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Ricombinazione Sito Specifica Conservativa Non homologous end-joining e ricombinazione omologa avvengono quando il DNA viene tagliato in entrambi i filamenti. Dunque se si attiva la NHEJ questa genererà errori nel DNA, se si riesce a far avvenire la HR invece no. Bisogna veicolare gli enzimi...

Ricombinazione Sito Specifica Conservativa Non homologous end-joining e ricombinazione omologa avvengono quando il DNA viene tagliato in entrambi i filamenti. Dunque se si attiva la NHEJ questa genererà errori nel DNA, se si riesce a far avvenire la HR invece no. Bisogna veicolare gli enzimi di restrizione, favorire la sequenza del gene, andando ad esempio a modificare una base che si è riscontrata in un paziente, e dunque andare a formare un modello da poter analizzare in laboratorio. Questo sfrutta il fatto che si attivano questi due sistemi una volta tagliato il DNA. Si va a generare una molecola ricombinante che abbia una porzione di taglio di DNA e una porzione che riconosca il danno al DNA. Andando a scombinare la sequenza, il gene viene inattivato —> Knockout Se invece si fornisce una molecola di DNA omologo, con la sequenza corretta, lo si modifica con una piccola variazione, allora lo si può inserire —> Knockin Vengono usati degli enzimi i detti FokI, il quale non è molto specifico, per dare specificità infatti sono usati fattori di trascrizione detti ZFNs posti uno accanto all’altro che in base alla struttura proteica riconoscono sequenze specifiche, e SFN1-3. - tutte le cellule - Tarda fase S e G2 - canonica - non canonica —> errore La citosina deaminasi introduce una transizione in un codone per portare l’enzima nel sito, dunque per veicolarli in siti specifici del genoma. Serve per trasformare una citosina in uracile permettendo a questa variazione di essere selettivamente rilevata ed essere portata in un locus specifico grazie a dell’RNA in grado di appaiarsi in questa sequenza. RICOMBINAZIONE SITO SPECIFICA Sono ricombinazioni del DNA in sequenze specifiche che permettono in presenza di enzimi specifici, di ruotare frammenti di DNA e vengono fatti ad opera di enzimi detti ricombinasi. Vedremo come un frammento può essere rimosso o inserito nel DNA. Questi meccanismi permetteno ad alcuni batteri di ruotare una regione del genoma per avere geni per l’adattamento ambientale, non esponendo le proteine che vengono riconosciute normalmente dagli anticorpi. I fagi sono molto utilizzati per analisi dei genomiche. Sono virus in grado di attaccare i batteri. Sono composti da una testa con dimensioni esatte per accomodare il genoma di circa 49 mila basi, e una coda. Sono strutture che si autoassemblano. Il suo genoma ha delle regioni protrudenti in 5’, sono le famose regioni cosL e cosR che hanno permesso di leggerne la sequenza in quanto molto semplici da analizzare. Sono regioni complementari che permettono dunque al genoma di circolarizzare. Sarà questo genoma circolare a infettare il batterio. Ha sequenze all’interno del genoma, che sono complementari a quelli del batterio, così da poteri integrare nel suo genoma e infettarlo formando il batterio fago. Questi sono i siti di ricombinazione Il fago riesce ad integrarsi grazie a particolari proteine dette integrarsi. Il DNA poi deve ripiegarsi per essere è scisso. att SITO DI RICOMBINAZIONE I siti di ricombinazione hanno sempre una polarità definita. Hanno: altr Coppia di sequenze di riconoscimento della ricombinasi organizzate in modo simmetrico int Regione di scambio, crossover region, asimmetrica che si trova tra le due sequenze di riconoscimento. Qui avvengono taglio e riunione del DNA. È dunque dove avviene la ricombinazione sito specifica. stessa Polarità TAGC TAGC TAGC GCTA Queste due sequenze identiche permettono → POLARITÀ al fago di attaccarsi e staccarsi. Quindi può causare escissione del DNA. Quando le sequenze sono invertite, si accoppieranno ripiegandosi, dunque causando un’inversione del DNA. Le ricombinassi/ integrasi formano un intermedio di reazione DNA-enzima con: Serina Ricombinasi Tirosina ricombinasi Ci sono due siti che devono ricombinare per poter entrare. Gli amminoacidi hanno entrambi un OH che possono utilizzare per attaccare e rompere il legame fosfodiesterico. Il DNA diventa così ibrido, in parte provenitene dal batterio e in parte proveniente dal fago. Si ottiene così il sito ibrido. La ricombinazione richiede il legame di quattro molecole di ricombinasi. Se sono due DNA, a ogni sito deve legarsi una molecola di enzima, che andranno a tagliare e permettere la ricombinazione. Serina e Tirosina ricombinasi lavorano in modo leggermente diverso. SERINA RICOMBINASI Si ha una molecola R1 che lega il primo sito del DNA batterico, la molecola R2 lega l’altro sito. In mezzo viene tagliato il DNA. Il taglio viene effettuato in quanto la serina può attaccare il fosfato lasciando un 3’-OH. Si forma un intermedio. Sarà coinvolto uno ione metallico per spostare le cariche e permettere l’attacco. Vengono tagliati tutti e quattro i filamenti. Avviene ora una rotazione, R1 va in basso e R3 va in alto. Così poi si chiude il DNA e quindi si ottiene il DNA ricombinato. Le analisi strutturali permettono di capire come le ricombinasi con la loro serina riescano a tagliare il DNA. Hanno infatti 4 subunità con delle alpha eliche, che sono regioni generalmente idrofobiche quindi sono scivolose permettendo di slittare e ruotare avendo così la ricombinazione.  