Fascicule Cours Biologie Cellulaire (Première Partie) PDF 2021-2022

UNIVERSITE HASSAN II FACULTE DES SCIENCES AIN-CHOCK- CASABLANCA. Filière : S.V /S.T.U Cours de : BIOLOGIE CELLULAIRE-S1 Pr. N. RHARBI Année Universitaire : 2020/2021...

UNIVERSITE HASSAN II FACULTE DES SCIENCES AIN-CHOCK- CASABLANCA. Filière : S.V /S.T.U Cours de : BIOLOGIE CELLULAIRE-S1 Pr. N. RHARBI Année Universitaire : 2020/2021 2021-2022 1  Plan du cours (première partie) I- Introduction à la structure cellulaire A- Historique : B- Définition de la cytologie et de la biologie cellulaire C- La notion du vivant : II- Organisation générale des cellules A- Les cellules eucaryotes 1- Cellule animale 2- Cellule végétale B- Les cellules procaryotes C- Comparaison entre une cellule eucaryote et une cellule procaryote 1- Ressemblances 2- Différences III- Composition chimique de la cellule A- Constituants minéraux 1- eau 2- Sels minéraux B- Les substances organiques 1- Glucides 2- Lipides 3- Protides 4- Acides nucléiques IV- Méthodes d’étude de la cellule A- Principes généraux de microscopie et microscopie optique 1- Le microscope à polarisation 2- Le microscope à contraste de phase 3- Le microscope à fluorescence B- La préparation des cellules et tissus pour la microscopie optique C- Microscope électronique 1- Microscope électronique à transmission 2- Microscope électronique à balayage D- Techniques de Fractionnement Cellulaire 2  1- Centrifugation 2- Electrophorèse 3- Chromatographie E- Marquage radioactif et autoradiographie 1- Technique de marquage radioactif 2- Détection de la radioactivité F- La culture cellulaire 1- Intérêt fondamental 2- Culture cellulaire 3- Conditions de culture 4- Immortalisation V- Membrane plasmique A- Fonctions des membranes biologiques B- Structure de la membrane plasmique C- Composition des membranes 1- Les lipides membranaires 2- Les protéines membranaires 3- Les glucides membranaires D- Propriétés générales des membranes 1- Fluidité membranaire 2- Asymétrie des membranes E- Transports à travers la membrane plasmique 1- Transports passifs 2- Transports actifs F- Transport cytotique 1- Endocytose 2- Exocytose G- Reconnaissance et adhérence cellulaire 1- Mécanismes 2- Rôles H- Jonctions cellulaires 1- D’ancrage 2- Communicantes ou jonctions de type gap 3- Serrées 3  Dans le cadre de ce cours, notre but premier sera d’enseigner une biologie cellulaire de base. Nous aborderons ainsi l'étude morpho-physiologique de la cellule en général, ce qui signifie que nous décrirons avec certains détails et nommerons les principales structures cellulaires, avant d'expliquer pour chacune d'elles leur fonctionnement, malheureusement souvent trop brièvement. Nous essaierons aussi de présenter et d’illustrer la dynamique qui anime les cellules et leurs composants. Pour atteindre ces buts, la relation intime qui lie chaque structure cellulaire à sa fonction sera privilégiée, sans oublier les interactions possibles de ces structures avec leur environnement immédiat. Toutefois, si à l'issue de ce cours les principales structures cellulaires auront été présentées et placées dans leur contexte microscopique, de très nombreuses notions nécessaires pour maîtriser la biologie cellulaire sous ses aspects les plus divers, moléculaires notamment, ne seront abordées qu’ultérieurement. CHAPITRE I : INTRODUCTION A LA STRUCTURE CELLULAIRE La cellule est l'unité fonctionnelle vivante, isolée de son environnement par une membrane plasmique. Cette notion dérive de la théorie cellulaire émise pour la première fois par Schleiden et Schwann en 1833. La théorie cellulaire se base sur plusieurs observations :  Tous les êtres vivants sont constitués d'une ou plusieurs cellules ;  Toute cellule provient d'une autre cellule par division cellulaire ;  La cellule est une unité vivante et l'unité de base du vivant, c'est-à-dire qu'une cellule est une entité autonome capable de réaliser un certain nombre de fonctions nécessaires et suffisantes à sa vie. Il est possible par exemple de cultiver des cellules in vitro en leur apportant les nutriments et le milieu convenable ;  Il y a individualité cellulaire grâce à la membrane plasmique qui règle les échanges entre la cellule et son environnement ;  La cellule renferme sous forme d'ADN de l'information nécessaire à son fonctionnement et à sa reproduction. Ces cinq points peuvent être résumés comme suit : La cellule est l'unité structurale, l'unité fonctionnelle et l'unité reproductrice. A- Historique : Il était difficile pour les gens d’imaginer l’existence d’organismes vivants trop petits pour être vus ou de croire qu’ils pouvaient porter atteinte à des hôtes de grande taille. La microscopie s’impose progressivement pour devenir une des principales techniques d’étude de la matière vivante et permettre la naissance de la biologie cellulaire : 4  XVII siècle: le microscope rend possible la découverte des cellules ; Hooke (1635-1702): premier microscope, décrit des cavités dans le liège: chambres « cellula » ; Van Leeuwenhoek (1632-1723) construit un microscope qui grossit 200X: peut voir les protozoaires; XIX siècle : Grossissement jusqu’à 1000X ; XX siècle : Microscopie électronique : détails intracellulaires. Représentation schématique d'une cellule B- Définition de la cytologie et de la biologie cellulaire - La cytologie (du cyto = la cellule et logos = étude) est l'étude de la structure et de la physiologie de la cellule en général, quelle que soit son origine ; - La biologie moléculaire et la biochimie : fonctionnement de la cellule ; - La biologie cellulaire (du bios = vivant et logos = étude) : utilise la cytologie, la biologie moléculaire et la biochimie pour étudier le fonctionnement intégré de la cellule. C- La notion du vivant : L’organisation d’un être pluricellulaire repose sur une hiérarchie de niveaux structuraux, chacun s’édifie à partir du niveau inférieur. Les atomes s’agencent en molécules complexes qui à leur tour forment des structures fonctionnelles appelées organites, qui sont les composants des cellules. Chez les organismes pluricellulaires, des cellules semblables se regroupent en tissus dont les arrangements particuliers forment les organes. Ces organes s’associent en systèmes pour assurer une fonction précise afin de permettre la survie d’un organisme. 5 Un assemblage judicieux et la capacité de communiquer ont abouti à la première cellule. Cette cellule occupe une place privilégiée dans la hiérarchie de l’organisation car elle est capable d’assurer toutes les activités liées à la vie et qui permettent sa croissance et sa reproduction. Mais une cellule n’existe pas seule : elle est dépendante de son environnement avec lequel elle interagit continuellement. Atome ↦ Molécule ↦ Organite ↦ Cellule ↦ Tissus ↦ Systèmes ↦ Organisme 6  CHAPITRE II : ORGANISATION GENERALE DES CELLULES On estime qu'il y a 3 x 1013 cellules dans le corps humain, subdivisés en 220 types différents, propres à autant de tissus. En effet, chaque type de cellule est propre au tissu dont il fait partie. Toutes les cellules contiennent certains composants fondamentaux communs, ce sont des éléments universels qui marquent leur présence dans n’importe quel organisme : Le génome, information génétique qui contient l'information permettant de coder les autres composants ; Le cytosol ou hyaloplasme renfermant les protéines, enzymatiques ou constitutives ; La membrane plasmique, qui isole la cellule de son environnement, agit comme un filtre ou un système de communication avec l'extérieur ; Les cellules ont également en commun certaines capacités telles que : La reproduction cellulaire, par division de la cellule ; Le métabolisme cellulaire, utilisant de la matière brute, pour convertir de l'énergie en énergie cellulaire (ATP) ; La synthèse des protéines, par la transcription de l'ADN en ARN puis par la traduction par les ribosomes de l'ARN en protéine. Au-delà de ces ressemblances, les cellules ne sont pas construites sur le même schéma, elles ont des architectures très différentes les unes des autres. Fondamentalement, on distingue deux catégories de cellules : les procaryotes et les eucaryotes. Cette terminologie signifie que les cellules de la première catégorie, les procaryotes, ne possèdent pas de noyau, alors qu'un noyau entouré d'une enveloppe formée de membranes est la caractéristique propre des eucaryotes. A- Les cellules eucaryotes : Environ 20 µm de diamètre pour beaucoup d’entre elles. Elles sont représentées par les protistes (organismes eucaryotes unicellulaires) et les cellules des champignons, des plantes, et des animaux. 