Identificazione carica batterica microbica PDF

Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Identificazione carica batterica microbica  Maria Luisa Savo Sardaro Preparazione del campione * I campioni alimentari liquidi possono es...

Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Identificazione carica batterica microbica  Maria Luisa Savo Sardaro Preparazione del campione * I campioni alimentari liquidi possono essere trasferiti in piastra tal quali oppure dopo diluizione. * Le cellule microbiche imbrigliate nelle matrici alimentari, per essere contate, devono essere trasferite nell’adatto substrato nutritivo. I campioni solidi, quindi, prima di essere analizzati, vanno omogeneizzati in un adatto diluente, al fine di disperdere i microrganismi nella fase liquida che può essere facilmente manipolata per l’analisi. E’ necessario pesare sterilmente una quantità sufficientemente rappresentativa del campione in esame (10-25 g) in un sacchetto sterile, aggiungere in ragione 1:10 diluente sterile, quindi omogeneizzare. L’omogeneizzazione viene effettuata con Stomacher, un apparecchio che grazie alla presenza di pedali che si muovono in senso rototraslatorio schiaccia il campione e ne determina lo sfibramento; la durata dell’omogeneizzazione sarà stabilita in base alla durezza e alla consistenza del campione. Identificazione carica batterica microbica 2 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Teoria delle diluizioni decimali: Cosa comporta Realizzando delle diluizioni decimali seriali del campione di latte (ad es. 1 ml di campione in 9 ml di diluente sterile), operiamo una diluizione del numero di microrganismi inizialmente presenti in esso, realizzando così una procedura che rende possibile contare le UFC che possono svilupparsi. SOLUZIONI DILUENTI Utilizzate per l’allestimento delle diluizioni decimali Soluzione fisiologica (NaCl, H2O) Sale peptone o triptone (peptone/triptone,NaCl,H2O) Soluzione di Ringer (NaCl, KCl, CaCl2, NaHCO3) Citrato di sodio Identificazione carica batterica microbica 3 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro DILUIZIONI SERIALI Sono necessarie in microbiologia quantitativa per conoscere la carica batterica del campione in esame (alimento, suolo, fluidi corporei, etc…) CARICABATTERICA : il numero di Unità Formanti Colonie (UFC) per ml o g in un determinato campione PROCEDIMENTO Immaginiamo di avere un campione liquido: 1. Prelevare 1ml di campione e diluirlo in 9 ml 2. Realizziamo una seconda diluizione 1:10, rispetto al campione iniziale: 1:10 x 10 =1:100 3. Si prosegue diluendo 1ml delladiluizione in 9 ml di eluente 4. Si piastrano le diluizioni su terrenonutritivo per spatolamento oinclusione Identificazione carica batterica microbica 4 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Analisi microbiologiche – campioni liquidi Materiale occorrente Pipette sterili da 1ml. Tubi contenenti 9 ml di diluente sterile. Operazioni 1.Prelevare, con una pipetta sterile, 1ml del campione liquido 2. Trasferirlo in 9 ml di diluente sterile. 3.In tal modo si realizza una diluizione 1/10 (10-1) del campione. 4.Omogeneizzare con cura mediante agitatore automatico. 5. Ripetere le operazioni per ottenere diluizioni decimali successive (10-2, 10-3 ecc.). NOTA: utilizzare sempre una nuova pipetta sterile per ogni diluizione da realizzare. Identificazione carica batterica microbica 5 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Analisi microbiologiche – campioni solidi Materiale occorrente Pipette sterili da 1ml, Tubi contenenti 9 ml di diluente sterile, sacchetti per stomacher sterili, Omogeneizzatore stomacher Operazioni 1. Pesare 10 g di prodotto,in sterilità. 2. Aggiungere 90 ml di diluente sterile. 3. In tal modo si realizza una diluizione 1/10(10-1) del campione. 4. Omogeneizzare con cura mediantestomacher 5.Prelevare 1ml di omogenato e trasferirlo in provetta con 9 ml di diluente sterile 6.Abbiamo ottenutola diluizione 10- 2 7.Ripetere le operazioni per ottenere diluizioni decimali successive (10-3, 10-4ecc.). NOTA: utilizzare sempre una nuova pipetta sterile per ogni diluizione da realizzare. Identificazione carica batterica microbica 6 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Una considerazione: DILUIZIONI SERIALI Vs. Il numero minimo di microrganismi Il numero minimo di microrganismi teoricamente rilevabili teoricamente rilevabile 10 UFC/g con la tecnica per inclusione; 1 UFC/ml con la tecnica dell’inclusione; 10 UFC/ml con la tecnica di spatolamento 100 UFC/g con la tecnica dispatolamento Identificazione carica batterica microbica 7 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Quante diluizioni realizzare? Al momento dell’analisi dobbiamo dunque decidere quante volte diluire il campione. Ø CONOSCENDO CON APPROSSIMAZIONE IL CARICO DEI MICRORGANISMI DA RICERCARE PRESENTE NEL CAMPIONE (DA ANALISI PRECEDENTI O DA RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI) VENGONO ALLESTITE LE DILUIZIONI E MESSE IN PIASTRA SOLO QUELLE IN CUI SI SUPPONE DI AVERE UN NUMERO DI COLONIE CONTABILI. (IN GENERE SI METTONO IN PIASTRA LE ULTIME TRE DILUIZIONI CONTABILI) Ø NEL CASO IN CUI NON SI ABBIA IDEA DEL CARICO TEORICO SUPPOSTO NEL CAMPIONE DA ANALIZZARE SI ALLESTISCE UN RANGE AMPIO DI DILUIZIONI E SI METTE OGLI DILUIZIONE IN PIASTRA. Identificazione carica batterica microbica 8 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Tecniche di semina in piastra 1. Tecnica per inclusione dell’inoculo in substrato solidificabile (“INGLOBAMENTO”): in una piastra petri sterile vuota si versa prima la sospensione del campione da analizzare (1 ml di inoculo), quindi si aggiunge il substrato agarizzato (12-15 ml) mantenuto in fusione a 45-46°C. Roteare delicatamente la piastra in modo da descrivere un 8 per 30 sec. al fine di miscelare l’inoculo (i microrganismi) con il substrato. Si lascia solidificare il substrato prima di incubare le piastre in termostato. 