TIROSINA RICOMBINASI Vene tagliato un solo filamento alla volta, in questo caso il fosfato lascia libero il 5’-OH. Avviene poi la rotazione con la giunzione di Holliday. A questo punto si attivano anche le ricombinasi del filamento inferiore, agendo sempre allo stesso modo: l’ossidrile attacca il fosfato e lascia 5’-OH libero. Avviene così lo scambio del filamento e la risoluzione della giunzione di Holliday. Il risultato è lo stesso ma avviene su un filamento alla volta e non ha la regione idrofobica dell’ alpha-elica. Vengono attivate in momenti differenti. Cre-loxP È una tirosina ricombinasi ed è una delle più importanti per i biotecnologie, perché permette ricombinazione in vivo. Si trova nel batteriofago P1, ed è codificata dal fago che catalizza la ricombinazione tra le due sequenze bersaglio. Funziona esattamente come le tirosina ricombinasi classiche. Le due subunità che si attivano prima (verdi) sono identiche, mentre quelle che si attivano dopo (viola), sono diverse. Cre ha dunque due conformazioni in base a se sono attivate oppure no. Le prime espongono la tirosina e permettono il taglio, le seconde si attivano quando il DNA è in una conformazione simile alla giunzione di Holliday. C’è un cambio configurazionale sequeziale tra le diverse subunità, I siti di riconoscimento della Cre ricombinasi sono ben conosciuti e possono essere inserite nei genomi che si vogliono ricombinare. Se ad esempio si hanno le sequenze poste in parallelo, quando agisce Cre ricombinasi, si va a eliminare la regione all’interno, andando così ad avere delle delezioni precise.  L’integrasi riconosce i siti. Si forma un ansa e se sono parallele si ha escissione del DNA. Se invece hanno direzioni opposte, si forma l’ansa che scambia e permette di ruotare la regione del genoma. Negli eucarioti l’enzima non c’è, dunque lo fornisco io. Non ci sono poi particolari sequenze che permettono di efffetturare delle ricombinazioni. È possibile solo e vengono aggiunte particolari sequenze che possono essere attaccate, in generale però non succede nulla se mancano queste. I nostri geni sono composti da esoni. I ricercatori a volte infieriscono siti loxP prima e dopo un esone. Quando li tratto con Cre-lox questo esone può subire delezione. In questo modo posso far agire la Cre ricombinasi per effettuare un knock-out anche negli eucarioti per inattivare un particolare gene. BATTERIO SALMONELLA Elude il sistema immunitario spegnendo l’espressione dei geni per il flagello. Opera grazie a una sequenza invertita. Ha due siti di ricombinazione HixL e HixR. Nella regione invertibile c’è un promotore a cui si lega RNApol santo origine a un messaggero per la flagellina H2 e uno per la H1. La prima è quella immunogenica e viene riconosciuta dagli anticorpi. Dunque per eludere il sistema immunitario bisogna che la salmonella blocchi l’espressione della flagellina H2. Le sue ricombinasi Hin si legano in modo appropriato e si pongono in modo parallelo per poi scambiare il DNA. Queste regioni nel momento in cui vengono legate da Hin vengono ruotate, nelle sequenze che producono le flagellina. La Hin si lega ai siti, che si avvicinano, ruotano e viene ruotato in modo che l’integrasi sia ancora presente. La flagellina H1 ha invece un promotore indipendente ed è continuata ad essere prodotta. Si formano una serie di anse quando avviene la rotazione.  Generazione Knock-Out e Knock-In Problema: generare modello murino (topi transgenici) nel quale si vuole modificare direttamente il genoma e non introdurre il DNA esogeno in modo casuale. È una specie con gestazione corta, in modo da avere una colonia velocemente. Si possono così generare modelli per sviluppare nuove terapie geniche e farmaceutiche per lo sviluppo di un nuovo farmaco. Le aziende richiedono infatti sperimentazioni del farmaco in vivo per essere sicuri possa curare ed essere ottimale per la malattia. Si cerca così di avere un modello con il particolare gene che si considera correlato alla malattia. KNOCK-OUT = si uccide il gene e duque non si esprime più KNOCK-IN = si modifica il gene, è ancora espresso, ma si fa esprimere una mutazione come nei pazienti, come ad esempio una mutazione genica. Questa tecnica: 1) Permette di modificare il gene endogeno 2) Mantiene la regolazione trascrizionale propria del gene endogeno 3) Viene modificato un allele alla volta permettendo di analizzare topi eterozigoti ed omozigoti MODIFICAZIONE LINEA GERMINALE DEGLI ANIMALI Bisogna avere una colonia in modo da avere più topolini modificati nel tempo, dunque è importante che l’intero animale, la linea germinale, sia modificata in modo da poterlo trasmettere alla progenie. 1) Le cellule animali, col procedere delle sviluppo embrionale, dopo la gastrulazione, (da E5.5 topo, E22 uomo), perdono progressivamente le loro potenzialità differenziative tanto che dopo il differenziamento non sono “normalmente” capaci di tornare a uno stadio non differenziato né di ripercorrere per intero il programma di sviluppo. Perdono la totipotenza, differenziandosi. 2) Le cellule somatiche e germinali si separano ad uno stadio precoce dello sviluppo. Per ottenere la modificazione della linea germinale negli animali si deve introdurre il DNA esogeno in cellule totipotenti ad uno stadio di sviluppo antecedente la formazione della linea germinale, dunque per il topo prima di cinque giorni e mezzo. Quando nascerà il topo potrà dunque trasmettere la mutazione ai figli. Ciò è molto complesso, pertanto gli scienziati hanno fatto delle scelte per l’utilizzo di linee di cellule totipotenti, che possono dare ogni tipo di tessuto, andandole a modificare e impiantare in un qualsiasi tessuto. Queste sono le CELLULE EMBRIONALI STAMINALI. Sono: Derivate dalla MASSA CELLULARE INTERNA della blastociste preimpianta Sono cellule TOTIPOTENTI: possono dare origine a tutti i tipi di tessuti durante lo sviluppo dell’animale Possono dare origine alla LINEA GERMINALE: ciò permette di trasmettere il transgene alla generazione successiva (Bradley, 1984) Si osserva l’ovocita dopo al fusione dello zigote, la morula e la blastociste. C’è la massa cellulare interna che è separata dai ricercatori e messa in coltura in vitro.  