Análise de Alimentos - Processamento de Amostras e Análise de Dados PDF

Análise de alimentos  Análise de alimentos frescos  Análise de alimentos processados  Quantificação de indicadores  Deteção de microrganismos patogénicos Universidade de Aveiro Análise de alimentos processados  Alimento a analisar: pastel d...

Análise de alimentos  Análise de alimentos frescos  Análise de alimentos processados  Quantificação de indicadores  Deteção de microrganismos patogénicos Universidade de Aveiro Análise de alimentos processados  Alimento a analisar: pastel de nata  Microrganismos a pesquisar:  Microrganismos totais a 30 °C e.g. bola de berlin  Coliformes totais  Escherichia coli  Bolores e leveduras  Staphylococcus aureus Microrganismos  Salmonella patogénicos Análise de alimentos frescos  Alimento a analisar: alface lavada e não lavada  Microrganismos a pesquisar:  Microrganismos totais a 30 °C e.g. alface  Enterobacteriaceae  Escherichia coli Indicadores Diluições: 10-1 – 10-3, 2 réplicas  Microrganismos totais a 30 °C Meio PCA (30 °C/72 h) Sementeira por:  Enterobacteriaceae incorporação superfície Meio VRBD (37 °C/24 h) + meio de glucose (37 °C/24 h)  Coliformes totais Contar colónias Meio VRBL (37 °C/24 h)  Escherichia coli E. coli – azul turquesa Meio TBX (44 °C/24 h) Enterobacteriaceae – vermelhas com precipitado  Bolores e leveduras Restantes – contar todas Meio CRBA (25 °C/72 h) as colónias  Pesquisa de microrganismos patogénicos Microrganismos patogénicos  Segundo a legislação muitas vezes é necessário pesquisar os próprios microrganismos patogénicos  As técnicas de deteção são complexas e demoradas  Pré-enriquecimento (para alguns microrganismos) Seletivo ou não seletivo  Enriquecimento (para alguns microrganismos) Seletivo ou não seletivo  Isolamento (ou quantificação) Meios diferenciais e seletivos  Confirmação Testes bioquímicos ou serológicos  Pesquisa de microrganismos patogénicos Pesquisa de Staphylococcus aureus  Bactéria Gram positiva com baixo conteúdo em GC  É habitualmente transmitida pelos manipuladores de produtos alimentares que apresentam infeções nasais ou feridas cutâneas  Produz 1 exotoxina e 6 tipos de enterotoxinas responsáveis por muitas intoxicações alimentares  Há estirpes multiresistentes isoladas em alimentos  Pesquisa de microrganismos patogénicos Staphylococcus aureus Pesquisa de Amostra Staphylococcus  10-1 Semear 10010µL -1 10 -2 aureus (0,1 ml) (0,5 10 – 10 ml) -1 -3 (0,1 ml) (à sperfície)    2 réplicas em BPA (37°C, 48 h)   Pesquisa de microrganismos patogénicos Staphylococcus aureus Teste Meio Resultado Isolamento BPA (Baird Parker - Colónias pretas, brilhantes Agar) convexas - Diâmetro 1-5 mm com margem branca estreita rodeada por uma zona clara larga (2-5 mm) Confirmação BHI (Brain Heart - Turvação Infusion) - Formação de um coágulo no Ou Teste da coagulase fundo do tubo (facilmente observável a 90°C) Halo transparente à volta das colónias no BPA com “rabbit plasma fibrinogen” (RPF) Pesquisa de microrganismos patogénicos Objectivo: Usado para distinguir estirpes de Staphylococcus aureus de outras estirpes de patogénicas de Staphylococcus Procedimento: Adicionar a cultura a testar a um tubo de plasma e incubar a 37 °C durante 1 - 4 horas Interpretação: Formação de um coágulo no fundo do tubo (facilmente observado quando o tubo é aquecido a 90 °C) Considerar resultado negativo quando não se forma coágulo após 24 horas  Pesquisa de microrganismos patogénicos Pesquisa de Salmonella  Pertence à família das Enterobacteriaceae (de Gram negativo)  Apresenta infeciosidade variável de espécie para espécie  Os alimentos