Recombinación de DNA FYC.pdf

Recombinación Genética Intercambio físico de material genético entre elementos por rotura y unión de cadenas. Procesos Celulares donde ocurre recombinación  Meiosis: para crear diversidad en la progenie.  Reparacion: reparación homologa por rotura de doble cadena.  Inserción de E...

Recombinación Genética Intercambio físico de material genético entre elementos por rotura y unión de cadenas. Procesos Celulares donde ocurre recombinación  Meiosis: para crear diversidad en la progenie.  Reparacion: reparación homologa por rotura de doble cadena.  Inserción de Elementos foráneos: Virus, transposones, etc.  Rearreglos del ADN para crear diversidad: Sistema Inmune.  Conjugacion Bacteriana. Procariotes. Recombinación entre secuencias homólogas La recombinación juega un papel importante permite a los genes distribuirse en diferentes combinaciones.  Evento en eucariotes  Por ej. La recombinación genética resulta del intercambio de genes entre los pares de cromosomas homólogos durante la meiosis.  Recombinación: diversidad y reparación ◼ La recombinación además de generar diversidad, también es un mecanismo importante para la reparación del ADN. ◼ La recombinación está implicada en la reorganización de secuencias específicas de ADN que alteran la expresión y función de algunos genes durante el desarrollo y la diferenciación. Diversidad: diferencia entre organismos por variaciones en el material genético (mutaciones, recombinación, etc) que pasa de generación en generación. Es la materia prima de la evolución. Procariotes  Evento en procariotes  Recombinación durante la conjugación. Tipos de recombinación Recombinación general u homóloga Recombinación específica (no-homóloga), en la que a su vez distinguimos:  a) Rec. específica legítima, conservativa;  b) Rec. específica “ilegítima”, propiciada por elementos genéticos transponibles  1. Recombinación general u homóloga  Puede ocurrir en cualquier lugar del genoma, por emparejamiento entre pares de secuencias que presenten una homología suficientemente extensa (regiones mas propensas a emparejamiento).  Depende de la intervención de un complejo enzimático  Modelos de recombinación homóloga: pasos 1. Alineación de moléculas homólogas (secuencias idénticas o casi idénticas (100 bp). Variantes secuenciales diferentes del mismo gen (alelo) 2. Introducción de roturas 3. Formación de regiones cortas de apareamiento de bases (invasión de cadenas y recombinación) unión de holliday. 4. Migración de las ramas 5. Escisión de la unión de Holliday (resolución)  Modelo de Holliday  Apareamiento por bases complementarias, sin pérdidas o ganancias de material genético  Formación de región heteroduplex  Intermediario de Holliday  Resolucion de union de holiday Corte de la unión de Holliday. Dos pares alternativos de sitios del ADN se pueden cortar durante la resolución. La escisión en el par de sitios 1 genera el "empalme" o los productos cruzados(recombinados). La escisión en el par de sitios 2 produce los productos "en forma de parche" o no cruzados. https://www.youtube.com/watch?v=vLuWg1IxoJ4 Tipos de recombinacion Homologa Parche Empalme Reparación Recombinación en Meiosis Enzimas implicadas en la recombinación homóloga en procariotes  Análisis genéticos, han permitido establecer que la recombinación requiere enzimas específicas además de proteínas (ADN polimerasa, y ligasa).  Complejo RecBCD (actividad helicasa (recB/D)/nucleasa) unión a DNA, sustrato DNA con colas monocatenarias  Sitios chi (cross-over hotspot instigators)  La proteína principal implicada en recombinación: RecA promueve el intercambio de cadenas entre las moléculas de ADN homólogas. Diagrama esquemático de la generación de colas monocatenarias en roturas bicatenarias por el complejo RecBCD. 1. RecA se une al ADN de cadena sencilla, envolviendo al ADN para formar un filamento proteína-ADN. 2. RecA es capaz de unirse a una segunda molécula de ADN de doble cadena, para formar un complejo entre las dos moléculas de ADN. 3. La asociación no específica mediada por RecA continua con el apareamiento específico de bases entre el ADN de cadena simple y su complementario. RecA cataliza el intercambio de cadenas. Proteínas para escisión de cadenas de DNA (RESOLVASAS) complejo Ruv Formación de holliday  Complejo RuvAB/C reconoce uniones de Holliday y promueve migración de las ramas RuvA (tetrámero) y Ruv B (hexámero) unión a cadenas Ruv C escinde cadenas Estructura de alta resolución de la RuvA y esquema del Estructura de alta resolución de la resolvasa RuvC y complejo RuvAB asociado con el DNA de la unión de esquema del dfmero de RuvC asociado con el DNA de la Holliday. unión de Holliday. Enzimas implicadas en la recombinación homóloga en eucariotes Recombinación meiótica Segregación de cromosomas  Spo11: corta en ambas cadenas  Complejo enzimático MRX (Mre11, Rad50 y Xrs2) Spo11: corta en ambas cadenas  Complejo MRX (Mre11, Rad50 y Xrs2); similar a RecBCD  Unión a sitios de recombinación.  DMC1 es análoga a RecA (exclusiva en meiosis)  Rad51 homóloga a RecA  Rad52 ayuda a promover el armado de los filamentos, ayuda a unión de RecA en ssDNA (similar a RecBCD)  Mus81 (homóloga a resolvasas)  2. Recombinación específica de sitio conservadora CSSR = (conservative site-specific recombination)  Recombinación entre dos elementos de secuencia definidos: sitios de recombinación (cortos y específicos 20bp)  Proteínas recombinasas  Típica de la integración de genomas de fagos en sitios concretos (Fago λ) Bacteriófago  infecta a E. coli usando integrasa (Int)  ciclo lítico  Ciclo lisogénico: integración (profago) se mantiene como parte del genoma de E. coli. Infección lisogénica: ADN de  se recombina con el genoma del huésped para formar un profago que se integra en el cromosoma de E. coli. Tres tipos de recombinación CSSR Región crossing over en ambas secuencias Serina recombinasas y tirosina recombinasas (rompen y sellan) Estructuras que participan en la CSSR. El par de secuencias de reconocimiento para la recombinasa simétricas flanquea la región de crossing over donde se produce la recombinación. Las subunidades de la recombinasa se unen a estos sitios de reconocimiento. Integrasa (Int reconoce sitios de adhesión (sitios att, attachment). attP (phage) y attB bacteria. (240-250 nt).  