Sono molto semplici da coltivare e si possono conservare in azoto liquido per anni e annorum per poi rimetterle in coltura. Dunque l’idea consiste che, dato che modificare l’embrione è molto complesso, si possa dissociare, dividere e selezionare una cellula che sia modificata come desiderato, la si fa crescere e riprodurre in vitro ed è utilizzata per formare un nuovo embrione. Al di sotto delle staminali si osservano altre cellule che fanno da supporto. Si favorisce l’ingresso all’interno delle cellule e poi si spera che faccia ricombinazione omoologa.  Ciò nel senso che, se ci sono regioni di analogia (arancioni) può avvenire ricombinazione omologa, se man mano che si coltivano cellule si hanno danni, con rottura avendo così ricombinazione e inserimento del frammento (verde) all’interno del genoma. Non si vuole chiaramente e avere il DNA con il gene di interesse e il DNA voluto integrato in modo casuale in un’altra regione del genoma, questo perchè porta a casualità e modifiche in altri locus. Bisogna generare un DNA che favorisca il primo evento e non il secondo dunque si fa: RICOMBINAZIONE OMOLOGA IN VITRO Si fa una sostituzione mirata di un segmento di genoma endogeno con un segmento omologo di DNA esogeno. Smithies, 1985 riesce ad avere una ricombinazione omologa del gene della b-globina in ibridi di fibroblasti. La frequenza della ricombinazione omologa era però 1000 volte inferiore all’integrazione casuale. In cellule embrionali staminali la ricombinazione omologa è più efficiente (1987), scoperto da Mario Capecchi (Nobel per la medicina 2007). Proprio per il fatto che non sono specializzate e si correggono con ricombinazione omologa. Ha permesso di accelerare molto lo sviluppo per terapie. Bisogna generare una strategia che si la più efficiente per identificare le cellule in cui è avvenuta la ricombinazione omologa e non quella casuale. Consideriamo di voler fare un KNOCK-OUT in questo locus. Di fatto se si elimina il primo esone si elimina il punto in cui inizia la trascrizione, così questa non avviene. La prima cosa da fare è analizzare il locus: bisogna riconoscere l’esone e analizzare le cellule in cui è avvenuta la modificazione. Inserisco due sistemi di selezione: NEO => Si può inserire un enzima per la resistenza all’antibiotico neomicica, trattate con neomicina solitamente le cellule morirebbero, in questo caso sopravvivono. TK => Timidina Kinasi, modifica degli analoghi di nucleotidi per poterli inserire nel genoma del virus e bloccare la replicazione del DNA. Tra EcoRI e EcoRII ci sono le due regioni di omologia. Se avviene la ricombinazione dunque (indicata con delle croci) si osservano i due siti di ricombinazione, ottenendo nel genoma un locus che si presenterà con un locus modificato rispetto al wildtype, detto targeted.  Se una cellula è trattata con neomicina, entra nella cellula e si lega al ribosoma bloccando così la sintesi proteica. Dopo qualche giorno la cellula non riesce a produrre le proteine necessarie e muore. Se il gene è però trattato con NEO, questo va a fosforilare l’antibiotico, che non è più in grado di legarsi al ribosoma e in questo modo la cellula sopravvive. Le cellule che esprimono la timidina chinasi al contrario moriranno in quanto questa va a fosforilare aciclovir formando un analogo del nucleotide che viene incorporato nel DNA durante al sintesi, di fatto bloccandola. Sono sfruttate queste SELEZIONI per non andare ad analizzare ogni cellula. Si dice selezione positiva la resistenza alla neomicina. Si dice selezione negativa quella alla timidin chinasi. Quando si fornisce del DNA si può integrare ENTRAMBE a caso. Pertanto si avranno: cellule in cui non è avvenuto niente TK cellule in cui è avvenuta ricombinazione µ omologa casuale, si vuole eliminare questa Nulla casuale e quindi si tratta con ganciclovir ho ora due ricombinazioni avendo un genoma neo, ma in cui viene eliminata la timidin chinasi. VERIFICARE CHE È AVVENUTA RICOMBINAZIONE In primo luogo bisogna avere la mappa di restrizione. Se si tagliasse l’intero genoma con enzima Xba1 si osserva che hanno lunghezze: 9.8 all’inizio senza ricombinazione due frammenti da 4,2 e 6 => sommati non corrispondono a quello prima della ricombinazione è dunque avvenuto qualcosa. SOUTHERN BLOTTING Serve per trovare un singolo locus nel genoma. Mi permette di identificare frammenti specifici di DNA basandosi sul fatto che il DNA è formato da due filamenti e con una sequenza complementare possono permettere di identificare il locus. Uso una piccola sequenza sintetica omologa al DNA. Si usano così delle sonde. Se ho l’evento di ricombinazione omologa troverò che l’allele è tagliato da XbaI, usando una sonda verde avrò 6kb, la sonda rossa 4,3kb. È tra le prime metodologie utilizzate in biologia molecolare per trovare la locazione di un gene in un genoma, per definire delezioni nel genoma correlate a malattie genetiche e permette di definire a livello genomico il trans gene o la delezione di in un gene nella generazione di animali transgenici. Southern fu il primo a mettere a punto le condizioni per immobilizzare il DNA su un supporto solido (membrana di nitrocellulosa o nylon). Permise di definire l’organizzazione fisica di sequenze conosciute in genomi complessi. Permise i primi clonaggi di geni eucariotici e fu alla base della scoperta degli introni. Utilizzato per studi RFLP e per fingerprinting genetico. Permette di individuare le differenze tra i diversi individui, ad esempio in genetica forense. 1. Il genoma è molto grande dunque non può essere messo di per sè in gel di agarosio dunque viene prima digerito il DNA con enzimi di restrizione, in questo caso XbaI. 2. Viene fatto migrare in gel di agarosio, i frammenti più piccoli migrano più lontano con velocità inversamente proporzionale al peso molecolare. Ottengo così il DNA separato e da qui potrei mettere una sonda per ricercare le sequenze di omologia. Per permettere le situazioni di ibridazione si impiegano però molte ore, a temperature elevate per 16/24h. In questo tempo il DNA può diffondersi in quanto l’agrosio è poroso. Ci sarebbe dunque un bel paciugo, non si capirebbe nulla. 