mais susceptíveis de serem contaminados são:  a água, alimentos crús (carne, ovos e marisco), alimentos insuficientemente tratados por calor e alimentos recontaminados  Pesquisa de microrganismos patogénicos Salmonella Amostra Pesquisa de (25 g)  Enriquecimento Salmonella BPW não seletivo (37 °C, 24 h)   Meio Selenito-cistina Meio Rappaport (37 °C, 24+24 h) (42 °C, 24+24 h)  Enriquecimento Isolamento XLD seletivo BGA (37 °C, 24 h)  TSI Ureia Api 20E (37 °C, 24 h) Confirmação  Pesquisa de microrganismos patogénicos Salmonella Teste Meio Resultado Pré- BPW (Buffered Turvação enriquecimento Peptoned Water) Enriquecimento Selenito Turvação Rappaport Turvação Isolamento XLD (Xilose Colónias com cor semelhante ao meio Lysine de cultura, translúcidas, por vezes Deoxycolate) com centro preto (=Shigella, Providencia e Pseudomonas) BGA (Bile Colónias vermelhas/rosadas rodeadas Green Agar) por uma zona vermelha brilhante ou colónias laranja opacas Confirmação TSI (Triple Alteração de cor , formação de Sugar Iron) bolhas ou buracos Ureia Alteração de cor Api 20E Alteração de cor Pesquisa de microrganismos patogénicos Meio TSI  Preparado em tubos inclinados  Contém glucose, lactose, sacarose, tiossulfato, ferro e vermelho de fenol como indicador (amarelo pH < 6.8 e vermelho pH >6.8) Diferencia bactérias de Gram – com base em:  Metabolização de glucose, lactose e/ou sacarose  Produção de ácido durante a fermentação  Produção de gás durante a fermentação  Redução de enxofre com produção de H2S  Pesquisa de microrganismos patogénicos Bactérias fermentativas: Meio TSI Fermentação da glucose - cor amarela só no fundo devido a produção de pouco ácido Fermentação da glucose e lactose - cor amarela no fundo e na parte inclinada devido a produção de muito ácido Produção de gás durante a fermentação – formação de bolhas ou buracos no fundo do tubo Bactérias não fermentativas: Fundo e parte inclinada com cor vermelha O meio contem sulfato de ferro Produção de H2S – o H2S reage com o ferro e forma sulfito ferroso que forma um precipitado preto no fundo do tubo  Pesquisa de microrganismos patogénicos SCORING THE SLANTS: Examine the slant and butt, and record data using the following criteria: SLANT Code Interpretation Example COLOR: letter: does not ferment either Example red RED R lactose or sucrose slant ferments lactose and/or Example yellow YELLOW Y sucrose slant  Pesquisa de microrganismos patogénicos SCORING THE BUTT COLOR AND CONDITION: BUTT COLOR/CONDI Code Interpretation Example TION no fermentation, the bacterium is an Example red RED R obligate aerobe butt some fermentation has occurred, Example YELLOW Y acid has been produced, it is a yellow butt facultative anaerobe. Seen as cracks in the agar, bubbles, or the entire slant may be pushed Example GAS FORMED YG out of the tube. (Caution: these yellow butt gassy fermenters may have bacteria with gas close to the opening.) Example black BLACK "+" H2S has been produced butt  Pesquisa de microrganismos patogénicos BACTERIA: BACTERIUM SLANT BUTT H2S COMMENTS Shigella dysenteriae R Y Causes food infection dysentery Salmonella R YG + Causes food poisoning Typhimurium Salmonella Typhi R Y + Causes typhoid fever Aerobacter Similar to Klebsiella, but Y YG aerogenes nonrespiratory Escherichia coli Y YG Most common of GI flora one of "paracolon" group Citrobacter freundii Y YG + (nonpathogenic) Causes GU infections, highly Proteus vulgaris Y YG + motile Klebsiella R or Pneumonia in debilitated patients Y pneumoniae YG (nosocomial) Pseudomonas GI inhabitant, causes wound, GU R R aeruginosa infections GI inhabitant, opportunistic