7  1) Cellule animale : Structure d’une cellule animale a) Membrane plasmique : La cellule est limitée par une membrane appelée membrane plasmique. C’est à la fois une barrière entre les constituants cellulaires et le milieu extérieur et également une zone d’échange. Dans cette structure on trouve une double couche phospholipidique, au-dessus de laquelle se trouvent des protéines périphériques et dans laquelle sont enchâssées des protéines dites «intégrées ». b) Noyau :  la cellule eucaryote possède un noyau qui est l’organite le plus volumineux ; il est délimité par une double membrane appelée enveloppe nucléaire ;  L'ADN est organisé en une ou plusieurs molécules linéaires, qui sont organisées sur des protéines pour former la chromatine ;  la réplication et la transcription de l’ADN ont lieu dans le noyau ;  la traduction se fait dans le cytoplasme de la cellule ; c) Le cytoplasme : C’est l’ensemble des autres constituants cellulaires, une analyse fine révèle que le cytoplasme peut être séparé en deux composants : les organites cytoplasmiques et le cytosol.  Les organites cytoplasmiques: Il s’agit de compartiments cellulaires limités par une membrane. Ces organites font partie soit du système endo-membranaire, soit partie des organites clos (peroxysomes, mitochondries). 8  Le système endo-membranaire correspond à l’ensemble des saccules limités par des membranes simples en communication permanente les unes avec les autres, et avec la membrane plasmique grâce à des vésicules (réticulum-endoplasmiques, appareils de Golgi, lysosomes et endosomes…). Ils consomment tous de l’énergie.  Le réticulum endoplasmique, forme un réseau limité par une membrane. Il peut former des tubes ou des citernes aplaties disposées parallèlement les unes aux autres. Les ribosomes s’associent aux membranes du réticulum qui prend alors le nom de réticulum endoplasmique rugueux (ou granuleux) par opposition au réticulum endoplasmique lisse.  L’appareil de Golgi, un compartiment constitué de saccules en forme de disques. Ces saccules sont regroupés en plusieurs amas de saccules parallèles entre eux.  Des vésicules grossièrement sphériques limitées par une membrane. En fonction de leur contenu et de leur origine on distinguera : Des lysosomes: vésicules renfermant des enzymes dégradatives (hydrolases) ; Des vésicules de sécrétion qui contiennent des éléments destinés au milieu extra- cellulaire ; Des vésicules d’endocytose qui contiennent des éléments prélevés dans le milieu extra- cellulaire.  Les organites clos : sont les principaux transformateurs énergétiques de la cellule, ils permettent la formation d’énergie :  Les mitochondries, organites limités par deux membranes. Ces organites vont, à partir de molécules organiques, fournir l’énergie sous une forme directement utilisable pour le fonctionnement cellulaire ;  Des peroxysomes qui contiennent des enzymes catalysant des réactions d’oxydoréduction.  Le cytosol : Il est fluide avec présence de flux grâce au cytosquelette. Il est constitué par une solution aqueuse d’éléments minéraux et organiques qui contient un certain nombre de complexes macromoléculaires comme des ribosomes et les différents constituants du cytosquelette (microtubules, filaments d’actine, filaments intermédiaires). Le cytosquelette permet à la cellule de maintenir sa morphologie et à se mouvoir. Il est également important lors de la division cellulaire, et dans le système de transport intracellulaire. 2) Cellule végétale On trouve dans une cellule végétale tous les éléments que nous venons de décrire chez une cellule animale: membrane plasmique, noyau, cytoplasme avec tous les organites précités. 9  Structure d’une cellule végétale Toutefois, il existe des caractères distinctifs qui sont les suivants :  une grande vacuole centrale (entourée d'une membrane, le tonoplaste), qui maintient la turgescence de la cellule et contrôle les échanges de molécules entre le cytosol et la sève. Elle sert également de lieu de stockage de nutriments et de déchets ;  une paroi pecto-cellulosique faite de cellulose et de protéines, ainsi que de lignine dans de nombreux cas. Elle s'oppose à la paroi cellulaire des champignons, faite de chitine, et des procaryotes, faite de peptidoglycanes ;  les plasmodesmes, reliant les pores de la paroi cellulaire, ce qui permet à chaque cellule végétale de communiquer avec les cellules adjacentes ;  les plastes (limité par deux membranes), en particulier les chloroplastes qui contiennent la chlorophylle, ce pigment qui donne aux plantes leur couleur verte et qui intervient dans le processus de la photosynthèse ;  l'absence de centrosomes qui sont présentes dans les cellules animales. 10  Production Chantal PROULX Production Chantal PROULX Tableau : Comparaison entre une cellule animale et une cellule végétale CELLULE VEGETALE CELLULE ANIMALE Présence d’une paroi pecto- Absence de la paroi pecto-cellulosique cellulosique Présence de vacuoles de grande taille Présence de vacuoles de petite taille Présence de chloroplastes Absence de chloroplastes Présence de peroxysome Présence de lysosomes et peroxysome Absence du complexe centriolaire Présence du complexe centriolaire 11 B- Les cellules procaryotes : -Sont de petite taille (environ 2 µm de diamètre) et montrent une structure interne plutôt simple ; -La cellule procaryote est limitée par une membrane plasmique. Cette membrane plasmique peut être doublée à l’extérieur par une paroi résistante. Cette paroi est formée chez les eubactéries de peptidoglycane (un complexe de lipides, de polysaccharides et de polypeptides), et joue le rôle de barrière supplémentaire contre les forces extérieures. Elle empêche également la cellule d'éclater sous la pression osmotique dans un environnement hypotonique ; -Les cellules procaryotes n’ont pas de cloisonnement cytoplasmique ; elles contiennent un compartiment cytoplasmique unique, souvent diffus et granulaire, du fait des ribosomes ; -La cellule procaryote ne possède pas de noyau ; l’ADN organisé en un seul chromosome est circulaire ou linéaire ; - les procaryotes peuvent posséder un ADN extra-chromosomal, organisé en molécules circulaires appelées plasmides ; -la transcription et la traduction de l’ADN se font directement dans le cytoplasme ; - La substance fondamentale du cytoplasme est appelé le cytosol qui est rigide chez les procaryotes, avec une absence de flux (ni exocytose, ni endocytose); -les procaryotes ne possèdent ni organites ni cytosquelette ; -reproduction : scissiparité ; -mobilité : non mobile ou avec un flagelle de protéines (flagelline) ; C) Comparaison entre une cellule eucaryote et une cellule procaryote : 1) Ressemblances : La cellule procaryote possède les mêmes constituants moléculaires que les eucaryotes, acides nucléiques, protéines, lipides et glucides qui jouent les mêmes rôles fondamentaux. Les mécanismes biochimiques fondamentaux, comme la synthèse des protéines, sont similaires (présence de ribosomes qui ont le même rôle que les ribosomes eucaryotes). La structure de base de la membrane plasmique est identique à celle des membranes des cellules eucaryotes. 12  2) Différences : Tableau : principales différences entre une cellule procaryote et une cellule eucaryote (Brodeur et al., 2007) NB : - Le cytoplasme des eucaryotes n'est pas aussi granulaire que celui des procaryotes, puisque la majeure partie de ses ribosomes sont rattachés au réticulum endoplasmique ; - Contrairement aux procaryotes, seuls quelques organites des eucaryotes peuvent contenir des plasmides (mitochondrie et chloroplastes). 13 CHAPITRE III : COMPOSITION CHIMIQUE DE LA CELLULE A- Constituants minéraux : Ils sont constitués par l’eau et les sels minéraux. 1) eau : Quantitativement, l’eau représente le constituant majeur des cellules (plus de 60%). Le rôle prépondérant de l'eau en biologie est dû à ses propriétés physiques et chimiques ; c’est le seul élément qui existe sous trois formes : liquide, solide et gazeuse. L’eau, qui est une molécule polaire, joue un rôle très important en organisant les autres constituants de la matière vivante. Les molécules polaires sont hydrophiles alors que les molécules non polaires sont hydrophobes (ces molécules s’organisent pour diminuer au maximum leur contact avec l’eau). Une molécule d’eau peut développer 4 liaisons hydrogène: deux par ses atomes d’hydrogène ; deux autres par les doublets non liants de l’atome d’oxygène Propriétés particulières de l’eau dues à la liaison hydrogène La liaison hydrogène confère à l'eau des propriétés extraordinaires: Chaleur spécifique Chaleur de vaporisation Dilatation Pouvoir de cohésion Très bon solvant 14  2) Sels minéraux Les sels minéraux sont en général en solution sous forme d’ions. Ils jouent un rôle important dans les réactions d’équilibre ionique et de pression osmotique. Leur concentration est contrôlée dans la cellule. Chez les organismes pluricellulaires, la concentration en ions du milieu extracellulaire (ex plasma, liquide interstitiel…) est aussi strictement contrôlée. Ceci est très important notamment pour les phénomènes d’excitabilité cellulaire. Les sels minéraux existent sous forme de cations et anions : Cations : Na+, K+, Ca2+, Mg2+ Anions : Cl-, HPO4- -, HCO3-, SO4- - B- Les substances organiques : 1) Glucides Les glucides simples répondent à la formule (CH2O)n (n varie de 3 à 7). Les glucides simples les plus importants en biologie sont ceux à 6 atomes de carbone (glucose par exemple) et à 5 atomes de carbone (ribose et désoxyribose). Les glucides simples peuvent se condenser entre eux pour former des polymères. Le rôle principal des glucides est un rôle énergétique. Les polymères constituent donc des réserves. Chez les végétaux, des polymères glucidiques constituent la paroi des cellules. 