3. Si immobilizza il DNA su un supporto solido in modo che non si possa muovere. A questo punto può essere analizzato mediante ibridazione. È messo per capillarità, in una spugna con una soluzione salina sopra la quale è messa la lastra di nitrocellulosa/nylon. Sono posti poi sopra dei tovaglioli asciutti con un peso in modo che venga richiamata l’acqua per capillarità. La soluzione salina si muove e spinge così il DNA dal gel alla membrana, sulla quale si blocca. 4. La sonda ha una sequenza di DNA uguale al nostro frammento. In vitro posso usare una DNA polimerasi con un miscuglio di nucleotidi ad esempio radioattivi, con fosforo radioattivo in alpha, per poter marcare e riconoscere la sonda. Si forniscono poi tutti gli elementi per faravvenire la duplicazione. Per riassumere si prende il DNA genomico, lo si frammenta con enzimi di restrizione e lo si separa in base al peso molecolare. Si ottengono varie barre anche non precise, in quanto ci sono frammenti di varie dimensioni, non si riescono a distinguere. Lo si trasferisce, plotting, su una membrana da gel a membrana, avendo tutto il DNA trasferito. Lo si mette in presenza della sonda di fosforo 32 e lo si lascia per 16/24h a temperature di 60° abbastanza alte che sia denaturante ma che favorisca l’appaiamento con la sonda. A questo punto si lava via l’eccesso di radioattività e si va ad analizzare questa radiazione che viene dal fosforo 32. Si confrontano poi i pesi molecolari con una scala di DNA a peso noto. Si potrebbero anche sintetizzare dei primer con la PCR specifici dell’allele bersagliato, sia interni al transgene che esterni. Se avviene ricombinazione omologa si potrà fare la PCR. Con queste cellule in cui so essere avvenuta la ricombinazione a questo punto le posso inserire nell’embrione. Queste nell’immagine sono bellissime palline di cellule staminali che vengono iniettate all’interno di una blastociste con una super mini pipetta. Così si formano le cellule dell’embrione, che essendo precoce, si mischieranno con la massa cellulare interna endogena andando poi a contribuire alla formazione dell’embrione. SELEZIONE Questi eventi hanno una frequenza bassa. Non si può rischiare di utilizzare un numero di cavie eccessivo. Dunque bisogna cercare di massimizzare il processo. La selezione si basa sulla genetica. Le cellule utilizzate provengono da maschi di topi agouti. Sono caratterizzati da cellule che contribuiscono al mantello dando un pelo biondo. È un allele dominante. Si inseriscono le cellule ricombinatesu una blastocisti che non porta il gene agouti, ma il gene nero. Quando nascono i topolini: se non ci sono geni che hanno contribuito all’embrione, avrò topi neri se hanno contribuiti avrò topolini chimera, mix di macchie tutti biondi addirittura. Si prende un maschio chimera e lo si incrocia con una topa nera, avrò un agouti dominante e nero recessivo. Se viene trasmesso il gene in eterozigosi lo si osserva. Dunque i figli nasceranno proprio in eterozigosi con fenotipo agouti. Ci si trova ad avere dei topi con inserito il pezzo di genoma con allele dominante modificato. Questi topi si possono poi incrociare tra loro ecc. tutto secondo la genetica mendeliana. Solo il 5-40% dei topi che nascono conterranno effettivamente il transgene, dipende dal grado di chimerismo (se non fosse chimerico avremmo il 50% perchè il transgene si trova in eterozigosi) 1) Southern blotting sul DNA genomico con una sonda esterna al sito di ricombinazione (come in ES) 2) PCR sul DNA genomico con primers che analizzano la regione di ricombinazione (come in ES) Il DNA genomico viene purificato da un pezzettino di tessuto di ogni topo nato dopo iniezione dei transgene, processo assolutamente semplice e non doloroso. RICOMBINAZIONE OMOLOGA: Sostituzione mirata di un segmento di genoma endogeno con un segmento omologo di DNA esogeno 1) KNOCK-OUT: Il gene targeting può servire a sostituire il gene endogeno con una copia non funzionale: allele nullo 2) KNOCK-IN: il gene targeting presenta piccoli cambiamenti sito-specifici: analisi funzionale di mutazioni KNOCK IN Mutazione puntiforme => varia una base, se si trova nella regione codificante si ha una variazione della sequenza aminoacidica diversa portando a una proteina mutata con una conformazione completamente diversa, che può essere correlata a malattie genetiche. Wild type Mutante Problema = Come faccio ad inserire in una sequanza di DNA una mutazione a mio piacimento? Per replicare il DNA servono DNA polimerasi, nucleotidi, ioni, ecc. e il primer, che può essere come visto sintetizzato in laboratorio. Avendo il primer (rosso), voglio inserire una trasversione (T —> G) , dunque una mutazione puntiforme. La polimerasi ha bisogno di un aggancio in 3’ per poter lavorare. La molecola rossa si appaia dappertutto tranne per una piccola differenza. Andando a fare il calcolo della temperatura di appaiamento con la regola di Wallace, li calcolo tutti i nucleotidi tranne per questo nucleotide differente. Uso una temperatura leggermente più bassa e la polimerasi lavora. Si ottiene una molecola di nuova sintesi. Ne ottengo grandi quantità dai batteri, ed è tutto metilato. In vitro ho generato così un DNA emimetilato. Se si usa un enzima detto DpnI, ovvero un enzima di restrizione che lavora su DNA solo se metilato, allora si elimina tutto il wild type parentale, conservando solo quello di nuova sintesi, riuscendo a inserire una mutazione nel nuovo plasmide. COSTRUTTO PER GENERARE KNOCK-IN Si osserva il locus wild type e il vettore, targeting vector, consideriamo di voler inserire una mutazione nell’esone 1, bisogna avere la sequenza in vitro