Tutorat Santé Bobigny Ronéo 1 Biologie Cellulaire PDF

TUTORAT SANTE BOBIGNY RONEO N°1 Semaine du 23/09/2024 au 27/09/2024 Licence Accès Santé “Les rêves sont toujours des départs” Sommaire : Socle Biologie cellulaire Cours 1 : Généralités sur la cellule Cours 2: In...

TUTORAT SANTE BOBIGNY RONEO N°1 Semaine du 23/09/2024 au 27/09/2024 Licence Accès Santé “Les rêves sont toujours des départs” Sommaire : Socle Biologie cellulaire Cours 1 : Généralités sur la cellule Cours 2: Introduction et techniques d’études Biochimie Cours 1, Partie 1: Acides aminés Cours 2, Partie 2: Acide aminés Cours 3: Introduction à la Bioénergétique SHS Cours 1 HSM: Science et médecine, approche historique et sociologique Cours 1 Droit : Droit des patients  Socle “Celui qui déplace une montagne commence par déplacer de petites pierres.” CONFUSIUS  UE BIOLOGIE – SOCLE COMMUN Biologie Cellulaire 01 - Généralités sur la cellule Points clés ❖ Les valeurs numériques sont à apprendre ❖ Savoir comparer la taille de différents éléments (plus grand/plus petit) ❖ Les dates des découvertes sont à connaître et faire attention à pouvoir les situer dans le temps (siècles) ❖ Certaines notions seront approfondies au fur et à mesure des cours donc ne pas s’inquiéter si certaines choses vous paraissent encore vagues  Biologie Cellulaire Tutorat 01 – Généralités sur la cellule Santé Bobigny PLAN DU COURS I. Généralités sur la cellule comme unité du vivant, la théorie cellulaire A. Chronologie II. Généralités sur les ordres de grandeurs en Biologie A. Outils pour observer B. Ordres de grandeur d’éléments biologiques III. Deux types d’organisation cellulaire : les eucaryotes et les procaryotes A. Organisation de la cellule procaryote B. Organisation de la cellule eucaryote Université 2 sur 8 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 01 – Généralités sur la cellule Santé Bobigny → Il faut connaître les possibilités et les limites de l’outil pour connaître les bons résultats I. GÉNÉRALITÉS SUR LA CELLULE COMME UNITÉ DU VIVANT : LA THÉORIE CELLULAIRE A. Chronologie Date Chercheur Découverte ❖ Introduit la notion de cellule. ❖ Microscopiste qui cherchait à savoir pourquoi les bouchons de lièges étaient efficaces. Robert 1665 Hooke ❖ Observation de tranche de bouchon de liège très fine grâce à un microscope qui venait (1635-1703) d’être fabriqué. Obtention d’une image en nid d’abeille qui lui a rappelé la structure que pouvaient avoir les cellules occupées par les moines dans les monastères. Invention de la terminologie “cellule”. 1675 / ❖ Invention du microscope Schleiden ❖ Proposent 2 principes : 1830 (1804-1881) ① Tous les organismes sont constitués d’une ou plusieurs cellules. Schwann ② « La cellule est l’unité structurale et fonctionnelle des plantes et des animaux ». (1810-1882) 1855 Rudolf L. K. ❖ Propose un 3ème principe : Virchow ③ « Une cellule ne peut provenir que de la division d’une cellule déjà existante ». (1821-1902) → Il met alors à mal la théorie de la génération spontanée. ❖ Fabrication des lentilles qui ont permis au microscope optique d’améliorer sa 1886 résolution. Karl Zeiss (1816-1888) ❖ D’où la possibilité à la fin du XIXème siècle de faire de la description de cellules et de tissus en microscopie optique. 1850 à / ❖ Amélioration des outils et des techniques de préparation, de coloration, de mise en 1900 évidence des structures en microscopie optique. C’est l’âge d’or de ce domaine. ❖ En même temps que l’outil s’est amélioré, il y a une amélioration des techniques de coloration qui permettaient d’observer des tissus biologiques. Golgi (1843- 1926) ❖ Naturellement, à part quelques exceptions, le tissu biologique n’est pas coloré. Il faut Fin XIXe et Cajal donc pour pouvoir les observer au microscope, que ceci soit manipulé avec un certain (1852-1934) nombre de colorations spécifiques. prix Nobel en ❖ Golgi et Cajal ont mis au point la technique d’imprégnation à l’argent qui permet de 1906 mettre en évidence de nombreuses structures à l’intérieur même des cellules (naturellement non observables) : appareil de Golgi. ❖ En particulier Santiago Ramon y Cajal a permis la description d’un certain nombre de structures au niveau du cerveau, notamment les neurones. Université 3 sur 8 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 01 – Généralités sur la cellule Santé Bobigny I. GÉNÉRALITÉS SUR LA CELLULE COMME UNITÉ DU VIVANT : LA THÉORIE CELLULAIRE A. Chronologie (Suite) Date Chercheur Découverte ❖ Mise au point du microscope à contraste de phase 1930 / ➔ Permet d’observer des cellules vivantes. ❖ Construction du premier microscope électronique à transmission (MET). Amélioration de la résolution 1931 / A permis une description des cellules et des tissus qui ont permis de répondre à de nombreuses questions posées à cette époque-là à propos de la biologie cellulaire. ❖ Les premières publications de descriptions de la cellule ne sortiront qu’en 1945. ❖ Mise en place de la réaction Antigène/Anticorps encore utilisée de nos jours, celle- ci 1941 A.H. Coons permet la localisation des molécules au sein des tissus, c’est l’immunofluorescence. ❖ Mise au point du microscope confocal. 1988 / Permet d’observer les cellules avec des résolutions bien meilleures que les précédents microscopes optiques. ❖ Les connaissances que nous avons aujourd’hui dans le domaine de la biologie De nos cellulaire sont directement liées aux techniques et aux outils qui ont été développés jours / en parallèle et qui ont permis d’avoir des informations nouvelles et régulières sur l’organisation des cellules et leur fonctionnement. ❖ Mise en évidence de nouveaux microscopes en particulier les microscopes à effet tunnel, les microfaisceaux laser. II. GÉNÉRALITÉS SUR LES ORDRES DE GRANDEURS EN BIOLOGIE A. Outils pour observer ❖ Il faut des outils adaptés pour observer en biologie cellulaire : Certains éléments peuvent s’observer à l’œil nu (ce qui est en rouge sur l’image) Pour les éléments un peu plus petits (en vert sur l’image), il faut un microscope optique Pour les plus petits éléments (en violet), il faut utiliser un microscope électronique. Université 4 sur 8 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 01 – Généralités sur la cellule Santé Bobigny II. GÉNÉRALITÉS SUR LES ORDRES DE GRANDEURS EN BIOLOGIE B. Ordre de grandeur d’éléments biologiques Outils servant Échelle Éléments biologiques à visualiser ❖ Neurones : Dans l’organisme, les cellules les plus longues sont certains Mètre (m) neurones moteurs. Œil nu Peuvent avoir des prolongements (= Axones) qui peuvent aller jusqu’à 1 mètre de longueur ou plusieurs dizaines de centimètres. Ce sont les cellules humaines les plus longues. Centimètre ❖ Cellules musculaires striées squelettiques : Cellules multinucléées = jusqu’à (cm) 15 cm de long voir un peu plus (dépend du muscle) Micromètre ❖ Ovocyte : gamète femelle