3 types de glucides :  Monosaccharide (1 monomère) 15   Oligosaccharide: disaccharide : 2 monosaccharides reliés par une liaison glycosidique  Polysaccharides : la plupart des polysaccharides sont des polymères de glucose Les trois polysaccharides les plus connus sont : amidon, glycogène et cellulose dont la fonction est soit structurale (Cellulose), soit réserve nutritionnelle animale (Glycogène) ou végétale (Amidon). Cellulose Glucose, Galactose, Monosaccharide Fructose, etc. Maltose, Disaccharide Lactose, Saccharose, etc. GLUCIDES Polysaccharide Glycogène Amidon Cellulose 16  Les glucides peuvent aussi s’associer à d’autres constituants de la matière vivante pour former des molécules complexes (glycoprotéines, glycolipides et acides nucléiques). 2) Lipides Ce sont les corps gras, leur caractéristique est leur insolubilité dans l’eau mais leur solubilité dans les solvants non polaires. Ils peuvent appartenir à plusieurs familles chimiques comme par exemple les glycérides et les stéroïdes. Ils fournissent de l’énergie à la cellule, ils ont aussi un rôle structural important en constituant la structure de base des membranes biologiques. Certaines classes de lipides sont des messagers biochimiques, c’est à dire des molécules synthétisées par une cellule et capables de modifier le fonctionnement cellulaire. 3) Protides a- Structure Ce sont les acides aminés et leurs polymères. 20 acides aminés différents entrent dans la constitution de la matière vivante. Ils peuvent se lier entre eux par condensation, formant une liaison peptidique. Lorsque les acides aminés se lient entre eux, ils forment un polypeptide. Les polypeptides les plus grands sont appelés protéines. Un polypeptide présente une fonction amine à une de ses extrémités et une fonction acide à l’autre : on parle d’extrémité N terminale (fonction NH2) et d’extrémité C terminale (fonction COOH). La séquence de la protéine, c’est à dire l’ordre de l’enchaînement des acides aminés constitue la structure primaire de la protéine qui détermine sa conformation (sa forme dans l’espace). Les propriétés biochimiques de chaque protéine sont déterminées par la structure primaire car les acides aminés possèdent des chaînes latérales différentes présentant des propriétés spécifiques. 17  Etapes de l’organisation d’une protéine http://reflexions.ulg.ac.be/cms/c b- Interactions protéiques Les interactions biochimiques (entre plusieurs protéines ou entre une protéine et une autre molécule) font très souvent intervenir des phénomènes de reconnaissance de surface. Ces interactions sont généralement très spécifiques. - Exemples d’interactions protéiques les enzymes peuvent catalyser certaines réactions biochimiques. L’enzyme forme avec son substrat un complexe qui favorise la réaction biochimique en diminuant l’énergie d’activation nécessaire. 18  Les anticorps sont aussi des protéines capables de reconnaître spécifiquement d’autres molécules (antigène). Ils sont synthétisés par le système immunitaire d’un animal pour lutter contre l’introduction d’un organisme infectieux ou d’une substance étrangère. La formation du complexe antigène/anticorps favorise l’élimination de l’antigène de l’organisme. Les anticorps sont des protéines de la famille des immunoglobulines. Une reconnaissance spécifique de l’antigène par l’anticorps www.fondation-arthritis.org 3) Acides nucléiques Ce sont des polymères de nucléotides. Les nucléotides sont constitués d’une base azotée liée à un sucre à 5 atomes de carbone. Le sucre porte des groupements phosphate sur son carbone 5’. Il y a 5 bases différentes (adénine, guanine, cytosine, uracile et thymine) et deux types de sucre (ribose et désoxyribose). Outre leur rôle comme constituant des acides nucléiques, les nucléotides peuvent intervenir dans le métabolisme cellulaire (ex ATP, AMPc…). L’ARN est constitué par l’enchaînement de nucléotides reliés entre eux par des ponts phosphodiesters entre le carbone 3’ et le carbone 5’ du ribose: chaque brin présente donc une extrémité 3’OH et une extrémité 5’ Phosphate. On trouve 4 nucléotides différents correspondant aux bases suivantes: Adénine, Guanine, Uracile et Cytosine. 19 L’ADN est constitué de deux chaînes de nucléotides à désoxyribose. On trouve 4 nucléotides différents correspondant aux bases suivantes: Adénine, Guanine, Thymine et Cytosine. Les nucléotides sont reliés entre eux par des ponts phosphodiesters entre le carbone 3’ et le carbone 5’ du désoxyribose: chaque brin présente donc une extrémité 3’OH et une extrémité 5’ Phosphate. Les deux chaînes d’une molécule d’ADN sont complémentaires (A est associé à T et G à C) et antiparallèles (l’extrémité 3’ d’un brin est associée à l’extrémité 5’ de l’autre brin). Les acides nucléiques permettent le stockage et la transmission de l’information nécessaire au fonctionnement cellulaire (information génétique). Structure de l’ADN bioutils.unige.ch 20  CHAPITRE IV : METHODES D’ETUDE DE LA CELLULE Dans cette partie, les principales techniques nécessaires à l’étude des cellules et des tissus sont d'abord décrites. Pour l'étude de la cellule, le microscope a été et reste un outil essentiel. Pour en comprendre les apports, mais aussi les limites, nous allons aussi décrire les méthodes préparatoires qui sont associées aux techniques microscopiques et qui ont pour but de rendre observables les structures cellulaires et tissulaires. A- Principes généraux de microscopie et microscopie optique: Pour améliorer la limite de résolution de l'oeil humain nu qui est de 0,2 mm, c'est-à-dire diminuer la distance minimale qui permet de discerner comme distincts deux points d’un objet, nous avons recours aux techniques microscopiques. Tous les microscopes, qu'ils soient optiques ou électroniques, vont se baser sur les mêmes lois de la physique. Les microscopes présentent une source d'émission d'un type propre de rayonnement (photons (lumière visible) ou électrons) qui sera focalisé sur un échantillon ou objet, pour le traverser. Ainsi, le microscope optique qui utilise la lumière visible comme type de rayonnement permet une limite de résolution d'environ 0,2 μm (200 nm). Un microscope électronique qui utilise des électrons accélérés comme source de rayonnement autorise l'observation de détails jusqu'à 0,2 nm. Le microscope est constitué de deux lentilles convergentes : l'objectif et l'oculaire. L'objectif a une distance focale très petite et est placé près de l'objet à observer, fournissant une image réelle renversée fortement agrandie. Cette dernière est encore plus agrandie par l'oculaire qui fonctionne comme une loupe. L'objet observé est en fait une image virtuelle renversée. Principe d'un microscope (fr.wikipedia.org) 21 Différents types de microscopes optiques existent : 1) Le microscope à polarisation En microscopie en lumière polarisée, on place l'échantillon entre un polariseur et un analyseur afin de détecter les variations de polarisation de la lumière après la traversée de l'échantillon. Cette technique est très utile pour l'observation des milieux biréfringents. Le passage de cette lumière au travers d'un filtre polarisant produit une lumière totalement polarisée en ne permettant que le passage des ondes dont la vibration se fait dans la même orientation que le filtre. Un second filtre, appelé analyseur, est positionné entre l'objet et l'oeil de l'observateur avec une orientation perpendiculaire au polariseur. Ce système n'a de sens que si le matériel observé altère la polarisation de la lumière de telle façon qu'une partie des ondes lumineuses puisse traverser l'analyseur. Cette condition de déviation du sens de vibration de la lumière est remplie si le matériel observé possède une structure anisotrope. Exemple : les bandes A (Anisotrope) des sarcomères des muscles striés sont observées le long des myofibrilles en alternance avec les bandes I (Isotrope). Utilisation du dispositif de polarisation sur un-microscope (svtmarcq.e-monsite.com) 22  2) Le microscope à contraste de phase Un microscope à contraste de phase (ou en contraste de phase) est un microscope optique qui transforme en niveaux de contraste les différences d'indices de réfraction entre deux structures, lesquelles se traduisent en différences de phase pour les ondes lumineuses les traversant. Il visualise ainsi des structures transparentes quand leur indice de réfraction diffère de celui de leur voisinage. Image réalisée en microscope à contraste de phase (X400) 2) Le microscope à fluorescence : Les molécules fluorescentes absorbent la lumière à une