utilizzando mutagenesi. Viene inserita la mutazione (rosso) e viene messo il gene della neomicina (neo) all’interno dell’intero e. Avviene sempre la ricombinazione. Dopo aver bersagliato il locus si osserva l’esone 1 mutato, il gene della neomicina nell’introne, che verrà rimosso quando verrà sintetizzata la neomicina e in questo modo si otterrà una proteina con la mutazione. KNOCK-OUT CONDIZIONALE A volte la completa perdita di funzione, mutazione, di un gene può essere letale molto precocemente e pertanto ciò impedisce di studiare le funzione di questo gene. E' possibile sempre mediante ricombinazione omologa inserire sequenze che permettano di eliminare frammenti del genoma usando le ricombinasti. È utilizzato quando generalmente la mutazione è letale e non ci sarebbero altri modi per analizzarlo. Si possono generare modelli animali in cui il gene viene inattivato solo nel tessuto di interesse e nel momento desiderato. SISTEMA Cre-LoxP: 1) Cre è una ricombinasi del batterifago P1. 2) Riconosce sul DNA siti di 34bp (chiamati loxP), che comprendono due ripetizioni invertite di 13bp che fiancheggiano un elemento centrale di 8bp. Funziona bene in mammifero perchè la sua temperatura ottimale è di 37° C, dunque temperatura animale. Facendo esprimere la Cre ricombinasi si può tagliare così il DNA a piacimento. So che se si elimina il gene, non si sviluppa l’embrione. Dunque va fatto il knock-out solo in alcuni tessuti, oppure sviluppata una certa fase del tessuto embrionale. Bisogna sempre lavorare con il DNA il vitro e poi generare cellule staminali. Sono esperimenti molto lunghi. Si ha il locus e si vuole eliminare l’esone 1. Si osserva il targeting vector. Si inserisce il gene della neomicina nell’introne e si modifica, sempre con clonaggio ed enzimi di restrizione, a monte e a valle dell’esone 1, delle sequenze che corrispondono ai locus P. Dopo ricombinazione, l’esone 1 viene quindi fiancheggiato da due sequenze loxP. Per ora il gene si esprime in modo normale, ma viene definito locus flowed. Se si fa esprimere la Cre ricombinasi solo in una zona, questa appaierà loxP, e dunque si perde l’esone 1 solo in quella zona. Rimarrà sempre l’impronta col sito loxP dove è avvenuto il taglio con la Cre ricombinasi. Questo permette ad esempio di mettere ad esempio in un animale che esprime Cre ricombinasi in tutti i tessuti. Questa non riesce a entrare nel nucleo. Dunque i fattori di trascrizione che legano ad esempio gli estrogeni, sono detti inducibili perchè dopo essere stati studiati si è osservato che sono normalmente nel citoplasma, quando arriva l’ormone questi entrano nel nucleo. Esistono dunque delle forme di Cre che sono state accoppiate a fattori di trascrizione per essere inseriti nel nucleo. Si può quindi trattare il topolino con estrogeni e far entrare così Cre nel nucleo. Si può così indurre ricombinazione sito specifica solo nel momento in cui si tratta con estrogeni. Se invece ho le freccerete nelle direzioni opposte, dunque sempre ricombinasi ma una opposta all’altra. Succede che la Cre ricombinasi legando le due freccerete queste verranno invertite. Si inverte dunque la regione del genoma. Altra idea è inserire ATG, ovvero il primo codone per la proteina. Se si usa Cre si può togliere il codone di stop e si può andare ad accendere il gene solo quando si vuole. Ci sono oggi tantissime linee di topi disponibili, che esprimono la Cre ricombinasi già in tessuti specifici, ovvero i topi di èlite. Si riesce così a fare la delezione di un gene solo in tessuti specifici in particolari cellule.  Trasposoni RECAP La timidità chinasi è un'enzima virale che una cellula normalmente non esprime, quindi se faccio inserire il ciclovir che è una molecola che simula i nucleotidi ma non ha fosfati quindi non può essere usata dalla DNA pol. Se la cellula eucariotica esprime questo enzima virale (dell' herpes) va a fosforilare questa molecola, che ha ora 3 fosfati, la DNApol lo riconosce e lo inserisce nella catena, ma non è proprio un nucleotide e non ha OH in 3' quindi non riesce a continuare a inserire nucleotidi e blocca la sintesi del DNA. Questo porta alla morte della cellula. Per chimera si intende questo animale che non ha patrimonio genetico eterozigote, ha parti diverse con patrimoni genetici diversi. Sono cellule con patrimonio genetico diverso dato dalle diverse cellule, poi se questo nella sua gonade ha il gene , donerà l'aguti con il locus del gene delle cellule modificate. I patrimoni genetici delle vari parti dell'animale sono diversi. ELEMENTI TRASPONIBILI: sono sequenze che hanno la capacità di muoversi da un sito all'altro del genoma, su un batterio sullo stesso cromosoma, la trasposizione avviene da un sito donatore su un sito accettore di cui il trasposone ha scarsa selettività. Si muovono nel genoma in modo quasi casuale, DNA fincheggiante portando a ristrutturazioni del genoma che sono state alla base dell'evoluzione, infatti una grandissima parte del nostro genoma è composta da elementi trasponibili. Che effetti biologici possono avere? Diffusione di sequenze del genoma Modificazione delle proprietà dei geni: mutazioni per inserzione Generazione di nuove isoforme proteiche, può portare ad un nuovo dominio proteico Riarrangiamenti cromosomici Sono cambiamenti abbastanza importanti concluderà la lezione per farci vedere come meccanismi simili a quelli della trascrizione sono alla base della produzione delle globuline. Possiamo avere: Trasposoni a DNA Retrotrasposoni LTR : dei retrovirus Retrotrasposoni poli-A Un elemento trasposto può essere riconosciuto dalla presenza di sequenze ripetute da entrambe le parti. Possono avere anche delle sequenze terminali invertite che sono i siti di legame degli enzimi che attuano la trasposizione. Possono presentare DNA trasposasi, per i retrovirus le integrasi. Alcuni si chiamano a DNA perchè i Retrotrasposoni