qui est une cellule mononuclée = 100 µm = 0,1 (µm) mm ❖ Adipocytes : Cellules chargées de stocker les lipides = jusqu’à 80 µm → Les éléments en micro et en nano sont de l’ordre de “l’infra cellulaire” ❖ La majorité des cellules chez l’Homme = 10-30 µm de diamètre Microscope Micromètre ❖ Globule Rouge (GR) = 7 µm de diamètre, peut servir de repère car taille optique des GR assez constante. Utilisé comme repère par les (µm) anatomopathologistes. ❖ Noyau = 4-5 µm (variable selon les types cellulaires) ❖ Mitochondrie : De l’ordre du µm ou légèrement inférieur et jusqu’à 3 µm. Micromètre ❖ Lysosomes : Leur diamètre est en moyenne de 0,1 µm et peut atteindre (µm) plusieurs µm en fonction du type de cellule (plus gros dans les Microscopie macrophages, jusqu’à plusieurs microns en fonction des cellules). électronique contiennent des enzymes responsables de la dégradation à l’intérieur des cellules. Nanomètre ❖ Ribosomes : 10aine de nm. (nm) ❖ Épaisseur de la membrane plasmique : 7,5 nm. Molécule ❖ Atome Angström (Å) ❖ L’Angström correspond à 10-10 m Université 5 sur 8 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 01 – Généralités sur la cellule Santé Bobigny III. DEUX TYPES D’ORGANISATION CELLULAIRE : LES EUCARYOTES ET LES PROCARYOTES ❖ Dans le monde du vivant, il existe deux types d’organisation cellulaire : Les Procaryotes (sans noyau) = Bactéries, certains virus Les Eucaryotes (avec noyau) ❖ Au cours de l’évolution est apparue une structure appelée membrane qui différencie les Procaryotes (sans noyau) des Eucaryotes (avec noyau). III. DEUX TYPES D’ORGANISATION CELLULAIRES : LES EUCARYOTES ET LES PROCARYOTES A. Organisation de la cellule Procaryote ❖ Organisme vivant possédant de l’information génétique en général de l’ADN circulaire non délimité par définition par une membrane ❖ L’information génétique des Procaryotes est située dans une zone appelée nucléoïde. ❖ Relativement simple en comparaison des cellules Eucaryotes. ❖ Possède une membrane, potentiellement une paroi en fonction des types de bactéries. ❖ De plus, suivant le type de bactérie, elle peut présenter des excroissances telles que des flagelles qui lui permettent de se mouvoir ou encore des pilis (= sorte de poils autour de la bactérie). ❖ Possèdent en général des métabolismes autonomes qui leur permettent de produire de l’énergie et de se reproduire. ❖ Leur forme (forme de bâtonnet, sphérique…) est assez variable en fonction de la bactérie étudiée. ❖ On a ci-dessous une photo de bactérie allongée, obtenue grâce à la microscopie électronique. ❖ On peut y observer de l’ADN (nucléoïde bactérien), des petites granulations (ribosomes) et tout autour une paroi relativement épaisse apparaissent en foncé sur cette photographie. Université 6 sur 8 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 01 – Généralités sur la cellule Santé Bobigny III. DEUX TYPES D’ORGANISATION CELLULAIRES : LES EUCARYOTES ET LES PROCARYOTES B. Organisation de la cellule Eucaryote (avec noyau) ❖ Structure beaucoup plus complexe que celle de la cellule procaryote. ❖ Entourée par une membrane plasmique qui d’une certaine manière isole l’intérieur d’une cellule de son environnement. ❖ La membrane sert non seulement à isoler la cellule de l’extérieur mais elle a aussi des activités physiologiques importantes notamment des échanges avec le milieu extérieur par des mécanismes particuliers qui lui sont propres ou par des modifications de sa forme via : L’endocytose (= perte de membrane) : entrée des différentes molécules et matériaux L’exocytose (= gain de membrane) : sortie des molécules vers l’extra-cellulaire. ❖ La membrane plasmique permet un certain nombre d’interactions avec le milieu environnant en formant : Des jonctions entre cellules ou directement avec ce qui l’entoure (MEC = Matrice Extra-Cellulaire (cours ultérieur)). Ces jonctions permettent aux cellules d’adhérer entre elles mais également de communiquer. ❖ L’intérieur de la cellule est composé de plusieurs types d’organites détaillés dans le prochain tableau. ❖ Ci-dessus (à gauche), est représentée une photo en microscopie électronique d’une cellule Eucaryote animale. ❖ On repère bien à l’intérieur de cette cellule, en très foncé, le nucléus = le noyau ❖ On voit les petites vésicules comme les lysosomes ❖ On peut observer des empilements de saccules qui correspondent à l’appareil de Golgi ❖ Tout cela étant entouré par la membrane plasmique ❖ Nous voyons également un certain nombre de mitochondries qui sont caractéristiques avec leur double membranes et surtout l’apparition de crêtes à l’intérieur de la mitochondrie. ❖ Enfin, il existe dans la cellule des structures qui correspondent à des éléments du cytosquelette (que nous reverrons) comme les centrioles. Le centriole est à l’origine des éléments du cytosquelette. Université 7 sur 8 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 01 – Généralités sur la cellule Santé Bobigny III. DEUX TYPES D’ORGANISATION CELLULAIRES : LES EUCARYOTES ET LES PROCARYOTES B. Organisation de la cellule Eucaryote (avec noyau) (Suite) ❖ Structure de la cellule entourée de 1 ou 2 membranes Les organites ❖ Ex : Les mitochondries ❖ L’une de ses particularités est qu’il est entouré d’une enveloppe elle-même constituée de deux membranes (constituants similaires à ceux de la membrane plasmique), protégeant d’une certaine manière le matériel génétique sous forme d’ADN. ❖ L’apparition de cette enveloppe au cours de l’évolution autour du matériel génétique a permis de diviser le monde vivant en deux grands types d’organisations (les Procaryotes et les Eucaryotes). ❖ Contient le matériel génétique sous forme d’ADN. Cet ADN est lui- même sous forme Le noyau de chromatine dans une cellule qui n’est pas en division. ❖ Il existe deux types de chromatine : L’hétérochromatine, dense en électrons, apparaît noire en microscopie électronique. L’euchromatine, apparaît très claire en microscopie électronique ❖ On y retrouve également le nucléole qui correspond à la mise en commun de partie de certaines molécules d’ADN de certains chromosomes ❖ Sorte de gel qui contient de très nombreuses inclusions cytoplasmiques, parmi Le cytoplasme lesquelles on peut citer les réserves sous forme de sucres (ex : Glycogène), ou encore des protéines (qui constituent le cytosquelette (vu dans un cours ultérieur)) ❖ Elles sont entourées d’une double membrane et ayant pour principal fonction la Les production d’énergie. mitochondries ❖ Interviennent aussi dans un certain nombre de synthèses. ❖ Il peut prendre deux aspects : (1) Réticulum endoplasmique rugueux (REG) = recouvert de ribosomes Impliqué dans la synthèse des protéines et est en continuité avec l’enveloppe nucléaire. Le réticulum (2) Réticulum endoplasmique lisse (REL) = absence de ribosome à sa surface Rôle plutôt dans la synthèse des lipides ⇒ CES DEUX RÉTICULUMS PEUVENT