longueur d'onde précise, puis réémettent elles- mêmes de la lumière, mais à une longueur d'onde plus grande. Donc si une telle molécule est illuminée 23 (on dit aussi "excitée") à la longueur d'onde qu'elle absorbe pour être ensuite observée à travers un filtre qui ne laisse passer que la longueur d'onde qui correspond à la lumière réémise. Celle-ci apparaîtra comme une lueur sur un fond sombre. Grâce à ce fond sombre, même une concentration infime de molécules fluorescentes pourra être détectée. Tableau : Les marqueurs fluorescents les plus courants et leur lumière d'excitation Image réalisée en microscope à fluorescence B- La préparation des cellules et tissus pour la microscopie optique : (Voir cours Histologie) La préparation habituelle des spécimens histologiques se fait en une succession précise d'étapes : la fixation, l'inclusion et la microtomisation, et enfin la coloration 24  C- Microscope électronique : Principe de la microscopie électronique (Miroslav K. et Bernard J., 2008) 1) Microscope électronique à transmission Le microscope électronique en transmission (MET) utilise un faisceau d’électrons à haute tension, émis par un canon à électrons. Des lentilles électromagnétiques sont utilisées pour focaliser le faisceau d’électrons sur l’échantillon. En traversant l’échantillon et les atomes qui le constituent, le faisceau d’électrons produit différentes sortes de rayonnements. En général, seuls les électrons transmis sont alors analysés par le détecteur, qui traduit le signal en image contrastée. 25  Vue au microscope électronique à transmission d'une section de flagelle de Chlamydomanas reinhardtii (www.futura-sciences.com) 2) Microscope électronique à balayage : L’interaction entre les électrons et l’échantillon provoque la formation d’électrons secondaires de plus faible énergie. Ils sont amplifiés puis détectés et convertis en un signal électrique. Ce processus est réalisé en chaque point de l’échantillon par un balayage du microscope. L’ensemble des signaux permet de reconstruire la typographie de l’échantillon et de fournir une image en relief. Tête de fourmi (www.futura-sciences.com) 26  D- Techniques de Fractionnement Cellulaire Afin d'analyser leur structure ou leur composition, il peut être intéressant de séparer les différentes structures présentes dans la cellule. En détruisant les membranes et les parois, on libère le contenu des cellules ; on obtient alors un homogénat (mélange de tous les constituants). La séparation des constituants de ce mélange est appelée: le fractionnement cellulaire. 1) Centrifugation Pour ce faire, on broie une culture de cellules. La séparation des constituants peut alors se faire par centrifugation. Soumis à l'effet centrifuge, les structures les plus lourdes se rassemblent dans le fond du tube en rotation. Les particules sédimentent à une vitesse donnée, en fonction de leur taille et de leur densité. Le procédé de purification des composants cellulaires peut être réalisé en plusieurs étapes, le surnageant étant chaque fois centrifugé plus vite et plus longtemps. L'accélération à laquelle on soumet les échantillons atteint des valeurs de 100 000 à 200 000 g.  Centrifugation différentielle  Centrifugation sur gradient de densité a) Centrifugation différentielle : on centrifuge l’homogénat à différentes vitesses, à chaque vitesse, différents constituants se déposent dans le culot. Centrifugeuse 27  b) Centrifugation sur gradient de densité L’homogénat est centrifugé à travers des solutions déjà préparées à des concentrations différentes (densités différentes). Les différents constituants de l’homogénat sédimentent à des vitesses différentes sous forme de bandes à des niveaux différents correspondant à leurs densités. Planet-vie.ens.fr 2) Electrophorèse Electro : énergie électrique Phoresis : phoros, porter, avoir en soi Méthode de séparation et caractérisation de molécules (protéines et acides nucléiques), à l’aide d’un champs électrique. Principe de l’électrophorèse (lebioblog.com) 28 Principe: Sous l’effet d’un champs électrique, une molécule avec une charge donnée va migrer vers l’électrode de signe opposée à sa charge. Les molécules à séparer sont déposées sur un support dont chaque extrémité est en contact avec une solution tampon. Dans chaque solution tampon se trouve une électrode. Les électrodes sont reliées à un générateur de courant. Lorsque le générateur envoie du courant, les molécules chargées se déplacent sur le support en direction de l’électrode de signe opposé à leur charge. La vitesse de migration est différente pour les différentes molécules chargées et permet leur séparation les unes des autres. Si on entoure toutes les molécules de la même charge (par exemple charge négative) : ↳ Elles vont toutes migrer dans un même sens (vers l’électrode positive) ↳ Les molécules de petite taille migrent rapidement ↳ Les molécules de grande taille migrent lentement Ainsi les molécules vont se séparer les unes des autres. Différents types d’électrophorèse :  Electrophorèse sur veine liquide Pour les très grosses particules (cellules, organites) ; presque plus utilisée  Electrophorèse sur support solide ou semi-solide Obtention après migration d’une séparation en zones distinctes (bandes) des molécules chargées. Différents supports d’électrophorèse de zones : Sur papier Sur Acétate de cellulose Sur Gels : la plus utilisée Différents types d’électrophorèse sur gel :  électrophorèse sur gel d’agarose ;  électrophorèse en champs pulsé ;  électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) ;  électrophorèse bi-dimensionnelle 29  a) Electrophorèse sur papier Séparation des petites molécules (acides aminés ou petits peptides). Après migration, les molécules séparées se présentent sous forme de taches qu’on peut révéler avec un colorant. b) Electrophorèse horizontale sur gel d’agarose Utilisée principalement pour séparer les molécules d’acides nucléiques : ↳ Electrophorèse simple (molécules de taille moyenne et petites) ↳ Electrophorèse en champs pulsé (grandes molécules d’acides nucléiques) Le mélange à étudier est déposé sur un gel placé horizontalement dans une cuve (boîte) remplie avec une solution tampon. La cuve est branchée par 2 électrodes (une cathode et une anode) à un générateur de courant. Après migration les molécules séparées se présentent sous forme de bandes qu’on peut visualiser avec un colorant. c) Electrophorèse verticale sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate- PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) : Utilisée pour séparer les molécules d’acides nucléiques et les protéines, en fonction du facteur TAILLE. Séparation de protéines réalisée en condition dénaturante, en présence de SDS Sodium Dodécyl Sulfate (détergent anionique). Conditions SDS-PAGE => suppression facteurs FORME et CHARGE lors migration Séparation des protéines uniquement en fonction du facteur TAILLE. Le mélange à étudier est déposé sur un gel d’acrylamide coulé entre 2 plaques de verres et placé verticalement dans une cuve. Évaluation des masses moléculaires des protéines séparées, on utilise des standards (mélange de protéines de masses moléculaires connues) Après migration, les molécules séparées se présentent sous forme de bandes qu’on peut colorer (au bleu de Coomassie, nitrate d’argent (+ sensible), ou nouveaux colorants fluorescents). ↳ Electrophorèse unidimensionnelle ↳ Electrophorèse bi-dimensionnelle Lorsqu’il existe des bandes protéiques très proches => chevauchement Séparation par électrophorèse SDS-PAGE (unidimentionnelle): moins de 50 protéines Pour séparer plus de bandes => combinaison de 2 modes de séparation dans 2 dimensions : L'électrophorèse bidimentionnelle est la méthode de choix pour séparer les protéines puisqu'elle permet de séparer simultanément plusieurs milliers de polypeptides d'un mélange complexe en fonction de deux propriétés différentes : la charge électrique et le poids moléculaire. 