Alcaligenes faecalis R R pathogen of GU  Pesquisa de microrganismos patogénicos Teste da urease Enzima urease: hidrolisa a ureia em amónia e dióxido de carbono. Positivo: alteração de cor (rosa/vermelho) devido à libertação de amónia com produção de carbonato de amónia (aumento do pH para 8,4) Negativo: não ocorre alteração de cor, pH 6,8. Klebsi ella 80 + – + – + – + – – + – + + + + + + + + + pneu API 20E 30 monia e Prote 80 us – – – – –++++– ++– – – – +– + – 68 vulgar is Salmo 8P – – + + – + – – – – – + + – + + – + – + nella 14 sp. API 20E  VRBD TBX 1º dia Escherichia coli A... Enterobacteriaceae A... 2x`s L Indicadores e S. aureus Ou Stomacher Preparação da solução mãe Salmonella  Pesar 25 g em assépcia e juntar 225 mL de água 25 g peptonada  Homogeneizar com varinha ou no stomacher  Incubar 24 h a 37 °C  Semear Após homogeneização:  L e VRBD TBX B L e VRBD TBX TBX TBX  Aspeto das colónias nos meios de cultura Microrganismos totais Coliformes Enterobactereaceae Escherichia coli Staphylococcus aureus Bolores e leveduras MA1 Pesquisa de microrganismos patogénicos Salmonella em Selenito Salmonella em Rappaport Salmonella em BGA Slide 29 MA1 Maria Almeida; 06/04/2020 Análise de dados Exemplo resultados de Escherichia coli  Contagem 54 e 56 (média 55) colónias nas placas de 10-1 (na solução mãe)  55 colónias contadas em 1 mL de amostra 10-1  Quantas colónias por grama de alimento?  1 mL ----- g ?  55 colónias ----- 0,1 g 10 g ----- 100 mL x ----- 1 g x ------- 1 mL x = 550 ufc g-1 x = 0,1 g  Se contagem fosse na diluição 10-2 x = 550 x 10 = 5500 ufc g-1 x = 5,5 x 103 ufc g-1 Valores Guia para avaliação da qualidade microbiológica de alimentos prontos a comer preparados em estabelecimentos de restauração Resultados análises ACRA Microrganismos Bolores Leveduras Coliformes S. aureus E. coli Amostra (nº) Alimento Totais (10^-2) (10^-1) (10^-1) (10^-1) (10^-1) (10^-1) 25 0 0 5 14 0 1 Rolo de carne 31 0 0 6 9 0 5 0 0 0 0 0 2 Perca assada 3 0 0 0 0 0 1472 0 2 0 0 0 3 Frango gratinado 1856 0 4 0 0 0 Bacalhau com 1984 0 0 0 0 0 4 legumes 2336 0 1 0 0 0 488 0 0 0 2 0 5 Lasanha 408 0 0 0 4 0 >10^6 1 30 9 164 10 6 Maionese de peixe >10^6 2 17 10 224 9 1840 2 896 0 0 2 7 Bacalhau de natas 2048 0 640 0 0 5 Picadinho de porco 816 0 0 0 1 0 8 com ameixa 656 0 0 0 1 0 Esparguete à 992 0 2 0 4 0 9 bolonhesa 1120 0 2 0 0 0 Pescada dourada 1008 0 0 1 0 0 10 c/ molho verde 896 0 0 17 0 0 Volume Semeado 1 mL 0.1 mL 0.1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 10^-2 Resultados Amostras ACRA 23-03-11 Tabela 1 - Teor de microrganismos obtidos nas amostras de 23 de Março de 2011 e respectiva classificação dos niveis de qualidade microbiológica. Microrg Levedur Colifor S. Amostra Classificaçã Bolores NQ E. coli Alimento Totais NQM NQM as NQM mes NQM aureus NQM (nº) o por grupo (UFC/g) M (UFC/g) (UFC/g) (UFC/g) (UFC/g) (UFC/g) Rolo de 1 Grupo 1 2800 Ac 0 Sat 0 Sat 55 Ac 0 Sat 1150 Sat carne 2 Perca assada Grupo 1 400 Ac 0 Sat 0 Sat 0 Sat 0 Sat 0 Sat Frango 3 Grupo 1 166400 NSat 0 Sat 300 Ac 0 Sat 0 Sat 0 Sat gratinado Bacalhau 4 Grupo 1 216000 NSat 0 Sat 50 Sat 0 Sat 0 Sat 0 Sat com legumes 5 Lasanha Grupo 1 44800 NSat 0 Sat 0 Sat 0 Sat 0 Sat 300 NSat Maionese de 6 Grupo 1 100000000 NSat 150 NSat 2350 Ac 95 Ac 95 NSat 194000 In peixe Bacalhau de 7 Grupo 1 194400 NSat 100 Ac 76800 NSat 0 Sat 35 NSat 0 Sat natas Picadinho de 8 porco com Grupo 1 73600 NSat 0 Sat 0 Sat 0 Sat 0 Sat 100 NSat ameixa Esparguete à 9 Grupo 1 105600 NSat 0 Sat 200 Ac 0 Sat 0 Sat 200 NSat bolonhesa Pescada 10 dourada c/ Grupo 1 95200 NSat 0 Sat 0 Sat 90 Ac 0 Sat 0 Sat molho verde