ÊTRE EN CONTINUITÉ. ❖ Structure sous forme de sacs plus ou moins empilés (nombre de sacs variable selon le type cellulaire). L’appareil de ❖ Intervient dans la maturation des protéines synthétisées dans le REG Golgi Donc un certain nombre de protéines vont être modifié au cours de leur passage dans l’appareil de Golgi. Les vacuoles ❖ Volumineuses dans les cellules végétales, plus petites dans les cellules animales. ❖ Sacs dans les cellules qui contiennent des enzymes qui permettent de dégrader le matériel en provenance de l’extérieur Les lysosomes Recyclage ou élimination d’éléments étrangers). ❖ Permettent également d’éliminer des produits de la cellule elle-même = mécanisme d’autophagie L’autophagie concerne les structures en fin de vie ou défectueuses. Université 8 sur 8 Sorbonne Paris Nord  UE BIOLOGIE – SOCLE COMMUN Biologie cellulaire 02 – TECHNIQUES D’ÉTUDES DE BIOLOGIE CELLULAIRE Points clés ❖ La définition du pouvoir de résolution ❖ Les différents échantillons utilisables ❖ Les structures des différents microscopes et leurs utilisations (surtout MO et MET) ❖ Les principes et applications des différentes techniques non morphologiques  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny PLAN DU COURS I. Techniques morphologiques A. Introduction B. Les microscopes 1. Les microscopes optiques ou photoniques a. Microscopes optiques standards b. Microscope à contraste de phase c. Microscope à fluorescence 2. Microscope électronique a. Microscope électroniques à transmission (MET) b. Microscope à balayage (MEB) 3. Microscope confocal (1988) C. Etude in situ des constituants biochimiques 1. Immunohistologie 2. Hybridation in situ 3. Autoradiographie II. Techniques non morphologiques A. Cytométrie de flux B. Fragmentation subcellulaire par centrifugation différentielle C. Fabrication d’anticorps monoclonaux D. ELISA E. Chromatographie F. Electrophorèse G. Autres techniques Université 2 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny I. Techniques morphologiques A. Introduction ❖ Cellules invisibles à l'œil nu. ❖ Apparition de la nécessité d’un certain nombre d’outils Début de la microscopie permettant l’observation de l’infiniment petit. ❖ Mise au point des premiers microscopes : optiques ou photoniques puis microscopie électronique ❖ Définition : Plus petite distance observable entre 2 points sans qu’ils soient confondus. ❖ Ainsi, plus D est petit, plus le microscope est puissant. ❖ Doeil = 0,2 mm Formule : Le pouvoir de résolution (D) ❖ N = Indice de réfraction du milieu, entre la préparation et l’objectif (ex : N = 1 pour l’air, N = 1.5 pour l’huile) ❖ λ (lambda) = Longueur d’onde du faisceau ❖ α (alpha) = Moitié de l’angle du cône de lumière qui entre dans l’objectif (meilleur angle pour α = 70°) ❖ Permettent d’observer des cellules et des tissus : préparation indispensable pour observer dans des conditions qui doivent être les plus proches de celles Technique du vivant. morphologique ❖ Nécessité de développer des techniques de préparation des cellules et des tissus : préparation indispensable à leur observation. => Appellation : Imagerie cellulaire ❖ Description morphologique des structures microscope optique (photons) microscope électronique (électrons) Imagerie cellulaire ❖ Etudes in situ des constituants biochimiques Histochimie (réaction chimique) Histoenzymologie (réaction enzymatiques ❖ Analyses moléculaires in situ protéines (immuno-histologie) acides nucléiques ( hybridation in situ) macromolécules (autoradiographie) Université 3 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny I. Techniques morphologiques B. Les microscopes 1. Microscopie optique ou microscopie photonique ❖ Cellules vivantes (ex vivo ou in vivo) : Culture de cellules dans des boîtes de pétri ou dans des tubes. Incubation à 37°, dans une atmosphère humidifiée (5% de CO2) Dans des milieux de culture adaptés à chaque type de cellule. En présence de nutriments spécifiques ou de facteurs de croissance. ❖ Échantillons cellulaires Ces échantillons sont obtenus auprès de cliniciens : en consultation, auprès d’un patient hospitalisé ou patient au bloc opératoire Liquide biologique sang moelle hématopoïétique LCR : Liquide Céphalo-Rachidien urines Liquide pathologique Les différents épanchement dans la plèvre échantillons épanchement du péritoine épanchement d’une articulation Liquide d’exploration lavage broncho alvéolaire… Brossage ou grattage frottis vaginal ❖ Échantillons tissulaires Biopsies faites lors d’opération ou de prélèvement pour des raisons de diagnostic, il peut s’agir d'organes entiers (ex : ganglions) Résections ❖ Étalement cellulaire sur lame On dépose une goutte de sang, que l’on étale avec une lamelle pour obtenir une unique couche de cellule (ex : frottis sanguin) puis visualisation au microscope. Possibilité de partir de suspensions cellulaires si la concentration cellulaire n’est pas trop grande. On dépose cette concentration cellulaire. Ensuite utilisation de l’évaporation : après avoir déposé une goutte on attend que cela sèche. Université 4 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny B. Les microscopes 1. Microscope optique ou photonique (suite) ⇒ 2 possibilités pour la fixation : ❖ 1ère possibilité (rapide) : 1) Congélation de la biopsie : azote liquide à -196°C en présence de cryoprotecteurs (limite la formation de cristaux de glace qui peuvent endommager les cellules). 2) Puis, coupe au cryostat : enceinte réfrigérée à -20/-30°C contenant des microtomes permettant d’obtenir des coupes de 5 à 10 µm. 3) Fixation puis coloration ❖ 2ème possibilité (plus longue) : 1) - Utilisation de fixateurs chimiques (aldéhydes : formaldéhyde = formol, glutaraldéhyde, osmium) - pour observer des cellules proches de l’état naturel : conservation plus longue et obtention de coupes plus fines (5µm) observables au microscope optique. - Même principe pour le microscope électronique, seules les substances d’enrobage et les outils vont différer. - Comme l’observation se fait à une échelle plus petite, la fixation doit être plus importante (utilisation d’un mélange de formaldéhyde et de glutaraldéhyde) 2) Puis, déshydratation, inclusion en paraffine liquide à 55-60°C (MO), en résine Congélation ou plastique (MET) Fixation 3) Refroidissement puis coupe avec microtome (microscope optique) ou ultra-microtome (microscope électronique) 4) Contraste fait avec de l’acétate d’uranyl ou du citrate de plomb (MET). ❖ Si on souhaite utiliser le MEB, avec souvent des échantillons massifs, il faut les métalliser ❖ Le but étant ainsi d’immobiliser les structures cellulaires dans une organisation aussi proche possible de l’état avant prélèvement, de leur vivant. Université 5 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny 1. Microscope optique ou photonique a. Microscope optique standard ❖ Source lumineuse : photons ❖ Principe : Faisceaux de photons traverse plusieurs lentilles de verres : Le condenseur L’objectif (grossissement x25, x40,x100) Compositions L’oculaire (grossissement x10) / Principe ❖ En tout on a donc un grossissement de l’image de l’ordre de 400x ❖ Comprend une partie mécanique, optique, source lumineuse ❖ Parfois, un appareil de capture d’image pour faire des photos et pouvoir stocker les observations ❖ On a une série de lentilles de verre Fonctionnement ❖ La source lumineuse est en général intégrée à la base du microscope, dans un faisceau qui va être condensé par une 1ère lentille de verre : le condenseur ❖ Puis, par deux autres lentilles : l’objectif et l’oculaire ❖ Déshydratation et inclusion en paraffine à chaud. La paraffine va entrer dans les tissus et remplacer l’eau et les différents solvants, refroidissement à une température de laboratoire (20°-25° voire moins) puis durcissement. Préparation ❖ Coupe : 5 µm ❖ Nécessité d’utiliser une préparation fine, quasiment transparente pour que la lumière puisse passer. ❖ Et nécessité d’augmenter les contrastes par une coloration (éosine, hémalun) car tissus biologique stress peu colorés. ❖ Pouvoir de résolution : D = 0,2 μm Résultats ❖ Observation : forme de la cellule, du noyau et de certaines structures à l’intérieur (mais pas aussi bien que le MET) Université 6 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny 1. Microscope optique ou photonique b. Microscope à contraste de phase ❖ Principe : Les différentes structures que l’on trouve dans une cellule vont dévier les ondes de manière différente. ❖ Si lorsque le faisceau traverse l’objet, les ondes sont déviées de la même manière, il y a augmentation de la brillance (les ondes sont en phase). ❖ Si lorsque le faisceau traverse l’objet, les ondes sont déviées de manière différente : il y a diminution de la brillance. ❖ Quand les ondes lumineuses traversent des objets ayant une certaine consistance, leur amplitude est diminuée, c’est ce qui crée l’image. Compositions ❖ Objet moins dense : amplitude peu changée mais phase / Principe modifiée, ce qui crée des interférences. Effets des interférences exploitées pour créer l’image. Préparation ❖ Aucune (ni coupe, ni fixation, ni coloration) ❖ Observation : organites et cellules en mouvement, Résultats division et même d’organismes vivants ❖ Inconvénient : moins de contraste que les autres microscopes Université 7 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny 1. Microscope optique ou photonique c. Microscope à fluorescence ❖ 2 Sources lumineuses : une lampe halogène et une lampe à arc (lampe à vapeur de mercure) qui permet d’exciter les fluorochromes. ❖ Principe : Permet de détecter des molécules fluorescentes qui ont la propriété d’absorber la lumière à une certaine longueur d’onde (λ1) pour restituer une lumière à une autre longueur d’onde supérieur (λ2). ❖ 2 filtres : Filtre d’excitation (dont la longueur d’onde d'absorption est la même que la longueur d’onde de la molécule fluorescente), va sélectionner une seule longueur d’onde Compositions Filtre d’arrêt qui laisse passer la lumière émise par la / Principe molécule fluorescente qui a été excitée par la lumière ❖ Nécessite un trajet optique avec différentes lentilles, prismes, cubes de fluorescence, objectifs, oculaires, miroir dichroïque, capteurs CCD… Préparation ❖ Marquage avec des molécules fluorescentes : Fluorescéine (absorbe dans le bleu et émet dans le jaune/vert) Rhodamine (absorbe dans le vert et émet dans le rouge) ❖ Observation : Peu détaillée et pas très bonne netteté (améliorée par déconvolution). Localisation de molécules marquées grâce à la fluorescence (fond noir) Résultat Non utilisé pour observer l’aspect général de la cellule ❖ Avantage : Prise en main facile rapide, acquisition d’image rapide ❖ Inconvénient : Microscope plus volumineux que les MO classiques, pas très net (mais possible de travailler sur les images avec des traitements) Université 8 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny 2. Microscopie électronique a. Microscope électronique à transmission (MET) ❖ Source lumineuse : faisceau d’électrons(Beaucoup plus pénétrant que les photons) ❖ Principe : Faisceau d’électrons traverse des lentilles électromagnétiques ❖ Vide extrêmement poussé à l’intérieur du microscope pour éviter toutes les déviations Composition / ❖ La moindre molécule de gaz dans la colonne du microscope pourrait modifier Principe l’axe du faisceau et empêcherait l’obtention d’une image de grande netteté ❖ Électrons arrivent dans toutes les directions et sont canalisés par un condenseur ❖ L’observation se fait sur un écran phosphorescent. ❖ Tension de 40 à 100 kVolt ❖ Observation sur un écran phosphorescent ❖ Échantillon fixé et mort ❖ Déshydratation et inclusion en résine plastique de type époxyaraldite (se Préparation polymérisent à 60°C) ❖ Coupe ultramince, 50 nm (à l’aide de couteau en diamant) ❖ Dépôt sur une grille de cuivre ou platine (2 mm de diamètre) ❖ Utilisation d’agents contrastants : métaux lourds (acétate d'uranyle, citrate de plomb) ❖ Pouvoir de résolution : D = 0,1 à 0,2 nm ❖ Observations : Résultats Image obtenue en noir et blanc Grossissement de 30 000, 50 000 voire 100 000 x Permet d’observer des structures infracellulaires Université 9 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny 2. Microscopie électronique b. Microscope électronique à balayage (MEB) ❖ Source lumineuse : électrons ❖ Principe : Faisceau d’électrons frappe la surface de l’échantillon qui va Compositions renvoyer des électrons / Principe car il est recouvert de métal. Les électrons arrivent sur un détecteur à scintillation. Le signal est ensuite amplifié par un photomultiplicateur. ❖ Tension entre 1 et 40 kV ❖ Échantillon doit être fixé et mort Préparation ❖ Pas de coupe ❖ Échantillon entier recouvert de métaux (carbone, or, platine) = métallisation ❖ Observation : Obtention d’image en relief Permet d’étudier la surface des objets Résultats Formes des cellules et des tissus Observation allant de particules à des petits insectes (organisme entier) Université 10 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny B. Les microscopes 3. Microscope confocal (1988) ❖ Source lumineuse : laser ❖ Principe : Même principe que pour le microscope à fluorescence classique Laser qui émet une longueur d’excitation grâce à un filtre d'excitation passe dans la préparation puis filtre d'arrêt et on obtient une image à partir de la longueur d’onde Compositions émise / Principe ❖ Microscope à fluorescence (marquage par des fluorochromes) avec faisceau laser qui stimule la fluorescence. ❖ Réalise lui-même des coupes optiques qui grâce à un travail sur ordinateur permettant la visualisation d’images 3D ❖ Les échantillons peuvent être plus épais que Préparation dans la microscopie à fluorescence classique. ❖ Observations : Localisation