30 On réalise l’électrophorèse dans un tube étroit de gel polyacrylamide où un gradient de pH est établi. On soumet alors à un fort courant électrique. Dans la première dimension, les protéines sont soumises à une électrophorèse dans un gel présentant un gradient de pH continu. Au cours de cette étape, appelée isoélectrofocalisation (IEF), elles migrent dans le gel jusqu'à une position où la valeur du pH est égale à celle de leur point isoélectrique (pI) où leur charge globale devient nulle. Dans la deuxième dimension, les protéines sont séparées par la technique SDS-Page 3) La chromatographie C’est une méthode d'analyse qui sépare les constituants d'un mélange (les solutés). Un fluide appelé phase mobile parcourt un tube appelé colonne. Cette colonne peut contenir des "granulés" poreux (colonne remplie) ou être recouverte à l'intérieur d'un film mince (colonne capillaire). Dans les deux cas, la colonne est appelée phase stationnaire. Le mélange à séparer est injecté à l'entrée de la colonne où il se dilue dans la phase mobile qui l'entraîne à travers la colonne. ↳ Les constituants du mélange, sont inégalement retenus lors de la traversée de la colonne : les vitesses de déplacement des constituants du mélange injecté sont différentes. Ils sont ainsi élués de la colonne les uns après les autres et donc séparés ; 31 ↳ Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un enregistreur permet d'obtenir un tracé appelé chromatogramme. Au passage de chaque soluté séparé, il conduit dans le temps à l'enregistrement d'un pic. Chaque soluté est donc soumis à : - Une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) ; - Une force de mobilité (due à la phase mobile). Les méthodes chromatographiques peuvent être classées en fonction de la nature physique des phases (mobile et stationnaire) Parmi ces méthodes, les plus courantes sont : La chromatographie liquide haute performance (HPLC) La chromatographie en phase gazeuse (CPG) a) Chromatographie liquide haute performance (HPLC) C'est une méthode de séparation des constituants d'un mélange qui emploie: -Un solvant comme phase mobile ; -Un solide ou un liquide supporté par un solide comme phase stationnaire. www.4.ac-nancy-metz.fr 32  b) La chromatographie en phase gazeuse (CPG) Le mélange à analyser est vaporisé à l'entrée d'une colonne (l’échantillon est placé dans un injecteur et chauffé par une flamme), qui renferme une substance active solide ou liquide appelée phase stationnaire, puis il est transporté à travers celle-ci à l'aide d'un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les différentes molécules du mélange vont se séparer et sortir de la colonne les unes après les autres après un certain temps qui est fonction de l'affinité de la phase stationnaire avec ces molécules. Plus le composé a d'affinité avec la phase stationnaire, plus il mettra de temps à sortir de la colonne. À la sortie de la colonne, le détecteur évalue en continu la quantité de chacun des constituants séparés au sein du gaz porteur. La grandeur expérimentale brute est appelée temps de rétention. C'est le temps qui s'écoule entre l'injection de l'échantillon et l'apparition du signal maximum du soluté au détecteur. Le détecteur envoie un signal électronique vers un enregistreur qui dessinera les courbes de chaque pic en fonction de leur intensité. L'ensemble des pics est appelé chromatogramme. E- Marquage radioactif et autoradiographie De très nombreuses approches expérimentales de biochimie nécessitent le recours à des molécules contenant un atome radioactif. Ces traceurs servent à suivre une voie métabolique, étudier les biosynthèses (lieu, moment de la biosynthèse et la quantité biosynthétisée…) 33 Ces précurseurs devront être choisis afin de marquer spécifiquement la molécule désirée. Par exemple : - La thymidine tritiée (T3H) ou marquée au 14C pour l’ADN (un H ou un C de la thymidine ont été remplacés par leurs isotopes radioactifs et ils sont incorporés spécifiquement dans la structure de l’ADN comme base.) - L’uridine 3H ou 14C pour l’ARN. 1) Technique de marquage radioactif : Deux étapes : a- Pulse : milieu chaud (période très brève : quelques mn) Cellules dans un milieu nutritif + Molécule contenant un isotope radioactif = précurseur b- Chasse : milieu froid (période plus longue) Les mêmes cellules + Même molécule contenant un isotope non radioactif 2) Détection de la radioactivité : Détection qualitative : autoradiographe Elle se réalise en trois étapes (voir animation): - Dépôt de l’émulsion nucléaire Emulsion nucléaire = Bromure d’argent (AgBr) Elément radioactif Emission de rayonnement ᵝ- ᵝ- AgBr Ag+ + Br – Ag + forme une image latente non visible qu’il faut révéler 34  - Révélation On utilise un révélateur photographique D19B Ag + → Ag Les ions d’Ag sont réduits en Ag métallique Ag métallique se dépose sous forme de grains d’argent visibles au microscope. - Fixation et observation au microscope électronique F- La culture cellulaire La culture cellulaire permet l'étude d'une cellule particulière Isolement et purification spécifiques d'un type cellulaire précis, à partir d'un prélèvement de tissu Amplifier les cellules purifiées pour produire une population homogène suffisamment abondante pour permettre d'expérimenter les caractéristiques de ce type cellulaire. 1) Intérêt fondamental: La structure, les fonctions cellulaires, les voies de signalisation Exemple: -les cellules cancéreuses mises en culture : présence d’un gros noyau + nucléoles, avec certaines qui sont en division cellulaire Cellules en culture observées au microscope à contraste de phase 35  2) Culture cellulaire - Culture primaire = correspond à des cellules issues directement des tissus d’un organisme ; - Culture secondaire = culture établie à partir de prélèvement de cellules de la culture primaire. Cette notion de culture secondaire est appliquée sur toutes les cultures qui succèdent. Lors du prélèvement des cellules, il est possible de les cloner, mettre en culture une cellule unique, on obtient une population homogène (les cellules ont le même patrimoine génomique avec un phénotype très proche). La culture II se fait après repiquage et ensemencement dans une 2ème boîte à la suite de la confluence de la 1ère culture. Les cellules mises en culture perdent assez rapidement l‘expression de certaines protéines et donc perte de certains critère de différenciation qui les caractérisent c’est pour cela qu’il faut distinguer entre culture Iaire et IIaire. 3) Conditions de culture -37°C, pH, sels, CO2 ; - Milieu de culture : -Milieu de base - +/- Sérum, -Facteurs de croissance, -Support 36  4) Immortalisation La plupart des types cellulaires humains ont une vie limitée en culture et mourront après 50 à 100 divisions cellulaires. Pour tenter d'éviter cet inconvénient, des lignées cellulaires immortelles ont été isolées : à partir de tumeurs ou en transformant des cellules normales par un agent cancérigène. – Introduction d’un oncogène (SV 40, Myc) qui immortalise la cellule sans la rendre tumorale – Cellules tumorales, exemple : He(nrietta) La(cks) 37  CHAPITRE V : MEMBRANE PLASMIQUE Les membranes sont des structures indispensables à la vie : Frontière entre l’intérieur et l’extérieur de la cellule, elle peut être renforcée par une paroi cellulosique chez les végétaux, par de la chitine chez les champignons ou par une paroi glycoprotéique pour les procaryotes ; Elles permettent aux cellules de maintenir un milieu interne différent du milieu extracellulaire ; Elles possèdent une perméabilité très sélective ; Les membranes intracellulaires qui bordent les organites des cellules eucaryotes jouent le même rôle entre le cytosol et le contenu de ces organites ; Les constituants principaux sont les lipides et les protéines. D- Fonctions des membranes biologiques La compartimentation (séparation de l’extérieur et l’intérieur de la cellule) ; Les échanges d’information avec d’autres cellules (récepteurs hormonaux, jonctions gap) ; La régulation du transport des ions, protéines, sucres graisses, etc.. ; Les mouvements cellulaires (pseudopodes, endocytose, exocytose) ; Les phénomènes de reconnaissance (antigène de surface) ; La régulation du métabolisme (transduction intracellulaire des signaux extracellulaires) ; Procure un site pour les réactions chimiques ne pouvant pas se produire dans un environnement aqueux. E- Structure de la membrane plasmique Malgré des fonctions différentes, toutes les membranes montrent une structure générale commune. Il s'agit de la structure de base de toutes les membranes biologiques qui repose sur une composition faite de phospholipides : la bicouche lipidique. 38  Deux feuillets visibles au microscope électronique Épaisseur : 7 à 8 nm F- Composition des membranes Modèle de la mosaïque fluide de « Singer et Nicholson »(1970) : Deux couches de phospholipides (~49%) ↦ Forment le squelette des membranes ; Cholestérol entre les phospholipides ; Protéines à la surface et à travers (~43%) ↦ Attachées plus au moins aux phospholipides ; Polysaccharides attachés aux lipides ou aux protéines (glycophospholipides et glycoprotéines) (~8%). www.botanic06.com 39  1) Les lipides : On trouve toujours dans les membranes une forte proportion de lipides amphipathiques (ou amphiphiles), c’est à dire de lipides ayant un pôle hydrophobe (acides gras) et un pôle hydrophile (groupement phosphate et glycérol). Étant en milieu aqueux, les molécules s'accolent au niveau de leur pôle hydrophobe et s'arrangent ainsi en deux couches. www.futura-sciences.com Les acides gras sont les constituants clefs des lipides ; Les acides gras sont des acides carboxyliques caractérisés par une répétition de groupements méthylène -CH2- formant une chaîne carbonée ; Les acides gras naturels possèdent un nombre pair de carbones ; Ils peuvent être saturés ou insaturées ; 40  Les acides gras saturés sont linéaires ; Les acides gras insaturés créent un coude dans la structure. La présence d’une double liaison est importante pour le comportement macroscopique des acides gras dlc.dcccd.edu Les doubles liaisons contribuent à affaiblir les interactions entre les chaînes voisines ; La membrane devient plus fluide Les membranes biologiques contiennent 3 clases de lipides :  Gycérophospholipides  Sphingolipides  Stéroïdes (le cholestérol) a) Les glycérophospholipides Glycérol + deux acides gras + un acide phosphorique + alcools (l’inositol, l’éthanolamine et la choline) ou acides aminés (la sérine). Les alcools ou les acides aminés donnent l’identité et la caractéristique du glycérophospholipide. 