Resumo - Citoquímica e Membrana Celular 1 - PDF

# ESTUDO DA BIOLOGIA CELULAR ## Microscopia de Luz Lóptico - Transiluminação - Limite de resolução: 0,2µm - Cortes histológicos - Micrótomos - **Procedimentos:** - **Fixaçã**o química: soluções de agentes denaturantes estabilizadas (Formaldeído 4%) - Fixadores duplas - Permear - 12 hor...

# ESTUDO DA BIOLOGIA CELULAR ## Microscopia de Luz Lóptico - Transiluminação - Limite de resolução: 0,2µm - Cortes histológicos - Micrótomos - **Procedimentos:** - **Fixaçã**o química: soluções de agentes denaturantes estabilizadas (Formaldeído 4%) - Fixadores duplas - Permear - 12 horas a 2 dias - Etanol - Consistência rígida - **Desidratação** - **Inclusão** - Impregnar tecidos com parafina - **Fixação física por congelação** - Rápido (usado em hospitais) - **Coloração** - Evidenciar as estruturas - **Azul de toluidina e azul de metileno (BÁSICOS)** - Revela estruturas basófilas (ÁCIDOS): Ácidos nucleicos - **Eosina, fucsina (ÁCIDOS)** - Revela estruturas acidófilas (BÁSICAS): Mitocôndrias, colágeno - **Hematoxilina e cosina (comum)** - INOGEM: Preta, branco e cinza - **Microscopia de contraste de fase** - Visualização de objetos quase transparentes - Células e tecidos não corados (vivos) - Feixe de luz muito estreito (LASER) - Delgado do espécime - Imagem passa por um orifício muito pequeno - + precisão do que o MO - **Microscópio Confocal** - Focalizar um plano muito delgado do espécime - **Microscopia de Fluorescência** - Forte luz de mercúrio (Hg) - Alta pressão - Correntes fluorescentes ## Microscopia Eletrônica - **De Transmissão:** - Dispersão de elétrons - Imagem é formada pelo balance da quantidade de elétrons que alcançaram o detector e elétrons que ficaram retidos no tubo - Imagem sempre em preto e branco - Áreas escuras são elétrons-densas (absorção) e as claras são elétrons-lucentes - **De Varredura:** - Feixe de elétrons é muito pequeno → Não atravessam o espécime - Varrem uma delgada camada de metal previamente aplicada - Imagem em preto e branco pseudo tridimensionais ## Citoquímica - Métodos que identificam e localizam substâncias em células e matriz extracelular - MO e ME - **Reação de Feulgen** - DNA, RNA - Reagente de Schiff incolor fica vermelho ao entrar em contato com os grupos aldeído de DUA - Hidrólise das bases púricas, deixando livres as extremidades que possuem aldeídos - **Reativo de Schiff** - **Quantificar DNA** - Nucléolo tem muito RNA, logo, com essa técnica fica claro (esbranquiçado) - RNA é degradado e Feulgen - - **RNA** - Seu estudo citoquímico é baseado em sua basofilia - ETADAS: 2 preparações (Em uma será adicionado a ribonuclease) - Ataca exclusivamente o RNA - Coração - Azul de toluidina (RNA aparecerá corado por ser basófilo) - Comparação das duas lâminas no microscópio ## Polissacarídeos: Reação de Ácido Periódico-Schiff (PAS) - Adiciona-se o reagente de Schiff aos resíduos 1,2-glicol dos açúcares em aldeídos - **Glicogênio:** - 2 lâminas: Tratado com alfa-amilase (degrada o amido) e Não tratado - Não tratada, apresentará a parte corada pelo PAS (glicogênio) ## MTT - É um ensaio metabólico para avaliação de viabilidade e proliferação celular (in vitro) - É um ensaio colorimétrico que avalia a citotoxidade ou a atividade citostática de ag. farmacológicos ou tóxicos - **Metiltetrazoli - ORGÂNICO, HETEROCÍCLICO, SINTÉTICO** - Coloração amarela - Removido pela célula metabolicamente ativa - **Coloração roxa** - ↑ Viabilidade celular - **Conversão:** - Composto roxo (FORMAZANO) - Células metabolicamente ativas - Analisa-se a intensidade da cor ## Imunocitoquímica - Permite o estudo da localização intracelular de proteínas específicas - Células em cultura ou em cortes de tecido - **Direta:** - Anticorpo & Marcador - Liga-se diretamente à proteína - Evidenciando sua localização - **Indireta:** - 2º anticorpo preparado previamente - Técnica + sensível - Anticorpo → Anticorpo 2 (anti-anticorpo 1) + Marcador - Localiza com precisão uma molécula proteica, excluindo outras existentes na célula - Antigên: Etapa 1 → Etapa 2 → Etapa 3 → Etapa 4 - Lavagem → Microscopia ## Imuno-Histoquímica no Câncer de Mama - **Possibilidade de avaliação da expressão proteica simultaneamente com o exame da farma das células** - Diferenciação clara da função - **Score de reação para Her2:** 0 (negativo) - 1+ - 2+ - 3+ (positivo) - **Possibilita a identificação de sequências específicas de DNA ou RNA** - **FISH (Hibridização fluorescente in situ)** - Permite a detecção e localização de fragmentos cromossômicos específicos por meio de sondas marcadas - Fluoroforos - União de duas moléculas de cadeia única de ác. nucleicos - **Sondas** - Ligação de DNA sobre desnaturação por calor ou ag. desnaturantes, fazendo com que suas duas cadeias se separem - A sonda é ligada a um marcador (Hibridização) - Em solução - Lavagem da lâmina para visualizar o marcador na sonda ## Membrana Plasmática - Vista em microscopia eletrônica - **Estrutura:** Bicamada lipídica - **Composição:** Lipídeos, proteínas e carboidratos - **Principais:** - **Lipídeos:** - Fosfoglicerídeos, esfingolipídeos e esteróis + glicolipídeos - **Colesterol:** Anfipático - Cabeça hidrofílica, Caudas hidrofóbicas - **Fosfolipídeos:** - **Fosfoglicerídeos:** Ácido graxo + Glicerol + Fosfato - **Esfingolipídeos:** Ácido graxo + Esfingosina + Fosfato - Principais: Fosfatidiletanolamina, Fosfatidilserina, Fosfatidilcolina, Esfingomielina e Esfingosina **A bicamada é um fluido bidimensional:** - Descoberta a partir do estudo de liposomos - Vesículas esféricas 1. **As moléculas fosfolipídicas se movimentam de um lado para o outro da monocamada rapidamente:** - **Flipases:** Catalisam o rápido flip-flop dos fosfolipídeos - Proteínas de membrana translocadores de fosfolipídeos 2. **Moléculas lipídicas trocam de lugar rapidamente com suas vizinhas dentro de uma mesma monocomada.** 3. **Moléculas lipídicas giram rapidamente ao redor de seu maior eixo.** **A fluidez é precisamente regulada e depende da composição da bicamada e da temperatura.** - **Natureza das caudas de hidrocarbonato:** Caudas curtas - Mais fluidas / Caudas longas - Mais viscosas - **Insaturação:** + Insaturação - Mais fluidas - **Bactérias e leveduras ajustam a composição da membrana para compensarem as flutuações de temperatura que sofrem.** - **O colesterol tende a enrijecer a membrana, tornando-a menos fluida e menos permeável.** - **Balsas Lipídicas:** União dinâmica e temporária de lipídeos e proteínas específicos para a formação provisória de regiões especializadas - Apresentam um espessamento da membrana - **Gotas Lipídicas:** Excesso de lipídeos (estocagem) de onde pode ser obtida matéria-prima para a síntese de membrana **A assimetria da bicamada é importante para a conversão de sinais extracelulares em sinais intracelulares.** - **Os animais exploram a assimetria dos fosfolipídeos de sua membrana para distinguir entre células vivas e mortas.** - **Glicolipídeos:** Estão na superfície da membrana - Monocamada externa - Possuem uma simetria exagerada em sua distribuição na membrana - Importantes efeitos elétricos e de reconhecimento celular ## Proteínas de Membrana - Desempenham a maioria das funções específicas da membrana - "Amaciam-se" à membrana de diferentes formas - São anfipáticas - Fornecem à cada membrana as características e propriedades funcionais **Muitas proteínas atravessam a membrana - Transmembranas - Sempre possuem orientação única** - **Proteínas de Curvatura** ## * Todas as proteínas responsáveis pelo transporte de íons e de pequenas moléculas solúveis em água pela membrana são de passagem múltipla ## * Proteínas se ligam à porção não citossólica pela ancora GPL (algumas) ### **Maioria (α-hélice)** - A maioria das proteínas transmembrana das células animais é glicosilada - Intervém na interação indesgáveis célula-célula - **O uso de detergentes na solubilização e purificação das proteínas:** Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS) ### **BACTERIORRODOPSINA:** - Primeira proteína de transporte de membrana cuja estrutura foi determinada - Converte a energia solar em um gradiente de prótons, o qual fornece energia à arqueia - 208 intensa - Bombeando de prótons estimula a produção de ATP - Estabelece um gradiente de H+ - Segunda proteína - Centro de reação fotossintética bacteriano ### **As proteínas de membrana frequentemente atuam como grandes complexos (difusão rotacional)** ### **As proteínas não saltam através da membrana (flip-flop) mas giram sobre um eixo perpendicular ao plano da bicamada (difusão lateral) - Próx. à região citoplasmática** - **Algumas proteínas podem mover-se lateralmente (difusão lateral)** - **O citoesqueleto cortical proporciona força mecânica e restringe a difusão de proteínas na membrana** - Rede de proteína filamentosa - Forma a "contese" da célula - Funções cruciais (movimento celular, endocitose, etc) - Mantém a integridade estrutural e a forma da membrana - Restringe a difusão - Funciona como uma barreira mecânica ## Panagem único - **TRANSMEMBRANICA** ## **Passagem múltipla** - **ASSOCIADA À MONOCAMADA POR MEIO DE UMA α-HÉLICE** ## **LIGADA A LIPÍDEOS** ## **LIGADA A PROTEÍNAS**