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# Proteinabbau - Negative Regulation (Abschalten biologischer Vorgänge) - Positive Regulation (Aktivierung von Proteinen) - Quantitative Regulation (Neusynthese- und Abbaurate bestimmen das Fließgleichgewicht) Da Proteasen eine potentielle Gefahr für ihre Umgebung darstellen, ist ihre Aktivität st...

# Proteinabbau - Negative Regulation (Abschalten biologischer Vorgänge) - Positive Regulation (Aktivierung von Proteinen) - Quantitative Regulation (Neusynthese- und Abbaurate bestimmen das Fließgleichgewicht) Da Proteasen eine potentielle Gefahr für ihre Umgebung darstellen, ist ihre Aktivität streng kontrolliert. (regulierte Aktivierung, spezifische Proteasen-Inhibitoren, extra- und intrazelluläre Kompartimentierung) ## Extrazellulär - GI-Trakt (Verdauungsenzyme) - Plasmamembran und Matrix (Sekretasen und Kollagenasen) - Blutgefäße (Blutgerinnung und Fibrinolyse) ## Intrazellulär - Lysosome (Verdauungsenzyme) - Nicht-lysosomale Kompartimente (Signalpeptidasen) - Proteasom im Cytosol, Kern (Qualitätskontrolle, Signaltransduktion) -> Hydrolyse ist zwar thermodynamisch begünstigt, Peptidbindung ist kinetisch jedoch relativ stabil. = mesomeriestabilisiert Mesomerie erschwert nucleophilen Angriff ## Vorgehensweise der Proteasen um diese Stabilisierung zu umgehen: -> Aus der Peptidbindung wird erst eine Esterbindung, die sich dann hydrolytisch spalten lässt. ## A) Serin Proteasen z.B. Chymotrypsin; im katalytischem Zentrum sitzt Serin - Serin bindet mit seiner -OH Gruppe an das -C=O und bildet eine kovalenten Ester. - Hydrolyse des ES-Intermediats - Die Spaltprodukte entstehen Wieso ist die OH-Gruppe der Serin-Seitenkette so reaktiv? Benachbarte AS bilden mit Serin eine katalytische Triade. > Katalytische Triade im aktivem Zentrum: Asp (-) - His (+) - Ser (-) Histidin nimmt als Base Proton von Serin auf -> Serin wird reaktiver + Aspartat verstärkt Effekt z.B: - Trypsin, Chymotrypsin, Elastase (Pankreas) - Gerinnungsfaktoren und Fibrinolysefaktoren (Plasma) - Proteasom (Cytosol) ## B) Cystein-Proteasen Aus der Peptidbidnung wird durch -SH zunächst eine Thioesterbindung. - Hydrolyse des ES-Intermediats - Spaltprodukte z.B - Kathepsine (Lysosome) - Caspasen (Apoptose) -> C-asp-ase (C für Cystein-Protease, asp für Spaltung hinter Aspartat) für Apoptose programmierter Zelltod einzelner funktionsfähiger Zellen aufgrund von äußeren und inneren Signalen ## Apoptose: a) Extrinsischer Weg (durch Todesrezeptor an der Zelloberfläche) b) Intrinsischer Weg (Cytochrom C; Freisetzung aus den Mitochondrien) > Initiator-Caspasen werden durch beide Wege aktiviert > Effektor-Caspasen > Abbau von Proteinen der Kernmembran, Zytoskelett > Aktivierung von Nukleasen ## C) Aspartat-Proteasen Wasser wird durch Aspartat polarisiert — spaltet direkt. —> kein Zwischenprodukt z.B: - Pepsin (Magen) - BACE = beta-Sekretase (Zusammenhang mit Alzheimer) - Presenilin = gamma-Sekretase Beta- und gamma-Sekretasen sind Asp-Proteasen, die APP (Amyloid Plaques Protein) in das A-beta Peptid spalten. APP-Bildung aus A-beta spielt eine entscheidende Rolle in der Alzheimer-Krankheit ## D) Zink-Proteasen Wasser wird als Ligand mit Zn2+ polarisiert - spaltet direkt -> kein Zwischenprodukt z.B - Carboxypeptidase A+B (Pankreas) - Matrix-Metalloproteasen (Extrazelluläre Matrix) 1. Peptid-Bindung ist mesomeriestabilisiert und hydrolisiert nicht spontan 2. Proteasen spalten die Peptid-Bindung mittels einer reaktiven Seitengruppe (-OH, -SH) oder eines stark polarisierten H2O-Moleküls 3. Nach dem Katalysemechanismus unterscheidet man Serin-, Cystein-, Aspartat-, und Zink- Proteasen. # Proteasen werden unterteilt nach: a) Katalysemechanismus b) Substratspezifität ## Man unterscheidet: >Exopeptidasen (spalten am N- oder C-Terminus des Proteins, also an einem Ende) - Aminopeptidase - spalten 1-2 AS vom N-Terminus ab - Carboxypeptidasen - spalten 1 AS vom C-Terminus ab Es besteht eine Substratpräferenz für bestimmte Seitenketten (Substrabindungstasche). Funktionelle Gruppen benachbart zu der Spaltstelle des Substrats treten über eine Substrat-Bindungstasche mit der Protease in Wechselwirkung. Funktionelle Gruppen in der Substrat-Bindetasche kontrollieren den Zugang und bestimmen die Substrat-Spezifität der Protease - Glycin - große, hyddrophobe (Phe, Trp, Tyr) - Chymotrypsin Aspartat — positiv geladene (Arg, Lys) — - Trypsins - Valin kleine, neutrale (Ala, Gly, Val) - Elastase > Endopeptidasen (spalten innerhalb des Proteins) ## 1. Vollständige vs. limitierte Proteolyse ### 1. Vollständige Proteolyse Durch Proteasen mit geringer Spezifität → Kann viele Substrate spalten z.B Verdauungsproteasen oder lysosomale Proteasen (Lysosom = Kathepsin, Proteasom) bzw. extrazellulär = Kollagenasen ### 2. Limitierte Proteolyse Limitierte Proteasen sind hochspezifisch für das Substrat und für die zu spaltende Peptidbindung. z.B. pankreatische Verdauungsproteasen, Blutgerinnungsfaktoren, Peptidhormone > Spaltung zwischen zwei basischen oder hinter einer basischen AS. > Aktivierung von Proenzymen: im Darm (Verdauungsenzyme) oder im Plasma (Gerinnung) - hohe Substratspezifität - hohe Spezifität für Spaltstelle - oft flankiert von basischen AS - Bedarfsabhängige Aktivierung: Aktivierung von Zymogenen und Hormonen (aus einer Hormonvorstufe), Aktivierung von Gerinnungsfaktoren, Fibrinolyse-Enzyme, Aktivierung von Verdauungsenzymen, Prozessierung von Sekretproteinen (ER) und Abspaltung von Signalpeptiden, Programmierter Zelltod. Zymogene sind Vorstufen, die durch Abspaltung gewisser Anteile aktiviert werden. Zymogene werden von Proteasen aktiviert (limitierte Spaltung) (vgl. auch Blutgerinnungsfaktoren) ## Proteasen des Verdauunggstraktes ### Magen: > Endopeptidase = Pepsin ### Pankreas: > Endopeptidase = Trypsin, Chymotrypsin, Elastase > Exopeptidase = Carboxypeptidasen A + B Synthese als inaktive Vorstufe = Zymogene Limitierte proteolytische Spaltung = Aktivierung Aktivierung erfolgt streng reguliert z.B: Magen Hier wird Pepsin automatisch aktiviert wegen des sauren Milieus! ## Magenmukosa pH = 7 ## Magen pH 1 Pepsinogen (42,6 kDa) = Inaktiv Pepsinogen Pepsin (34,5 kDa) autokatalytische Aktivierung Aktiv *Autoaktivierung von Pepsin wird durch Aufbrechen von Salzbrücken (mit Peptid = Pepsin- Inhibitor) im sauren Milieu des Magens ausgelöst zB. Pankreas → Peptidase Trypsin aktiviert die Pankreas Stoffe ERST im Duodenum! ### Pankreas Trypsinogen Chymotrypsinogen Proelastase Procarboxypeptidase A Procarboxypeptidase B = Inaktiv ### Duodenum (pH = 8) Trypsin Chymotrypsin Elastase Carboxypeptidase A Carboxypeptidase B = Aktiv ## Proteasen des Verdauungstrakts: Funktion: Pepsin und Pankreas-Proteasen spalten ihre Substrate nahezu unsepzifisch und komplett = vollständige Proteolyse Regulation: Ihre Aktivierung erfolgt aber durch limitierte Proteolyse durch Abspaltung von Peptiden aus inaktiven Vorstufen (=Zymogene) Aktivierung: autokatalytisch (Pepsin, Trypsin) oder durch **andere Proteasen** (z.B Endoepeptidasen) Also Merke: Die Aktivierung erfolgt spezifisch(reguliert) bei Bedarf am Ort des Geschehens (limitierte Proteolyse)! Was die aktivierten Formen spalten ist aber sehr vielfältig (vollständige Proteolyse der Nahrungsbestandteile) ## 2. Kontrolle durch Protease-Inhibitoren ### a) Pepsininhibitor Spaltprodukt von Pepsinogen (also ein Restanteil, der selber Pepsin inhibieren kann) bindet an Pepsin über Salzbrücken (bei neutralem pH) ### b) Pankreas-Trypsininhibitor Substrat-Analogon → Verdrängt eigentliches Substrat, das gespalten werden soll hohe Affinität für Trypsin ### c) alpha-1-Antitrypsin (Serpin = serin-Protease-Inhibitor) bindet an Trypsin, Elastase kovalente und irreversible Bindung starke Konformationsänderung → Funktionslos!!! **Proease-Inhibitoren