41 phosphatidylcholine typique : 1. choline, 2. phosphate, 3. glycérol, 4. acide gras insaturé 5. acide gras saturé b) Les sphingophospholipides Sphingosine + acide gras + acide phosphorique + alcool ou acides aminés Les sphingolipides constituent une deuxième classe des lipides membranaires ; Les sphingolipides se trouvent à coté des glycérophospholipides ; Le constituant de base est le sphingosine (un dialcool aminé) + chaine hydrocarbonée (CH2)12 42  c) Stéroides (cholestérol) : Le cholestérol est présent uniquement dans les membranes des cellules animales (ergostérol chez la cellule végétale) ; Composé d’un noyau stéroïde hydrophobe, d’une queue hydrophobe et d’une fonction alcool hydrophile ; En s’intercalant entre les molécules de phospholipides, il stabilise en diminuant (sans la supprimer), la fluidité excessive de la membrane. slideplayer.fr 2) Les protéines membranaires : Les protéines membranaires ont des rôles bien spécifiques au sein de la double couche phospholipidique : Récepteurs, transporteurs ; Adhérence cellulaire ; Catalyse enzymatique ; Messagers intracellulaires, etc Chaque protéine possède une extrémité N-terminale et une extrémité C-terminale. Les protéines sont organisées de différentes manières dans la membrane. On en distingue 2 principaux types: -Protéines transmembranaires ou intrinsèques appelées également protéines intégrées ; -Les protéines membranaires périphériques ou extrinsèques. 43  a) Les protéines intrinsèques ou transmembranaires Appelées aussi protéines intégrées ou intégrales ; Traversent les deux feuillets de la membrane ; La partie transmembranaire est formée de 20 à 25 résidus d’acides aminés hydrophobes ; Elles ont une structure en hélice alpha ; Une protéine transmembranaire peut traverser la membrane une ou plusieurs fois. b) Les protéines périphériques Protéines constitutives de la membrane cellulaire qui se localisent soit du côté du cytoplasme (protéine périphérique interne), soit à la surface de la cellule (protéine périphérique extrinsèques). Les protéines périphériques ou extrinsèques sont accolées à la membrane par : des interactions électrostatiques ; 3 types d’ancrages : Prénylation, Acylation, Ancre GPI www.biofaculte.blogspot.com 3) Les glucides membranaires Les glucides n’existent pas à l’état libre, ils sont liés à : des protéines : glycoprotéines (majoritaires); des lipides : glycolipides (minoritaires) ; Exposés à l’extérieur de la cellule 44 En règle générale, les protéines et les lipides de la membrane plasmique ne sont pas exposés sans protection à l'extérieur de la cellule, mais elles sont au contraire recouverts et mis à l'abri par des sucres. Cette zone recouvrant la surface des cellules et riche en sucres est appelée "cell coat" ou glycocalyx. Les hydrates de carbone du glycocalyx sont à la fois des chaînes oligosaccharidiques liées de façon covalente à des protéines ou à des lipides membranaires (on parle alors respectivement de glycoprotéines et de glycolipides), ainsi que des chaînes polysaccharidiques (ou glycosaminoglycanes) liées de façon covalente à des protéines intégrales pour former des protéoglycanes membranaires. Les fonctions du glycocalyx sont multiples : un rôle de protection mécanique obtenue par épaississement des membranes plasmiques ; une protection chimique contre les dommages éventuels causés par des enzymes digestives qui entrent en contact avec les cellules ; le glycocalyx maintient à distance ces enzymes. le glycocalyx permet d’empêcher l'établissement d'interactions protéines-protéines non désirables, la reconnaissance de cellule à cellule. Les sélectines reconnaissent de façon spécifique des oligosaccharides situés sur les glycolipides et glycoprotéines du glycocalyx pour établir de façon transitoire des liaisons cellule-cellule (par exemple la reconnaissance ovocyte-spermatozoïde, la coagulation sanguine…). G- Propriétés générales des membranes 1) Fluidité membranaire Les mouvements possibles des phospholipides sont essentiellement les suivants : les phospholipides se déplacent latéralement dans le plan de la bicouche ; ils sont capables d’une rotation sur eux-mêmes; enfin, plus rarement, ils basculent d’un feuillet de la bicouche vers l’autre ("flip-flop"). www2.cegep-ste-foy.qc.ca 45 Toutes les possibilités de mouvement des phospholipides qui déterminent de façon majeure la fluidité d'une membrane dépendent d’abord de la température, mais aussi de la composition de la bicouche. Aux températures physiologiques de 37°C, les membranes cellulaires des mammifères sont fluides. Le cholestérol est présent de façon particulièrement abondante au niveau des membranes plasmiques des cellules eucaryotes animales ; il s'intercale entre les phospholipides de la bicouche. Par sa présence, le cholestérol diminue les possibilités de mouvement des chaînes hydrophobes des phospholipides et diminue donc d'une façon générale la fluidité membranaire. A l'instar des phospholipides, La fluidité membranaire permet le déplacement latéral de certaines protéines membranaires intégrales. Les protéines membranaires intégrales sont généralement libres de rotation autour de leur grand axe perpendiculairement par rapport à la surface de la membrane. Toutefois, elles ne peuvent pas s'inverser d'un feuillet vers l'autre. Il existe aussi plusieurs évidences qui montrent que certaines protéines membranaires peuvent se mouvoir latéralement dans le plan de la membrane. 46 Conséquences de la fluidité: Des propriétés intéressantes résultent de la structure en bicouche, la membrane : Peut se réparer d’elle-même : Vu le comportement des phospholipides dans un environnement aqueux, les compartiments délimités par une membrane formée d’une bicouche lipidique sont capables d’autoréparation, c’est-à- dire de se refermer automatiquement et rapidement sur eux-mêmes après avoir subi une blessure étroite ; Peut varier facilement sa taille : si on ajoute des molécules de phospholipides, celles-ci se joignent aux autres et la membrane s’agrandit. Inversement, elle peut réduire sa taille si on enlève des molécules ; Permet à une sphère de se diviser : il suffit de resserrer l’équateur d’une sphère pour obtenir deux sphères. De même, les membranes peuvent bourgeonner et délimiter deux compartiments individuels (une propriété qui sera essentielle entre autre pour la division cellulaire), ou au contraire fusionner et rassembler ainsi le contenu de deux compartiments en un seul contenu (une propriété utilisée dans la fusion des gamètes). 2) Asymétrie des membranes La structure de la membrane plasmique répond au modèle de la mosaïque fluide. L’asymétrie membranaire est particulièrement marquée :  La face extracellulaire est particulièrement riche en composés glucidiques (glycoprotéines et glycolipides).  La distribution des lipides est asymétrique au sein de la même membrane ; par exemple dans la membrane plasmique, les glycolipides se trouvent dans le feuillet externe et les lipides chargés négativement (phosphatidylserine) se trouvent dans le feuillet cytoplasmique.  De même, une protéine donnée a toujours la même orientation dans la membrane. Dans le cas de la membrane plasmique on distingue donc dans une protéine transmembranaire, une ou des régions qui sont extracellulaires, une ou des régions transmembranaires, et une ou des régions cytoplasmiques.  La composition de la membrane plasmique varie également en fonction des contacts que la cellule peut établir sur ses différentes faces. Notamment, dans un épithélium de revêtement, on distingue un domaine apical (au niveau de la lumière de l’organe) et un domaine basolatéral. Cette asymétrie des membranes est très importante du point de vue fonctionnel. 