hanno invece un intermedio a RNA. Le sequenze blu che si vedono nella foto superiore, sono sempre presenti perchè sono alla base del riconoscimento del trasposone. Sono esattamente la stessa sequenze, e non sono palindromiche. Questo effetto è alla base del meccanismo di trasposizione, vediamo come taglia la trasposasi: in maniera sfalsata lasciando sequenze protrudenti in 5’. Avendo 3’ libero poi, vengono replicate dalla DNA polimerasi e la ligasi, in questo moo nel sito in cui sono sfalsate avremo 2 sequenze ripetute identiche che vanno nella stesa direzione. Usa come stampo il filmanti protrudente in 5’ TRASPOSONI A DNA Sono sequenze mobili tramite trasposizione conservativa, replicativa o non replicativa, che possono andarsi ad integrare in dei geni e possono portare a mutazioni. Sono stati i primi scoperti da Barbara McClitoock, che negli anni ‘40 notò che le pannocchie di mais avevano chicchi di colori diversi, quindi notò che nei geni della colorazione del mais si trovavano elementi identici, molto ripetuti, in giro per il genoma. Noi umani presentiamo sopratutto retrovirus, i trasposoni solo il 3% del genoma.  Si osservano i due siti duplicati del sito bersaglio. Si hanno due frecce verdi in direzione opposta che sono le sequenze terminali che vengono legate dalla trasposasi. La trasposasi può essere trascritta direttamente dal trasposone che così è indipendente, si produce da solo l’enzima per spostarsi. Esistono poi trasposoni non indipendenti che non la producono, hanno sequenze 3’ invertite per il riconoscimento della trasposasi ma non regioni per trascriverla. TRASPOSIZIONE NON REPLICATIVA Da un sito donatore viene tagliato via il DNA e viene inserito in un sito ricevente. Nel momento in cui viene tagliato via il DNA si genera un danno per taglio a doppio filamento che verrà ricucito, entrano in gioco i meccanismi di riparo al DNA per double strand break. 1. Il DNA con le ripetizioni invertite viene scisso 2. Si genera il complesso del trasposoma che porta al taglio di entrambi i filamenti, che possono andare ad integrarsi nel sito bersaglio con il filamento sfalsato, ho due 3’ liberi. 3. Porta alla molecola intermedia in cui viene lasciato aperto il sito in 3’ per l’aggancio della DNA pol per il riparo al DNA per andare a riempire la regione mancante. 4. La ligasi chiude il tutto. Come taglia la trasposasi? Non utilizza come le integrasi che erano serina o tirosina ricombinasi che formavano un intermedio tra proteina e DNA. La trasposasi attua un vero e proprio taglio, con attività esonucleasica senza intermedio. Per quanto riguarda il taglio il 3’ del filamento superiore va a rompere il legame fosfodiesterico del filamento per una reazione detta di transesterificazione. Con verde è indicato il trasposone in blu invece il DNA. Il verde ha l’OH in 3’ libero e utilizzando questo va ad attaccare il fosfato in 5’, tagliando e lasciando un ossidrile libero sul DNA bersaglio, fa così da aggancio alla polimerasi che andrà a riempire il GAP. Diversi trasposoni utilizzano diverse trasposasi e hanno tipologie diverse di taglio. 1. TRASPOSONE 7 = taglia come visto in precedenza, la trasposasi taglia il doppio filamento e i va ad inserire. In grigio rima il DNA non trasferito con taglio a doppio filamento che va riparato con sistemi di riparazione del DNA. 2. TRASPOSONE 5-10 (intermedio a forcina) = la trasposasi qui non è in grado di tagliare entrambi i filamenti, lo fa solo lasciando OH 3’ del trasposone libero, questo va a legare il filamento opposto per transesterificazione con quello superiore generando una forcina. Il DNA non trasposto è esattamente come questo, verrà riparato con i sistemi di riparo. La trasposasi ha la capacità, quando raggiunge il filamento di DNA in cui va a trasferirsi, di aprire la forcina dove andrà ad attaccarsi. 3. TRASPOSASI HERMES = la trasposasi non è in grado di tagliare entrambi i filamenti, quindi taglia l’inizio del filamento superiore e la fine del filamento inferiore, quindi l’OH rimane nel DNA non trasposto, sarà questo OH che va ad attaccare il filamento inferiore per transesterificazione formando le forcine nel DNA non trasposto. Quindi andrà a trasporsi nel filamento bersaglio. Questo meccanismo è alla base delle immunoglobuline delle cellule nel nostro sangue. Struttura del trasposone Le due regioni vengono dette IR ovvero Inverted Region. Sono due regioni legate alla trasposasi, sono i direzione opposta, quando arriva la trasposasi si metteranno parallele in modo tale da excidere 20bp. IS = Insertion Region, è l’intero elemento. Sono i più semplici elementi trasponibili comprensivi di IR, la lunghezza media è di 1000-1500 BPG. La trasposasi può essere espressa e possiamo avere la produzione della proteina trasposasi perchè in questa regione c’è anche l’attività del promotore per la trascrizione dei geni nei procarioti. I TRASPOSONI COMPOSTI sono più semplici. Hanno 2 IS e in mezzo dei geni, vanno dalle 2000 alle 16000bp, abbiamo visto tn5 e tn10 che hanno forcine nel trasposone, portano il gene di resistenza alla tetraciclina ed. Il più comune trasposone negli eucarioti è la famiglia dei Tc1 o mariner che si trovano nei C. Elegans e Drosophila.  