ähneln Substrate und binden oft irreversibel an die Protease (Ausnahme: Pepsin-Inhibitor über Salzbrücken)** ## 3. Beispiel f. intrazelluläre, vollständige Proteolyse: Das Proteasom Das Proteasom: intrazelluläre Abbaumaschinerie Kompartiment-ähnlicher multimerer Komplex zylindrische Tonne (20S) regulierbarer Deckel (19S) Protein-Entfaltungsenzyme (ATPasen) > Zentraler Teil (20s, core) - 2 Ringe mit je 7 alpha-Untereinheiten, 2 Ringe mit je 7 beta-UE —> nur beta-Einheiten sind proteolytisch aktiv (drei verschiedene Wirkungen → Hohe Funktionalität!!!) - Chymotrypsin-ähnliche Aktivität - Trypsin-ähnliche Aktivität - PGPH (Peptidyl-glutamyl-Peptid-hydrolysier Aktivität > Deckel (19S, lid) - Erkennung von Substanzen, Protein-Entfaltungsenzyme (ATPasen) Die Substrate werden zunächst mit Ubiquitin markiert ## Ubiquitin - hochkonserviertes 76 AS Protein - in allen eukaryotischen Zellen (ubiquitär) - globuläre, stabile Proteinstruktur (ubiquitin-fold) - 3 AS-Unterschiede zwischen Mensch und Hefe - kovalente Verknüpfung über C-terminale Gly-Seitenkette an das Substrat **Ubiquitin wird über eine Enzym-Kaskade aktiviert: Es gibt 3 Enzymklassen** > Enzym 1: ATP-abhängige Aktivierung > Enzym 2: Übertragung (Konjugation) > Enzym 3: Substratbindung (Ligation) Ubiquitin wir über ATP-Verbrauch aktiviert -> energiereiche Thioesterbindung mit E1 (Aktivierungsenzym) -> Übertragung auf E2 (Konjugationsenzym) (Thioester geht verloren) -> Bindung durch E3 (Ubiquitin-Ligase), Übertragung durch E2 -> Kovalente Bindung an Lysin-Seitenkette (Substrat) -> Kettenverlängerung durch interne Lysin-Seitenketten (Ub) **Erkennung durch das Proteasom: nur poly-ubiquitierte Substrate werden erkannt. Bindung von Poly-Ub an Proteasom-UE, Abspaltung der Poly-Ub-Kette.** ## Funktionen des Ubiquitin-Proteasom-Systems - Abbau von - durch Hitze und Stress - geschädigten Proteinen - DNA-Schäden-Reparatur - regulierte Proteolyse —> Signaltransduktion - Proteinfaltung: Qualitätskontrolle -> Regulation von p53 = „Wächter des Genoms“ ## DDB1 p53 wirkt als Tumorsuppressor und Transkriptionsfaktor - Aktiviert durch DNA-Schäden - stoppt Zellzyklus > Zeit für Reparatur - induziert Apoptose > wenn Schaden Überhand nimmt In 50% aller menschlichen Krebs-Erkrankungen mutiert - konstitutiv ubiquityliert & abgebaut - keine Akkumulation in der Zelle - DNA-Schäden iniziieren Signalkaskade - Phosphorylierung von p53 - Es wird nicht mehr von E3 erkannt - akkumuliert in der Zelle und aktiviert Genexpression Assoziierte Krankheiten: - DNA damage-binding-protein > Hautkrebs - Parkin - Ubiquitylierung v. mitochondrialen Proteinen, vermittelt deren Abbau > Parkinson'sche Krankheit bei Defekt - CUL3-KBTBD8 Ubiqit. reguliert Translation, Differenzierung von Zellen während Gesichtsbildung. Mutationen > craniofasziale Dysmorphien: Treacher-Collins-Syndromel ## ZF: Proteasomaler Abbau Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist der **Hauptabbauweg für intrazelluläre Proteine** Substrate werden durch **Ubiquitin markiert** und damit einem Proteasekomplex (Proteasom) zugeführt Die **Ubiquitylierung erfolgt** über eine dreistufige enzymatische Kaskade (E1-E2-E3) Die Ubiquitin-Ligase (E3) ist maßgeblich für die Substratspezifität ## Gesamt-ZF: 1. Polypeptidbindungen werden häufig über ein kovalentes **Ester-Zwischenprodukt** gespalten. 2. Proteasen werden nach ihrem Katalyse-Mechanismus in Serin-, Cystein-, Aspartat- und Zink-Proteasen unterteilt. 3. Vollständige Proteinverdauung erfolgt durch unspezifische Proteasen mit **geringer AS-Präferenz**. 4. Llimitierte Proteolyse ist **hochspezifisch** für Substrat und Spaltstelle 5. Proteasen des Verdauungstraktes und des Gerinnnungssystems werden durch **limitierte Proteolyse aktiviert**. 6. Das UPS ist der Hauptabbauweg für intrazelluläre Proteine und am Abbau fehlgefalteter Proteine und Aktivierung von Signalketten beteiligt.