47 E- Transports à travers la membrane plasmique Le passage de molécules à travers une bicouche lipidique est gouverné par les lois physiques de la diffusion: le passage se fait en fonction du gradient de concentration, il est d’autant plus rapide que la molécule est petite, il est d’autant plus rapide que la molécule est soluble dans les lipides. Donc, plus la molécule est polaire et moins elle passera à travers des lipides. En particulier, les molécules ionisées ne passent pas à travers la bicouche lipidique. Le transport des grosses molécules et des molécules polaires ou chargées se fait donc grâce aux protéines transmembranaires et fait intervenir des phénomènes biologiques. Le passage de substances à travers la membrane peut, donc se faire : Par transport passif (sans dépense d’énergie) ; Par transport actif (avec dépense d’énergie) 1-Transports passifs Ce sont des échanges qui se font en fonction du gradient de concentration, sans apport d’énergie par la cellule. (Pour les molécules chargées, ces transports s’effectuent en fonction du gradient électrochimique qui tient compte à la fois du gradient de concentration et de la différence de charge de part et d’autre de la membrane.). On distingue Trois formes : Diffusion simple Diffusion facilité Osmose 48  a) Diffusion simple Ce type de passage n'est possible que si la molécule est « soluble » dans la membrane phospholipidique, c'est-à-dire qu'elle peut traverser directement la bicouche de phospholipides. Dans ce cas, il y a passage des molécules à travers la bicouche lipidique en fonction du gradient de concentration. Les substances non polaires comme l’oxygène, les déchets comme le dioxyde de carbone et l’urée, les graisses, diffusent à travers la membrane plasmique en se liant à ses composés phospholipidiques. Les caractéristiques de ce transport sont : Absence de saturation, la vitesse de diffusion dépend uniquement de la différence de concentration ; Absence de spécificité: il n'est pas régulé ; Mécanisme lent: les molécules doivent se dissoudre dans la double couche de phospholipides avant de passer de l'autre côté. humanphysiology.com Une substance diffuse suivant son gradient de concentration : de la zone la plus concentrée vers la zone la moins concentrée. Gradient = différence, le gradient de concentration entre deux milieux est la différence de concentration entre les deux milieux. 49  b) Diffusion facilitée Conditions de la molécule : – Grosse taille – Non liposoluble – Ex: Les sucres, les ions (Na+, K+..),… Le passage se fait toujours en suivant le gradient de concentration donc pas de dépense d’énergie. De plus, l’état fonctionnel de la protéine transmembranaire (actif ou inactif) peut être régulé. Ce type de transport est saturable. Deux types de protéines sont impliqués dans les phénomènes de diffusion facilitée :  Les protéines porteuses ou perméases : Les perméases sont des protéines qui se lient spécifiquement à la molécule à transporter selon un processus semblable à la formation du complexe enzyme-substrat. Le complexe perméase/substrat a tendance à se former dans le compartiment où la concentration en substrat est élevée et à se dissocier dans le compartiment où la concentration en substrat est faible Exemple d’une protéine porteuse: la perméase au glucose (GLUT-1) Assure la diffusion facilitée du glucose C’est un uniporteur : transporte une seule substance La fixation d’une molécule de glucose sur le site extérieur entraine un changement de conformation Le glucose est libéré dans le cytosol Le transporteur retourne à sa conformation de départ  Les canaux (protéines tunnels ou conductines) : Ils sont impliqués dans le transport des ions et de l’eau. Les canaux présentent une spécificité: différents types d’ions peuvent passer dans différents canaux. La plupart de ces canaux présentent deux états fonctionnels: fermé ou ouvert. Le passage d’une forme à l’autre est provoqué par différents stimulus comme la fixation d’une molécule ou la différence de potentiel transmembranaire (canaux contrôlés par le voltage). 50  c) Osmose L’osmose: processus de diffusion appliquée à l’eau. La membrane est perméable à l’eau, mais pas au soluté. L’eau se déplace du côté hypotonique (dilué) au côté hypertonique (concentré en soluté), en suivant son gradient de concentration. On peut inverser le mouvement des molécules d’eau en exerçant une pression supérieure à la pression osmotique = osmose inverse. L’osmose inverse permet par exemple de dessaler l’eau de mer. www.maxicours.com 51  Comment l’eau traverse la membrane des cellules ?? Passage lent à travers les phospholipides membranaires ; Passage rapide à travers des canaux membranaires spécifiques aux molécules d’eau, les aquaporines. 2-Transports actifs Ces échanges se font contre le gradient électrochimique. Ils se font par l’intermédiaire de protéines transmembranaires et sont donc spécifiques, saturables et susceptibles de régulations. Ils mettent en jeu 2 types de transporteurs actifs: les pompes et les cotransporteurs. Le transport actif permet aux cellules de conserver un milieu intérieur différent du milieu extérieur. C’est un processus nécessitant de l’énergie fournie par hydrolyse de l’ATP pour rendre la structure transporteuse capable de fonctionner contre un gradient de concentration. a) Les pompes: On peut distinguer les pompes transportant des ions minéraux, des pompes transportant des molécules organiques.  Pompes transportant des ions: On trouve sur toutes les membranes plasmiques des cellules animales des pompes à sodium/potassium et des pompes à calcium. Certaines cellules spécialisées expriment aussi des pompes à H+. - la pompe Na+/ K+/ATPase expulse 3 ions Na + et fait entrer 2 ions K + pour chaque molécule d’ATP hydrolysée. Elle maintient donc une faible concentration de Na + et une forte concentration de K + à l’intérieur de la cellule. La pompe Na+/K+ consomme à elle seule 25 % de l’ATP cellulaire! 52  www.facbio.com fr.wikipedia.org -La pompe à calcium : même principe que la pompe sodium. Elle existe au niveau de la membrane plasmique et du réticulum endoplasmique. Elle expulse 2 ions Ca++ par molécule d’ATP hydrolysée et maintient une concentration cytoplasmique de Ca ++ très faible.  Pompes transportant des molécules organiques: Elles appartiennent à la famille des transporteurs ABC et peuvent transporter de très nombreux substrats. Elles sont codées par des gènes appelés MDR (Multi Drug Resistance). Elles interviennent notamment dans les processus de détoxication. 53  rstb.royalsocietypublishing.org Plusieurs maladies sont associées à une altération des transporteurs ABC. La chimiorésistance de certaines tumeurs est due à une surexpression d’un transporteur de la famille ABC (MDR1) qui excrète les médicaments. b) Les cotransporteurs: Les cotransporteurs couplent le passage d’une molécule A suivant le gradient de concentration, au passage d’une molécule B contre le gradient de concentration. Le transport de B (énergétiquement défavorable) utilise l’énergie de transport de A (énergétiquement favorable). On distingue : les symports : qui transportent les deux molécules dans le même sens (l'une ne passe pas sans l'autre, les deux doivent passer ensemble). Un ion (Na+ en général) diffuse en suivant son gradient de concentration. Cette diffusion permet à une substance de traverser en même temps CONTRE son gradient de concentration. 54  Exemples : - Pompe à Na+ / glucose (cellules de l'intestin), le Na+ traverse en suivant son gradient de concentration et le glucose le suit CONTRE son propre gradient. -Pompe Na+ / acides aminés dans les reins -Pompe Na+ / Iode dans la glande thyroïde Des symports permettent l’entrée de glucose et d’acides aminés dans les cellules contre leur gradient de concentration. Cette entrée de glucose ou d’acides aminés est couplée à une entrée de sodium: l’énergie nécessaire est donc fournie par le gradient favorable de sodium. Ce gradient est lui-même créé par la pompe à sodium, c’est donc une utilisation secondaire de l’énergie fournie par la pompe à sodium: les cotransporteurs sont parfois appelés transporteurs actifs secondaires. www.cram.com les antiports : qui transportent chaque molécule dans une direction opposée (l'une est échangée contre l'autre). Un ion (Na+ en général) diffuse en suivant son gradient de concentration ou par transport actif. Ce déplacement permet à une substance de traverser en sens inverse CONTRE son gradient de concentration. Exemples : -Pompe Na+ / Mg++, la diffusion du Na+ dans la cellule permet l'expulsion du Mg++ contre son gradient. -Pompe Na+ / K+ : le transport actif du Na+ dans une direction permet le transport du K+ dans l'autre. F- Transport cytotique : 1) Endocytose : L'endocytose est un mécanisme de transport de molécules et de particules vers l'intérieur de la cellule. Une partie de la membrane entoure complètement une particule ou une grosse molécule et la fait pénétrer de l’extérieur vers l’intérieur en formant une vésicule. Selon le type de matériel absorbé, on distingue deux processus : 55   La phagocytose : absorption de particules qui donne de grosses vésicules (> 250 nm) nommées phagosomes,  la pinocytose : absorption de molécules en solution qui donne de petites vésicules (< 150 nm). a) Phagocytose La phagocytose est un phénomène qui est déclenché par le contact avec la particule. La membrane plasmique se déforme et la cellule émet des prolongements, appelés pseudopodes, qui englobent progressivement la particule. Ceci aboutit à la formation d’un phagosome. Le matériel phagocyté sera par la suite dégradé. 