natural recomienda cada tipo de solución de hematoxilina. como el bálsamo de Canadá o resinas sintéticas, cuyos Dependiendo de la fórmula de preparación el tiempo índices de refracción son similares a los del vidrio) y encima puede variar de 3 a 20 minutos. de ellos, una laminilla cubreobjetos, cuidando que no La hematoxilina de uso más frecuente es la queden burbujas de aire entre la resina. hematoxilina alumínica de Harris -------3 a 5 minutos A continuación se deja que el xilol se evapore, y la resina 4. Lavado en agua destilada (2 baños)------un minuto adquiera solidez suficiente; para ello las láminas se colocan cada uno. en una platina caliente ( 45o 50o C) durante 24 a 48 horas y estarán listas para ser observadas. 5. Diferenciar, para eliminar el exceso de colorante, se emplea el alcohol ácido, hasta que los núcleos y los Existen otros procedimientos en la técnica histológica que componentes basófilos de las células sean lo únicos que permiten la observación de células y tejidos en los cuales no permanezcan teñidos se utilizan colorantes naturales y/o artificiales. Estos - lavar en agua corriente----------------- 2 minutos procedimientos emplean sales de metales pesados, los cuales se contacto con los componentes celulares y tisulares 6. Virar al color azul, empleando soluciones de: y a través, de sustancias reductoras u oxidantes se depositan Sustancias alcalinas como agua amoniacal en algunas de ellas (precipitación o impregnación). Al Solución de bicarbonato de sodio al 2% conjunto de procedimientos se les conoce como Carbonato de litio al 1%. impregnaciones metálicas - lavar en agua corriente -------------------- 5 minutos - lavar en agua destilada (2 baños ) -------1 minuto c/u. 12