des molécules et netteté plus précises des molécules marquées Résultats Images vues en 3D Images obtenues dans un troisième plan (Z série). Microscope confocal = microtome optique pouvant permettre de déterminer si une molécule est dans la cellule et non sur la membrane plasmique. Images plus nettes qu’avec un microscope à fluorescence classique Université 11 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny I. Techniques morphologiques C. Études in situ de constituants biochimiques ❖ Principe : Localisation et détection de différents constituants des cellules ou des tissus (lipides, protéines, acides nucléiques …) à l’aide de réactions L’histochimie chimiques dans les cellules permettant la coloration de molécules : PAS = Acide périodique / réaction de Schiff Pour mettre en évidence des résidus glucidiques Feulgen-Rossenbeck Mise en évidence de molécules d’ADN (noyaux) ❖ Principe : Localisation des enzymes par réaction enzymatique (coloration) Technique en deux temps : 1) Incubation de la coupe (cellules, tissus) avec le substrat de l’enzyme à détecter 2) Révélation du produit de la réaction enzymatique L’enzyme recherchée est trouvée par son action sur un substrat (injecté au cours de l’expérience) qu’elle va transformer en un produit coloré visible si elle est présente ❖ Exemple : Peroxydase (enzyme) + DAB diaminobenzidine (substrat incolore) + H2O2 (catalyseurs) = coloration brune L’histoenzymologie ❖ Mise en évidence d’activités : Peroxydasique dans le foie Tyrosinase dans les mélanocytes ATPase dans les cellules musculaires Phosphatase acide dans les lysosomes ❖ Résultat : Observation au MO DAB est dense aux électrons donc possibilité d’observation au MET Université 12 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny C. Études in situ de constituants biochimiques 1. L’immunohistologie ❖ Localisation de molécules antigéniques Surtout protéines, glycoprotéines (pas trop les lipides et les glucides car ils Principe sont peu antigéniques) Par réaction/interaction antigène-anticorps directe ou indirecte On utilise des anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés spécifiquement contre l’antigène recherché. ❖ 3 Marquages possibles : Fluorochrome : fluorescéine (microscope à fluorescence) Enzyme peroxydase, phosphatase alcaline, même principe que Marquages l’histoenzymologie (MO/MET). Enzyme accrochée à son anticorps lui-même accroché à son antigène. On lui donne un substrat. Si l’enzyme est présente et à l’endroit où elle sera présente, cela va transformer le substrat en un produit coloré et que l’on peut observer. Billes d’or colloïdales (MO/MET) ❖ Directe : Anticorps couplé/marqué à objet visible, comme le fluorochrome (MO), enzymes ou à des billes d’or colloïdales (MET) ❖ Indirecte : Un anticorps primaire reconnaît l’antigène et plusieurs anticorps secondaires (provenant d’une autre espèce que le premier anticorps), Couplé à un marqueur, reconnaissent l’anticorps initial pour amplifier. Réaction directe Le second anticorps doit être capable de reconnaître le premier anticorps. ou indirecte Utilisé si antigènes en quantité peu importante, permet l’amplification du signal. ❖ Toutes ces techniques peuvent se faire sur des coupes au cryostat, voire au cryomicrotome (ME), des coupes en paraffine, des blocs avant inclusion standard, des coupes ultrafines après inclusion sur des résines hydrosolubles (MET). ❖ Le choix de la technique dépend de l’antigène, de sa localisation, de la quantité d’antigène présent dans une cellule. Université 13 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny C. Études in situ de constituants biochimiques 2. Hybridation in situ ❖ Localisation d’acides nucléiques à l’aide de l'hybridation de la séquence recherchée, avec une sonde complémentaire d’acide nucléique simple brin marqué. ❖ Basé sur l’affinité que peuvent avoir des chaînes d’acides nucléiques lors d’une réaction d’hybridation. Principe ❖ Principe identique à celui de la réaction antigène/anticorps, mais l’outil utilisé est une sonde complémentaire de l’acide nucléique recherché. ❖ Hybridation : ADN/ADN ; ADN/ARN ou ARN/ARN ❖ ADN bicaténaire, ARN monocaténaire, oligonucléotide: petites séquences obtenues par synthèse (ADN ou ARN). ❖ Sondes chaudes : utilisation d’isotopes pour marquer la sonde Différents types de (isotopes = radioactivité donc déchets embêtants et sondes règles de sécurité très contraignantes) ❖ Sondes froides : utilisation de fluorochrome ou biotine avidine (+ utilisé car moins coûteux et + facile à utiliser) On utilise plutôt des sondes froides pour des raisons de coût et de facilité d’emploi. Exemple ❖ Mise en évidence du gène qui code pour la protéine calbindin 28k (qui fixe le calcium) dans les neurones de Purkinje du cerebellum (cervelet) d’un cerveau de rat adulte. ❖ Informations sur l’expression des gènes. Recherche d’ARN Résultats messager. Possibilité de coupler cette technique avec de l’immunohistochimie pour mettre en évidence en même temps une protéine et son ARN messager ❖ Mise en évidence de la présence de gènes dans les tissus. Université 14 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny C. Études in situ de constituants biochimiques 3. Autoradiographie ❖ Suivi dans le temps de macromolécules à l’intérieur d’une cellule grâce à des précurseurs radioactifs. Si les précurseurs rentrent dans la constitution des protéines, quand la protéine sera créée, le précurseur sera incorporé dans la protéine qui deviendra radioactive. Principe ❖ Incubation d’un tissu avec une molécule radioactive. ❖ L’échantillon est ensuite plongé dans une émulsion photographique (durant quelques jours à quelques semaines) et révélé à l’abri de la lumière. ❖ Observation de grains d’argent réduits, argent métallique, sous la forme de points noirs. Résultat ❖ Détection et visualisation de la radioactivité introduite au sein de cellules ou de tissus au MO ou au MET ❖ Exemple : mise en évidence sur une cellule synaptique d’un neurotransmetteur présent dans une fente synaptique. A RETENIR : I. TECHNIQUES MORPHOLOGIQUES ❖ La définition du pouvoir de résolution ❖ Les différents échantillons utilisables ❖ La structure du microscope optique et son utilisation ❖ La structure du microscope électronique (MET et MEB) ❖ Les différents microscopes (fluorescence et contraste de phase) ❖ Les différentes techniques d’étude in situ des constituants biologiques Université 15 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny II. Techniques non morphologiques A. Cytométrie de flux (FACS) ❖ Objectif : Fait défiler à grande vitesse des cellules marquées avec des anticorps fluorescents afin de les différencier, de les trier et de les compter. Les anticorps reconnaîtront surtout des antigènes de surface, mais pas uniquement. La détection des Fonctionnement molécules fluorescentes se fait à travers des pipettes, dans