TRASPOSIZIONE REPLICATIVA Il sito donatore non perde la sequenza di DNA ma la conserva e avremo quella copia anche nel DNA ricevente. Sono poco comuni negli eucarioti, gli organismi in cui è più comune il suo utilizzo sono i procarioti attivati da fagi. In questo meccanismo non è sufficiente la trasposasi ma serve anche una resolvasi. La trasposasi taglia solo alla fine del trasposone del filamento superiore e all’inizio del trasposone del filamento inferiore. Quindi si generano degli ossidrili che possono andare ad attaccare per transesterificazione il DNA bersaglio, dunque non abbiamo mai il distacco del trasposone dal DNa donatore, avviene prima. Avviene la trasposizione prima del distacco, otteniamo un intermedio in cui abbiamo legato con un unico filamento i due DNA: donatore e bersaglio. A questo punto c’è una DNApol che per andare a riparare il DNA andrà a copiare, utilizzare o il filamento superiore o quello inferiore come stampo. In rosso è DNA di nuova sintesi in cui viene copiato il trasposone. Poi la resolvasi apre il DNA e avremo quindi nel cromosoma batterico due copie del trasposone. Trasposone/complesso synaptico: taglio (nick) DNA ospite 3’OH attacco al sito bersaglio Dopo il trasferimento del filamento Formazione di una struttura con due ramificazione che può fungere da forca replicativa (direzione de-novo sintesi 5’-3’ = extensions of 3’ends) La replicazione termina sulla seconda forca e produce due copie del trasposone trasposizione + duplicazione del trasposone. RETROTRASPOSONI LTR (Long Terminal Repeats) Sono quelli che si incontrano quando si parla di retrovirus. Sono caratterizzati da due ripetizioni terminali invertite alle due estremità, sono sequenze di DNA identiche ripetute. Hanno poi il sito di integrazione ripetuto in blu, come prima, che si genera nel momento in cui il trasposone entra nel sito bersaglio per taglio asimmetrico. Dal punto di vista di struttura assomigliano a quello dei trasposoni a DNA, ma non c’è all’interno trasposasi ma c’è enzima integrasi e enzima RT ossia RetroTrascrittasi. Cos’è la retrotranscittasi? Abbiamo incontrato un enzima con attività retrotrascrittasica, ovvero la telomerasi terC, che usava una subunità tre come stampo. La retrotrascrittasi è dunque una DNA polimerasi che utilizza come stampo l’RNA, ma è a tutti gli effetti una DNA polimerasi. Se si ha un RNA messaggero e si ha bisogno di utilizzarlo come stampo, molto spesso da esso può essere generato un DNA copia che viene detto cDNA. Si può usare un primer sintetico perchè essendo una DNApol ha bisogno di un innesco. In laboratorio dunque si va ad eliminare l’RNA con RNAasi H, in grado di degradare un RNA solo se appaiato ad un DNA (ricordatelo per l’esame). Con queste scoperte di base si può eliminare l’RNA, la retrotrascrittasi trascrive ancora un po’ formando una forcina e offrendo un primer a cui si appaia la DNApol, e quindi forma uno stampo a DNA. I trasposoni si basano sul fatto che c’è un promotore che permette alla cellula di trascrivere un RNA dal trasposone che potrà essere utilizzato per poi essere trasportato mediante retrotrascrittasi, espressa direttamente dal Retrotrasposone, che viene trascritto direttamente dal cDNA. Abbiamo cDNA, ossidrili liberi, che attacca il DNA bersaglio, si integra e avendo un elemento di DNA verd con OH libero si può integrare. Si ha bisogno dunque della retrotrascrittasi per ottenere cDNA e per integrarlo nel sito bersaglio tramite un’integrasi. Come funziona per il primer? Ha sequenze ripetute invertite ai due lati, identiche, chiamate U3 R U5. Una di queste sequenze si appaia perfettamente alla sequenza di un RNAt: in particolare quest'ultimo si appaia alle regioni ripetute e fa da primer, la retrotrscittasi inizia a copiare. Si forma quindi una molecola che ha una parte di DNA e il resto RNA. La parte al DNA è identico all'altra regione e comincia a agire in quella direzione generando una molecola di DNA, il RNA verrà degradato e potrà essere generata una molecola a doppio filamento. A questo punto abbiamo il DNA che può andare a integrarsi. I domini catalitici delle integrasi retrovirali e la trasposasi sono molto simili, hanno foglietti beta al centro e alpha eliche attorno, dunque il meccanismo d’azione sarà simile. RETROTRASPOSONI POLI-A Hanno ai due lati le due sequenze ripetute e all’interno le sequenze orf1 e orf2, queste sono dei geni che producono proteine. ORF1 produce RNA binding protein che lega RNA ORF2 ha attivitò di trascrittasi inversa ed endonucleasi, produce retrotrascittasi e endonucleasi. La parte terminale del trasposone ha una sequenza ricca in A nel filamento superiore, per questo sono dette poli-A. Usano un meccanismo detto TRASCRIZIONE INVERSA, innescata dal sito bersaglio. L’RNA codifica per due proteine che portano l’RNA sul bersaglio. Dopo il taglio il 3’OH del DNA fa da primer e RNA da template. I siti ricci di T sono preferenziale perchè così la coda di poli-A si può appaiare. La parte terminale del trapsosone ha una sequenza in AAA nel filamento superiore e TTT nel filamento inferiore. L’inizio della trasposizione è simile ai trasposoni retrovirus L’RNA ha sequenze all’interno che permette di agganciare delle proteine che lui stesso fa tradurre. Per retrotrascrivere abbiamo detto che ORF2 ha bisogno di un primer: allora prima il trasposone va al sito bersaglio e poi va a trascrivere. Il sito bersaglio che ricerca il trasposone sono sequenze che hanno anche qui sequenze AAA sopra e TTT nel filamento inferiore. Quando questo complesso RNA ORF1 ORF2 raggiugne il sito di trascrizione, ORF con attività esonucleasica taglia e si genera un 3’ libero dopo le T che fa da innesco per la retrotrascrittasi. C’è l’unità retrotrascrittasica, si genera cDNA che verrà poi integrato. Rimane sempre sequenza con tante A che deriva dal trasposone, e le T provenienti dal sito bersaglio. SEQUENZE LINE E SINE Gli elementi LINE (long interspersed...) sono il 20% del nostro genoma umano. Sono chiamati anche retrotrasposoni non virali. Formano due classi: LINE (long interspersed nuclear elements) = circa 6kb, sono autonomi e producono le proteine per la trasposizione di retrotrasposoni non autonomi SINE (short interspersed nuclear elements). SINE sono più corti, 100-400bp, e privi di ORF, un esempio è la sequenza Alu. Hanno struttura simile ai geni: un promotore e poliA. Nel genoma esistono retropseudogeni (geni processati) che derivano da mRNA e vengono trasposti grazie a proteine codificate da LINE (poco efficiente