56 Ce sont surtout des cellules spécialisées comme les macrophages qui réalisent ce type d’endocytose. Les microorganismes sont reconnus par des récepteurs qui stimulent la phagocytose. C’est un processus qui permet d’éliminer les débris cellulaires et de nombreux microorganismes comme les bactéries. b) Pinocytose La cellule absorbe des gouttelettes de liquide extracellulaire, et les redirige sous forme de minuscules vésicules, vers les lysosomes en vue de leur assimilation. C'est un processus notamment fréquent chez les organismes filtreurs (microorganismes aquatiques ciliés...). Elle joue aussi un rôle dans l’absorption de certaines toxines. La pincytose peut intéresser spécifiquement un type de molécule grâce à l’intervention de récepteurs. C’est notamment le cas des lipides qui circulent dans le sang sous forme de lipoprotéines. Les lipoprotéines se fixent sur des récepteurs membranaires, ces récepteurs se concentrent au niveau de puits recouverts de clathrine qui forment ensuite des vésicules de pinocytose. 2) L'exocytose C’est le mécanisme par lequel la cellule libère de larges biomolécules à travers sa membrane. L’exocytose a lieu quand des vésicules de transport ou de sécrétion fusionnent avec la membrane plasmique et que leur contenu sort dans le milieu extracellulaire. Le but de l'exocytose peut être :  l'élimination des déchets ;  les fonctions de signalisation et de régulation ; 57  la production de macromolécules qui auront un rôle à l'extérieur de la cellule (récepteurs membranaires, matériel de construction de paroi, molécules de la matrice extracellulaire, etc.) Il existe deux types d’exocytose : a) L’exocytose régulée : déclenchée par Ca2+ Se produit par exemple dans les synapses et sert à la signalisation interneuronale. Exemple: exocytose d'acétylcholine b) L'exocytose constitutive : permet la libération de composants de la matrice extracellulaire ou simplement la livraison de protéines membranaires nouvellement synthétisées qui seront incorporées dans la membrane cellulaire au moment de la fusion de la vésicule de transport. G- Reconnaissance et adhérence cellulaire 1) Mécanismes Dans un organisme pluricellulaire, les cellules ne sont pas disposées de manière anarchique mais forment des ensembles ordonnés. Ceci suppose que les cellules puissent reconnaître leur environnement : matrice extracellulaire ou autres cellules. Ceci se fait grâce à des molécules d’adhérence qui sont des protéines transmembranaires. La plupart de ces molécules d’adhérence ne sont fonctionnelles qu’en présence de calcium dans le milieu extracellulaire. 58 On distingue l’adhérence homotypique (entre cellules d’un même type) de l’adhérence hétérotypique (entre cellules de types différents). Sur le plan moléculaire on distingue l’adhérence homophile (entre molécules d’adhérence identiques) de l’adhérence hétérophile (entre molécules d’adhérence différentes). Les molécules d’adhérence sont regroupées en 4 classes principales en fonction de leur structure : Les sélectines reconnaissent des résidus glucidiques du glycocalyx d’une cellule adjacente. Elles jouent un rôle important dans la reconnaissance de la paroi des vaisseaux sanguins par les globules blancs (reconnaissance intercellulaire hétérotypique). Les CAM de la famille des immunoglobulines, reconnaissent soit une molécule de la même famille sur la cellule adjacente (l’adhérence est alors indépendante du calcium), soit une intégrine. Elles sont importantes pour les interactions intercellulaires dans le système nerveux. Les cadhérines sont des molécules d’adhérence intercellulaire. On distingue des cadhérines desmosomales restreintes à certaines jonctions et des cadhérines classiques qui jouent un rôle très important dans les phénomènes de reconnaissance homotypique (entre cellules de même type). En effet, l’expression des différentes cadhérines classiques présente une spécificité tissulaire. Les intégrines sont importantes pour la reconnaissance de la matrice extracellulaire. Elles sont formées de deux chaînes associées de manière non covalente. 2) Rôles Les contacts de la cellule avec ses voisines ou avec la matrice extracellulaire influencent son comportement. Les contacts cellulaires informent la cellule sur son environnement immédiat. Les contacts cellulaires jouent notamment un rôle dans ce que l’on appelle l’inhibition de contact. On appelle inhibition de contact l’arrêt des divisions cellulaires que l’on observe quand les cellules deviennent jointives c’est à dire quand les cellules entrent en contact les unes avec les autres. Quand les cellules perdent ce caractère d’inhibition, elles se multiplient de façon anarchique (cas des cellules cancéreuses). H- Jonctions cellulaires 1) D’ancrage Ces jonctions relient le cytosquelette d’une cellule soit au cytosquelette des cellules voisines, soit à la matrice extra-cellulaire. En fonction des éléments du cytosquelette (filaments intermédiaires ou microfilaments) et en fonction du type de contact (avec une autre cellule ou avec la matrice extra- cellulaire) on distingue 4 types de jonctions d’ancrage : 59  a) Liées aux filaments intermédiaires : sont bien visibles en microscopie électronique. - Entre cellules : Desmosomes Leurs molécules d’adhérence sont des protéines transmembranaires de la famille des cadhérines, et de la sous famille des cadhérines. Dans le cytosol, sous la membrane plasmique se trouve une zone très dense aux électrons appelée la plaque cytoplasmique. Cette plaque cytoplasmique est formée par des protéines qui relient les molécules d’adhérence au cytosquelette. Les filaments intermédiaires viennent s’ancrer sur la plaque cytoplasmique. Les desmosomes relient donc les filaments intermédiaires de deux cellules adjacentes. www.bio-top.net 60  - Avec la matrice extra-cellulaire : Hémidesmosomes La molécule d’adhérence est une intégrine particulière. On observe des filaments intermédiaires qui convergent et s’ancrent sur une plaque cytoplasmique sous membranaire. Les molécules de la plaque sont différentes biochimiquement des molécules trouvées dans les desmosomes. Par contre, elles jouent le même rôle, c’est à dire qu’elles relient le cytosquelette aux molécules d’adhérence transmembranaires. Aperçu de la jonction dermo-épidermique et des hémidesmosomes (thèses ulaval.ca) 61  b) liées aux filaments d’actine : sont plus discrètes. - Entre cellules: Jonctions adhérentes. Elles se composent de molécules d’adhérence qui sont des molécules transmembranaires appartenant à la grande famille des cadhérines. Ces cadhérines ont un domaine cytoplasmique différent des cadhérines que l’on trouve dans les desmosomes, et appartiennent à la sous famille des cadhérines classiques. Ces molécules d’adhérence sont reliées au cytosquelette par des protéines de la plaque (non visible en microscopie). Le cytosquelette est représenté par les filaments d’actine. - Avec la matrice extra cellulaire: contacts focaux. Dans les contacts focaux, l’adhérence est médiée par des molécules de la famille des intégrines. Tout comme dans les jonctions précédentes, la liaison aux filaments d’actine se fait par l’intermédiaire de protéines de la plaque non visible en microscopie électronique. 2) Communicantes ou jonctions de type gap : Au niveau des jonctions de type gap, des protéines transmembranaires forment des pores dans la membrane. Ces pores sont appelés connexons, ils sont formés de 6 sous unités protéiques, les connexines. Chaque jonction de type gap peut contenir quelques centaines de connexons. Chaque connexon est aligné avec un connexon de la cellule adjacente. L’alignement de 2 connexons sur deux cellules adjacentes forme un canal par lequel peuvent transiter de petites molécules hydrosolubles (les acides aminés, les oses simples, les nucléotides mais aussi les ions). La perméabilité des jonctions communicantes est régulée, et les connexons peuvent être ouverts ou fermés. Dans les tissus électriquement excitables, comme le myocarde, elles sont indispensables à la diffusion rapide du potentiel d’action. Donc, dans le cœur, les gap jonctions sont indispensables à la synchronisation des contractions des cellules du myocarde. www.futura.sciences.com 62  3) Serrées Les jonctions serrées ou étanches ou imperméables sont spécifiques des tissus épithéliaux. Elles bloquent la circulation de fluides entre les cellules (voie paracellulaire) et assurent ainsi l'étanchéité entre deux compartiments tissulaires. A ce niveau, l’interaction entre des protéines transmembranaires de deux cellules voisines ferme l’espace intercellulaire. Ces jonctions contrôlent le passage des substances entre les cellules. Cependant, elles peuvent laisser passer certains peptides, plutôt hydrophile de petites taille (< 15 nm), notamment au niveau du tube digestif lors de la digestion. L'élément principal contribuant à la formation de cette jonction est une protéine nommée claudine.. Les différents mécanismes d'adhérence des cellules entre elles et des cellules au milieu extra-cellulaire 63