lesquelles les cellules passent une à une. ❖ Principe : On va utiliser des anticorps couplés à des fluorochromes qui vont reconnaître soit un antigène intracellulaire, soit un antigène membranaire Un laser va venir exciter les fluorochromes des cellules marquées qui, elles, sont en suspension dans une gaine liquide d'entraînement. Un laser permet de trier les cellules en fonction de la fluorescence : elles passent une par une pour être triées (ex : rouge, verte, bleu, etc.) et comptées On leur applique ensuite un courant (en fonction de leur couleur) qui va permettre de les trier. ❖ Ce dispositif permet de dénombrer et de réaliser un tri cellulaire des molécules présentes dans ou en surface de la cellule sans pour autant détecter sa localisation ! ❖ On peut également avoir une idée de la quantification d’ADN. ❖ On l’utilise pour : Typage des leucémies Numération des sous populations lymphocytaires du sang Résultats Formule automatique du lavage broncho-alvéolaire Cycle cellulaire et ploïdie des tumeurs ❖ C’est donc une technique utilisée en pathologie mais aussi en laboratoire pour la recherche, notamment en hématologie pour le typage de leucémies (métabolisme cellulaire...). On peut aussi faire des numérations des populations lymphocytaires. ❖ Sur cette image on peut voir une mesure du nombre de quantité d’ADN avec un 1er pic avec des cellules avec 1 seule quantité d’ADN et un 2ème pic avec le double de cette quantité, qui peut permettre l’étude du cycle cellulaire, afin de détecter la présence d’aneuploïdies. Ici, on peut quantifier grâce à l’intensité de la fluorescence. C’est un moyen facile de faire de la quantification de cellules et de le rapporter à la quantité d’ADN. Université 16 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny II. Techniques non morphologiques B. Fragmentation subcellulaire par centrifugation différentielle ❖ Objectif : Permet d’isoler les différents constituants à l’intérieur d’une cellule, par un système de centrifugations successives d’un broyât de cellules. ❖ Principe : Réalisation d’une série de centrifugation A chaque centrifugation : on récupère le culot avec les différents constituants obtenus et on soumet de nouveau le surnageant à une centrifugation On va d’abord faire un homogénat qui sera soumis à différentes centrifugations Vitesse donnée en g (accélération de la pesanteur) : 10 minutes à 1000 g pour obtenir un surnageant qui contient les membranes et autres organites et un culot qui contient le noyau et des débris cellulaire Puis centrifugation du surnageant précédent pendant 20 min à 20 000 g = surnageant et culot qui contient les mitochondries, lysosomes et péroxysomes Fonctionnement Puis de nouveau centrifugation du surnageant précédent pendant 60 min à 80 000 g = surnageant qui contient essentiellement cytosol et culot qui contient des fragments du RE = microsomes Plus le temps et la vitesse seront augmentés et plus les organites de petite taille seront sédimentés dans le culot. ❖ Voici un schéma des différentes centrifugations réalisées : ❖ Utilisation des différents culots pour étudier les fonctions des différents Résultats constituants de la cellule (ex : test biochimique) Université 17 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny II. Techniques non morphologiques C. Fabrication d’anticorps monoclonaux Cette fabrication se fait en plusieurs étapes : ❖ 1) Immunisation de souris saines par différents antigènes Puis récupération de la rate de celles-ci pour en extraire les lymphocytes B (LB) Parallèlement : prélèvements de cellules malades chez une souris atteinte de myélome. On met ces cellules en culture. ❖ 2) Réalisation de fusions cellulaires multiples dont la plus intéressante : entre LB et cellules myélomateuses, car on va avoir une production d’anticorps suite au contact avec ces cellules de myélome. ❖ 3) Sélection des clones qui nous intéressent à savoir ceux pour lesquels on Fonctionnement a une production de l’anticorps recherché. ❖ 4) Amplification des clones sélectionnés ❖ 5) Pour finir on va : Soit injecter en intra péritonéal ces cellules clonales chez des souris puis récupérer le sérum (ex : liquide d’ascite) Soit récupérer directement les anticorps produits par les cellules et clones sélectionnés Université 18 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny II. Techniques non morphologiques D. ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) ❖ C’est un test immuno-enzymatique par réaction antigène-anticorps colorée Principe produite par l’action sur un substrat d’une enzyme préalablement fixée à un anticorps secondaire. ❖ On réalise ces expériences dans des petits puits de type boîte de culture. 1. Un antigène spécifique de l’anticorps est mis au fond des puits. ELISA indirecte On lave bien avant. 2. On va déposer au même endroit l’échantillon avec l’anticorps recherché, à savoir l’anticorps à doser : s’il est bien présent, il y aura liaison avec Dosage/recherche l’antigène du puits. d’un anticorps 3. Un 2ème anticorps cette fois-ci, lié à une enzyme catalysant la formation d’un produit coloré, est mis dans le puits afin d’aller se lier avec l’anticorps présent. 4. Quantification par colorimétrie, avec un spectrophotomètre. L’intensité de la coloration va dépendre de la quantité d’anticorps au départ. 1. Un anticorps spécifique de l’antigène est mis au fond des puits ELISA sandwich 2. On va déposer au même endroit l’échantillon avec l’antigène que l’on cherche à doser : s’il est bien présent, il y aura liaison avec l’anticorps du Dosage/recherche puits. d’un antigène 3. Un 2ème anticorps cette fois-ci, lié à une enzyme catalysant la formation d’un produit coloré, est mis dans le puits afin d’aller se lier avec l’antigène présent. 4. Quantification avec un spectrophotomètre. La coloration sera proportionnelle à la quantité d’antigène présent. Université 19 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny II. Techniques non morphologiques D. ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) (suite) ❖ Dosage anticorps/antigènes, permet de déterminer les concentrations sériques. ❖ Possibilité de réaliser une gamme étalon dans laquelle on a dilué l’antigène / l’anticorps recherché de manière à avoir une information quantitative. ❖ Exemples d’application : on peut identifier des sérums de patients, les anticorps anti-protéine de l’enveloppe du virus du VIH peuvent être mis en évidence… ❖ Avantages : Résultats Utilisation d’anticorps monoclonaux qui rendent la détection spécifique. Quantification : gamme étalon. L’utilisation d’anticorps secondaires rend la technique très sensible (faible quantité d’antigènes/anticorps). Facilement accessible aux biologistes. Détection du signal uniquement avec un spectrophotomètre. ❖ Inconvénients : Limite de détection : difficile de mettre en évidence une très faible quantité d’antigènes ou d'anticorps. Réaction enzymatique : rend la technique dépendante d’un certain nombre de facteurs : Température pH Eclairement… ❖ Utilisé par exemple sur sérums de patients pour détecter la présence d’anticorps anti-protéine de l’enveloppe du corps du VIH Université 20 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny II. Techniques non morphologiques E. La chromatographie ❖ Séparation d’un mélange de protéines à travers une colonne constituée de 2 phases : une mobile (liquide et mélange de molécules) et une fixe (papier, gel, cellulose...) : cela permet la purification d’une molécule. ❖ Dépôt d’un mélange de protéines au sommet d’une colonne contenant une matrice solide et perméable. ❖ Ajout d’un solvant en continu par le dessus de la colonne, ce qui va entraîner le mélange protéique vers le bas de la colonne. ❖ Les protéines du mélange migrent à des vitesses différentes (en fonction de la taille, de l’encombrement) Principe général Séparation des protéines. Récupération dans différents tubes. ❖ Des matrices sont utilisées pour séparer les protéines selon leur charge électrique, leur taille … Chromatographie ❖ Séparation des constituants du mélange sur une colonne remplie de sur gel ou billes poreuses (gel) : la séparation se fait uniquement en fonction de exclusion la taille ! ❖ Anticorps qui reconnaissent une protéine spécifiquement que l’on accroche dans la colonne. Quand on fait passer un mélange de protéines, elles vont être reconnues par Chromatographie l’anticorps et vont s’y d’affinité attacher. Celles qui ne sont pas reconnues passent à travers et sont récupérées. Puis on lave et on a dans la colonne des anticorps sur lesquels sont fixées les protéines reconnues. ❖ Fixation sur la phase fixe d’un constituant puis ajout d’une phase mobile avec laquelle le constituant a une certaine affinité : la séparation se fait uniquement en fonction de l’affinité ❖ Exemple : anticorps-antigène Université 21 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny II. Techniques non morphologiques F. L’électrophorèse Celle-ci se fait en plusieurs étapes : ❖ Dénaturation des protéines (purifiées auparavant par d’autres techniques) (perte de la structure tridimensionnelle) par chauffage avec du SDS, un détergent qui se fixe sur les protéines pour leur ajouter une charge négative ajout d’un agent réducteur pour détruire les ponts disulfures. ❖ On va déposer ces protéines (chargées négativement) en haut d’un gel de polyacrylamide. Passage d’un courant continu entre les extrémités du gel ce qui va faire migrer les cellules chargées négativement vers le pôle positif. La migration se fait aussi selon le poids moléculaire (les plus petites migrent plus vite, tandis que celles de poids moléculaire plus élevé seront plus lentes) ❖ Puis, soit : Fonctionnement Coloration au bleu de Coomassie pour rendre visible les protéines présentes dans l’échantillon. OU Transfert sur une feuille de nitrocellulose avec ajout d’un anticorps marqué spécifique de l’antigène recherché = Technique de Western Blot. ❖ Marqueurs de taille dans un puits à part. On peut avoir un mélange de protéines de poids moléculaire connu. Par analogie, on trouve le poids moléculaire de chaque protéine, après destruction des ponts disulfures. Université 22 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny II. Techniques non morphologiques G. Autres méthodes ❖ Radioactivité détection et suivi du devenir de molécules d’ADN ou de protéines ❖ Culture cellulaire primaire ou secondaire ❖ Fractionnement subcellulaire ❖ Biologie moléculaire : techniques d’extraction, de purification, de détermination des séquences PCR, RT-PCR, protéines et acides nucléiques ❖ Outils informatiques recherche dans les bases de données de séquences de protéine ou d’acides nucléiques ⇒ Nécessité de mettre en oeuvre plusieurs familles de techniques A RETENIR ❖ Les principes de différentes techniques ❖ Les applications de ces différentes techniques Université 23 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie Cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’études de Biologie Cellulaire Santé Bobigny Université 24 sur 24 Sorbonne Paris Nord  UE BIOLOGIE – SOCLE COMMUN Biochimie & Biologie moléculaire 01 – ACIDES AMINÉS 1/2 Points clés ❖ Connaître la structure et les propriétés des acides aminés ❖ Connaître les 9 acides aminés essentiels. ❖ BON COURAGE !!! ON CROIT EN VOUS !  PLAN DU COURS I. INTRODUCTION A. La cellule, lieu d’intégration spatiale, structurale et métabolique B. Les protéines II. Généralités A. Structure générale des acides aminés B. Classification C. Chaîne latérale III. Classification A. Acides aminés hydrophobes B. Acides aminés hydrophiles C. Acides aminés amphipathiques IV. Propriétés physiques A. Asymétrie B. Propriétés optiques C. Absorption moléculaire D. Polarité des acides aminés Université Sorbonne Paris Nord 2 sur 22  I. INTRODUCTION A. La cellule, lieu d’intégration spatiale, structurale et métabolique ♦ Ce sont des systèmes extrêmement compactés contenant de nombreuses structures biochimiquement différentes dans un univers très contraint. Intégration spatiale o Le cytoplasme de la cellule est un endroit rempli de molécules diverses (glucides, lipides, protéines). o Et toutes ces molécules vont interagir entre elles (grâce à leur affinité ou leur concentration suffisante). ♦ Les membranes sont constituées de molécules de compositions diverses : o Lipopolysaccharides (lipides associés à des glucides). o Lipoprotéines (lipides associés à des protéines). Intégration o Peptidoglycanes (peptides associés à des glucides) structurale ♦ Ces structures sont associées ensemble ce qui donne une richesse de biomolécules extrêmement importante. ♦ Les protéines peuvent être liées à des lipides et/ou des glucides qui en modifient les propriétés = multitude de combinaisons formant des molécules avec des activités biologiques différentes. ♦ Niveau fonctionnel. ♦ Par exemple à partir du glucose (et par le biais de phénomènes appelés interrelations métaboliques) et des différents composés qui proviennent de la dégradation du glucose on pourra former : o Des acides aminés Intégration métabolique o Des acides gras o Des précurseurs des acides nucléiques : ADN, ARN (pyrimidines) ♦ Puis le cycle de Krebs permet de générer : o Des acides gras o Des acides aminés o D’autres précurseurs dérivés de l’ADN o Dérivés précurseurs de l’hémoglobine. ♦ Tous ces métabolismes sont reliés les uns aux autres. Université Sorbonne Paris Nord 3 sur 22  I. INTRODUCTION B. Les protéines ♦ Les protéines sont composées d’acides aminés. o La nature et l’ordre dans lequel les acides aminés sont liés les uns aux autres vont conférer aux molécules des aspects différents. o L’ordre dans lequel les acides aminés sont liés les uns aux autres est appelé la séquence peptidique. ♦ Les acides aminés des protéines (21 acides aminés protéinogènes) sont très différents les uns des autres avec des propriétés différentes (acide, basique, soluble…) mais avec des affinités préférentielles les uns pour les autres. Agencement dans ♦ L’affinité entre certains acides aminés va favoriser le repliement de la chaîne l’espace protéique dans l’espace. Il va y avoir formation d’une structure dans laquelle les acides aminés éloignés les uns des autres dans la séquence peptidique vont se retrouvés rapprochés dans l’espace. ♦ Il y aura donc des côtés hétérogènes (charges différentes/ pas de charge des acides aminés) dans la molécule. ♦ Finalement cette protéine aura une identité propre qui lui permettra d'interagir avec des récepteurs à la surface des membranes qui lui seront spécifiques. ♦ L’insuline est une hormone permettant de diminuer le taux de sucre dans le sang en favorisant l’entrée de glucose dans les cellules. o Elle va agir sur des récepteurs spécifiques à l’insuline et possède une identité propre. o Son déficit dans l’organisme est associé à une pathologie : le Exemple de diabète. l’insuline ♦ Composition chimique de l’insuline : o Elle est composée de 2 chaînes : A et B, avec des structures propres à elles (insuline protéine globulaire). ♦ Et pourtant ces molécules sont associées entre elles par des liaisons covalentes résultant en la construction d’un édifice en 3D doué d’une activité biologique : une hormone. Université Sorbonne Paris Nord 4 sur 22  I. INTRODUCTION B. Les protéines (suite) Ce sont les macromolécules les plus polyvalentes dans la cellule. Elles ont des rôles : o De liaison : certaines vont pouvoir se fixer sur l’ADN et jouer un rôle dans la régulation de l’expression de gènes : on parle de facteur transcriptionnel. o Dans le métabolisme : l’insuline ou hormone de croissance. o De structure : l’actine (polymère de sous-unités) est une molécule qui compose les fibres musculaires. Rôle des protéines o De catalyseur biologique : sans les enzymes, il ne se passerait rien dans l'organisme. o De transport : cas de l’albumine (60g/L de sang) qui permet de transporter des hormones et d’autres types de composés. o De commutateurs de signalisation : rôle dans la transmission du signal d’un d’endroit de la cellule à un autre. Certaines protéines comme la protéine RAS (rôle dans la prolifération cellulaire) peuvent changer de structure avec une forme active et une forme inactive. En fonction des modifications subies, on o aura une structure différente mobile. Université Sorbonne Paris Nord 5 sur 22  II. GÉNÉRALITÉS A. STRUCTURE GÉNÉRALE DES ACIDES AMINÉS ♦ Les acides aminés sont constitués de molécules de carbone avec une structure tétraédrique. ♦ Les différents composés des acides aminés sont : o Un groupe carboxyle. Carbone α o Une fonction amine. o Un atome d’hydrogène. o Un groupe R (chaîne latérale). ♦ On a donc un carbone avec la possibilité de former 4 liaisons covalentes avec des groupements divers. ♦ On nomme les carbones à partir du Cα (carbone adjacent), Cβ, Cγ...Ce sont des acides α aminés. ♦ Fonction Acide : cède des protons dans le milieu et donc baisse le pH de la solution. o Donc la fonction carboxylique COOH va se dissocier dans la Rappels de Chimie nature en solution aqueuse et à pH physiologique (=7,4) pour devenir COO-. o Cette fonction est chargée négativement. ♦ Fonction Amine basique : captent des protons dans la nature à pH physiologique 7,4 et en solution aqueuse pour devenir NH3+. o Cette fonction est chargée positivement. Université Sorbonne Paris Nord 6 sur 22  II. GÉNÉRALITÉS A. STRUCTURE GÉNÉRALE DES ACIDES AMINÉS Tous les acides aminés ont des fonctions communes liées à cette structure générique. Et aussi des fonctions particulières qui dépendent de la nature de la chaîne latérale Les propriétés des chaînes latérales sont extrêmement importantes. Les 2 parties des acides aminés On doit donc séparer l’acide aminé isolé de l’acide aminé inclus à l'intérieur d’une protéine : - Quand il est isolé, les propriétés de cet acide vont dépendre de la fonction carboxylique, de la fonction amine et de la chaîne latérale. - Quand il est inclus à l’intérieur d’une chaîne protéique, les propriétés dépendent uniquement de la chaîne latérale. II. GÉNÉRALITÉS B. CLASSIFICATION ♦ Il existe 21 acides aminés protéinogènes. Acides Aminés ♦ Certains acides aminés vont dériver de quelques-uns des acides constituants aminés constituants les précédents = modifications enzymatiques post des protéines traductionnelles : o Modifications de type oxydation. o Proline peut être oxydée en Hydroxyproline o Lysine oxydée en Hydroxylysine o Cystéine peut être oxydée en Cystine ♦ Le 21ème acide aminé est la Sélénocystéine, découvert récemment, rare, elle est un analogue de la Cystéine dans lequel l’atome de Soufre est remplacé par un Sélénium (Se). Université Sorbonne Paris Nord 7 sur 22  II. GÉNÉRALITÉS B. CLASSIFICATION (suite) ♦ Ce sont des molécules qui appartiennent au métabolisme intermédiaire. Acides Aminés non ♦ Elles seront utiles à un moment donné pour faire des liens entre le métabolisme des constituants des acides aminés, son catabolisme, le métabolisme des glucides, des lipides … protéines ♦ Ces composés ont un rôle important car peuvent jouer le rôle de transfert (des groupements hydroxyles ou amines). o Exemple : la Citrulline (intervenant dans le cycle de l’urée). Elle ne sert pas à la synthèse protéique. ♦ Il en existe plus de 300. ♦ Il s’agit d’une molécule que l’Homme est incapable de synthétiser. ♦ Le corps humain ne sait pas synthétiser les noyaux aromatiques et les ramifications. Ils doivent donc être apportés par l’alimentation. Les 9 Acides Aminés ♦ Ils sont à connaître par cœur : indispensables o Histidine (HIS) pour l’Homme o Leucine (LEU) o Thréonine (THR) o Lysine (LYS) o Tryptophane (TRP) o Phénylalanine (PHE) o Valine (VAL) o Méthionine (MET) o Isoleucine (ILE) Moyen mnémotechnique : Hystérique le très lyrique Tristan fait vachement méditer Iseult AAs non ♦ Proviennent des interrelations métaboliques entre la glycolyse, la voie des pentoses indispensables phosphates et le cycle de Krebs. Université Sorbonne Paris Nord 8 sur 22  II. GÉNÉRALITÉS C. CHAINE LATÉRALE... ♦ Ici on s’intéresse aux propriétés physicochimiques des acides aminés liées à la nature de la chaîne latérale R (chaîne Radicalaire). … varie en fonction de ♦ Leur forme dans l’espace. ♦ Leur taille. ♦ Une variation de réactivité chimique et physique (basicité ou acidité) et … vont représenter donc la charge que va prendre la molécule. ♦ Une variation de solubilité dans l’eau et donc la polarité ♦ Certains sont plutôt à l’extérieur ou à l’intérieur de la protéine. ♦ D’autres au niveau du site actif des enzymes. … permet aux acides ♦ Certains au niveau du site d'interaction protéique entre : aminés de se spécialiser o Un antigène/anticorps o Une hormo