perchè si legano ad alta affinità a RNA LINE) Prima del sequenziamento del genoma umano (avvenuto nel 2001), i genetisti caratterizzavano le diverse regioni del genoma ricercando regioni in cui c’erano questi elementi ripetuti perchè permettevano di mappare le regioni. In particolar modo c’è un elemento SINE che è circa il 10% e sono queste sequenze Alu e sono più di 1 milione nel genoma. È caratterizzata dal sito di restrizione Alu che taglia in AGCT. Questo elemento viene trascritto con le tante A alla fine, va alla ricerca di un sito con tante T, utilizza l’integrasi di un LINE per tagliare, le T offrono 3’ OH come innesco per la retrotrascrizione e l’inserimento di questo elemento nel genoma. I trasposoni non sono molto precisi ma sono frequenze abbastanza frequenti, quindi non hanno la capacità di integrarsi in un sito specifico, ma hanno permesso a molti ricercatori di andare ad utilizzarli per fare inserire in modo casuale nel genoma delle sequenze per attivare dei geni. SLEEPING BEAUTY Il sistema meglio utilizzato nei trasposoni è detto Sleeping Beauty, rimane nascosto fino alla sua attivazione, fino a quando non fa esprimere la trasposasi. Il trasposone si inserisce causalmente all’interno di un gene per inattivarlo con l’inserimento di un trasposone. Utilizzato anche per studiare linee di animali con l’inserimento di questo trasposone. Attualmente il sistema Sleeping Beauty è abbastanza utilizzato e controllato. Funziona come il gene per la resistenza alla neomicina. Si va a spaccare l’esone generando un knock out dell’espressione di un gene. VARIABILITÀ DELLE IMMUNOGLOBULINE Gli anticorpi nelle nostre cellule vengono generati mediante RICOMBINAZIONE SOMATICA. Non sono cellule germinali, ma del tessuto sanguigno, fanno una ricombinazione non omologa, senza crossing over. Si basa su meccanismi dei trasposoni. Ogni individuo può produrre milioni di anticorpi diversi. Ma il numero di loci per le immuno globuline è molto limitato. Ma ci sono anticorpi diversi. Ci sono due geni diversi per ogni anticorpo: catena leggera e catena pesante. Ci sono delle regioni variabili in questi loci che possono portare un certo grado di variabilità negli anticorpi. Un anticorpo viene rappresentato a forma di Y con distinto in catena pesante e catena leggera, legati con ponti disolfuro. Ora ci concentriamo nella parte tra la pesante e la leggera dove c’è il riconoscimento da parte dell’anticorpo con l’antigene, questa può dare variabilità.  Si ha quindi una grande variabilità di anticorpi da soli due geni, e ciò è legato dalla zona che va a riconoscere la cellula bersaglio. Il locus k (regione genomica dove c’è il gene per la produzione delle catene leggere degli anticorpi) è caratterizzato da una ventina di regioni con sequenza leggermente diversa che si chiamano regioni V e 4 regioni J e una regione C sempre costante (quest’ultima che non fa parte della riconoscimento del bersaglio). Ci può essere la combinazione di: una regione V con una regione J e con la C, portando ad esempio ad un mRNA processato V3J3C4. Comunque sia combinando le varie regioni non si possono comunque avere milioni di anticorpi diversi come li si hanno. Se guardiamo il locus della catena pesante abbiamo 20 catene V 12 regioni D 4 regioni J + C. Anche in questo caso si hanno solo 4800 diverse sequenze proteiche, non abbiamo sempre i milioni che effettivamente si hanno. Cosa accade allora? Nel momento in cui una regione V si unisce ad una D ed ad una J ed alla C, per poterle unire ci deve essere una ricombinazione che è mediata da delle ricombinasi RAG1 e RAG2 (ricombination activating gene) queste riconoscono sequenze segnale organizzate come ripetizioni inveriate adiacenti a segmenti genici che devono essere uniti. Tra regione V e regione J ci sono delle sequenze con frecce, sequenze che vengono legate dalle proteine RAG che possono permettere la ricombinazione perchè abbiamo sequenze identiche. Queste porzioni possono essere legate da ricombinasi. Perchè si genera questa variabilità? Le RAG agiscono non tagliando i due filamenti in contemporanea ma (COME HERMES) si taglia il filamento superiore all’inizio della regione da eliminare e il filamento inferiore alla fine della regione che deve essere eliminata.L’OH libero attacca il filamento opposto generando le forcine, la parte in mezzo è la regione che verrà eliminata. Si ha poi apertura della forcina, unione dei segmenti codificanti e la regione centrale viene eliminata. Si devono quindi risaldare le due estremità: intervengono quindi i sistemi di riparo al DNA e in particolare modo da Artemide (attivata dalla fosforilazione della pk,) ha attività nucleasica quindi riesce a tagliare la forcina fino a trovare regione di omologia. Si vanno a reclutare ligasi e pol per attivare il riapro. Poiché c’è riparo con non homologous end joining si hanno delle DIFFERENZE NEL RIPARO, DA QUI I MILIONI DI IMMONUGLOBULINE DIVERSE. Le immonuglobuline e la loro variabilità derivano dalla ricombinazione di parti diverse già presenti nel genoma ma soprattutto dal riparo e dalle differenze provocate da questo con il non homologous end joining. Quindi in sintesi: 1. La regione genomica del locus delle immunoglobuline della catena leggera 2. La RAG va a tagliare un solo filamento e l'OH in 3'chiude a forcina 3. La porzione gialla (D) e la porzione rosa che è J 4 Il DNA viene eliminato 5. Devono risaldarsi le estremità, essendo a forcina devono intervenire i sistemi di riparo del DNA in particolare ARTEMIDE 6. Ku70 e ku80 riconosce le regioni, la chinasi TK fosforila Artemide che avrà attività nucleasi a che ritaglia la forcina 7. Riconosce una regione di omologia vengono reclutate le DNA pol e DNA ligasi che danno il riparo 8. Ad ogni evento di ricombinazione da parte della RAG con la NHEJ porta a milioni di immunoglobuline diverse con un'enorme variabilità