Mecanismo Integración Fago   Integrasa  Int se une específicamente a las secuencias attP y attB y rompe en sitios específicos.  Después cataliza el intercambio de cadenas y su ligamiento.  Finalmente el resultado es la recombinación entre attP y attB y la integración del ADN .  Integrasa también actúa en la escisión del profago  (proceso contrario a integración) con ayuda de proteína Xis (excise). Serina recombinasas Mecanismo de intermediario covalente utilizado por las recombinasas de serina y tirosina. Aquí, se muestra que un grupo OH de una serina del sitio activo ataca el fosfato y por lo tanto introduce una ruptura de una sola hebra en el sitio de recombinación. El grupo OH liberado en el ADN roto puede volver a atacar el enlace covalente proteína-ADN para revertir esta reacción de escisión, volver a sellar el ADN y liberar la proteína. (Azul) La recombinasa esta etiquetada como Rec. Reorganizaciones programadas dentro de los genomas: Recombinación V(D)J  En vertebrados la recombinación específica de sitio resulta crítica para el desarrollo del sistema inmune, que reconoce sustancias ajenas (antígenos) y proporciona protección frente a agentes infecciosos.  Dos clases principales de respuestas inmunes, mediadas por linfocitos B y T.  Linfocitos B:  Linfocitos T:  Producen anticuerpos  Expresan proteínas de (inmunoglobulinas) que superficie celular (receptores reaccionan contra antígenos de células T) que reaccionan solubles. con antígenos expresados en la superficie de otras células. Característica principal de inmunoglobulinas y los receptores de células T: gran diversidad, que permite reconocer un inmenso número de antígenos ajenos. Anticuerpos diversos codificados por genes únicos de linfocitos que se forman durante el desarrollo del sistema inmune como resultado de la recombinación específica de sitio entre los distintos segmentos de los genes de las inmunoglobulinas y los receptores de células T. Mecanismo de recombinación V(D)J Las recombinasas catalizan el corte monocatenario en los extremos de las secuencias de señal, donde dejan un OH 3' libre. Luego cada OH 3' inicia el ataque de la cadena opuesta para formar un intermediario en horquilla. A continuadón, las estructuras en horquilla se hidrolizan y después se unen para formar una unión codificadora entre las regiones V y J. Reorganización de los genes de cadena ligera de las inmunoglobulinas Reorganización de los genes de cadena pesada de las inmunoglobulinas  3. Recombinación transposicional La transposición es una forma específica de recombinación genética que mueve ciertos elementos genéticos de un sitio del DNA a otro. Estos segmentos de DNA móviles se denominan elementos transponibles o transposones. Exhiben escasa selectividad en la elección del sitio de inserción Transposones en genomas: ocurrencia y distribución. (Verde) Elementos repetidos, en su mayoría compuestos por transposones o secuencias relacionadas con transposones (como elementos truncados); genes celulares (violetas).  3. Clases de transposones 1. Transposones de DNA. Transposones de ADN 2. Retrotransposones semejantes a virus. Esta clase incluye los retrovirus. Estos elementos también reciben el nombre de retrotransposones de repeticiones terminales largas o LTR (del inglés, long terminal repeat). 3. Retrotransposones de poli-A. Estos elementos también se conocen como retrotransposones no víricos. Transposones de DNA portan gen de transposasa flanqueado por sitios de recombinación IR: secuencias invertidas repetidas, sitios de recombinación  El mecanismo de transposición de cortar y pegar. Movimiento de un transposón desde un sitio de destino en el host (gris)ADN a un nuevo sitio en el ADN (azul). los sitios de insercion escalonados en el ADN dan lugar a secuencias cortas repetidas en el nuevo sitio de destino (duplicaciones del sitio de destino). El ADN en el sitio de inserción original(aquí en gris) quedara con una doble Rotura del ADN como resultado del transposón- excsion. Esta ruptura se reparar mediante unión de extremos no homólogos o recombinación homóloga.  Retrotransposones Mecanismo de integración retroviral y transposición de los retrotransposones. El promotor de la transcripción del ARN viral está incrustado en el LTR izquierdo como se muestra. Se muestran los pasos de corte y transferencia de ADN catalizados por la integrasa.  Transposones polyA Un modelo para el movimiento de un elemento LINE (Elementos Nucleares Dispersos Largos) por transcripción inversa cebada por el sitio diana. Una ARN polimerasa celular inicia la transcripción de una secuencia LINE integrada. El ARNm resultante se traduce para producir los productos de los dos ORF codificados que luego se unen en el extremo 3 'de su ARNm. El complejo proteína-ARNm luego se une a un sitio rico en T en el ADN blanco. Las proteínas inician corte en el ADN diana dejando un 3'-OH en el extremo del ADN y formando un híbrido ARN: ADN. El extremo 3'-OH del ADN objetivo sirve como cebador para la transcripción inversa del ARN para producir ADNc (síntesis de la primera hebra). Los pasos finales de la reacción de transposición son una segunda síntesis de las hebras y unión y reparación de ADN para crear un elemento LINE recién insertado.