2. Tecnica per distribuzione superficiale dell’inoculo su substrato solido (“SPATOLAMENTO”): Preparare il terreno specifico e dopo sterilizzazione versarlo nelle piastre e lasciare solidificare. Seminare quindi 0.1 ml della diluizione del campione, precedente a quella prescelta, al centro di una piastra di Petri da 9 cm di diametro, contenente il terreno ben asciutto, preferibilmente preparato 24 ore prima. La sospensione microbica è quindi distribuita su tutta la superficie mediante l’aiuto di una spatola sterile a L, avendo cura di cambiare spatola per ogni diluizione oppure, iniziando a spatolare dalla diluizione più alta per evitare di trascinare microrganismi da una piastra all’altra. Identificazione carica batterica microbica 9 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Identificazione carica batterica microbica 10 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro INCUBAZIONE DELLE PIASTRE SCEGLIERE: Temperatura Tempo Condizioni di ana/aerobiosi OTTIMALI PER IL/I MICRORGANISMI RICERCATI Identificazione carica batterica microbica 11 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Unità Formanti Colonie (UFC) La miriade di cellule figlie che si originano e rimangono intrappolate tra le maglie dell’agar adese le une alle altre danno origine ad un ammasso che diventa generalmente visibile ad occhio nudo quando il numero delle cellule supera la decina di milioni. Questo ammasso, costituito da cellule tutte uguali tra loro ed uguali alla primitiva cellula presente nel campione e trasferita nel terreno di coltura, prende il nome di colonia. Identificazione carica batterica microbica 12 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro DILUIZIONI SERIALI Le piastre derivanti dalle diluizioni avranno un numero di colonie progressivamente inferiore, che diminuisce di un fattore10, ad es: 500.000 cellule/ml ( 5x105 cell/ml) Si considerano contabili le piastre Teoricamente, ogni contenenti un cellula, una volta numero non piastrata, darà vita superiore a 200 a una singola colonie colonia 50.000 5000 500 50 5 Non colonie colonie colonie colonie colonie contabili ü Contabili Identificazione carica batterica microbica 13 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro DILUIZIONI SERIALI Determinare la carica batterica iniziale, consideriamo le sole piastre contabili: 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 50.000 5000 500 50 5 colonie colonie colonie colonie colonie Non ü Contabil contabili i Identificazione carica batterica microbica 14 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro TECNICHE DI CONTA CONTA IN PIASTRA Sono considerate solamente le piastre che contengono un numero di colonie non superiore a 200 (numero convenzionale). Il numero dei unità formanti colonie (UFC) in 1 ml di prodotto, o in 1 g, nel caso dei prodotti solidi, è dato dalla formula: dove: ΣC: è la somma del numero di colonie contate n1 : rappresenta in numero di piastre utilizzate per la prima diluizione contabile n2 : rappresenta in numero di piastre utilizzate per la seconda diluizione contabile d: è il fattore di diluizione relativo alla prima diluizione contabile. Identificazione carica batterica microbica 15 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Ad esempio: Sono state seminate le piastre in doppio e dalla conta delle colonie si sono ottenuti i seguenti valori: nella prima diluizione (10-2): 83 e 97 colonie nella seconda (10-3): 13 e 10 colonie Il risultato sarà quindi 9.1 x 103 ufc/g o ufc/ml Identificazione carica batterica microbica 16 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Esempi Diluizioni Diluizioni 10-4 Inc. (>300) Inc. (>300) 10-5 Inc. (>300) Inc. (>300) 10-5 124 10-6 100 130 10-6 20 27 10-7 10 12 10-7 1 10-8 10-8 100+130+10+12 124+20+27+0+1 = 1,14*108 = 1.4*107 (1+2*0,1+2*0.01)*10-5 (2+2*0,1)*10-6 Identificazione carica batterica microbica 17 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Diluizioni 124+130 10-1 Inc. (>300) Inc. (>300) = 1,27*104 10-2 124 130 2*10-2 10-3 10-4 Ufc/ml o Ufc/ gr Identificazione carica batterica microbica 18 di 19  Maria Luisa Savo Sardaro Identificazione carica batterica microbica 19 di 19 Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Terreni di coltura e isolamento colture pure  Maria Luisa Savo Sardaro COLTURE MICROBICHE In campo microbiologico è di primaria importanza riuscire a coltivare e perpetuare i microrganismi in laboratorio e ciò è reso possibile solo dalla disponibilità di adeguati terreni di coltura. I terreni di coltura possono essere costruiti completamente impiegando componenti ben definiti chimicamente, si parla di TERRENI DEFINITI o SINTETICI oppure possono contenere costituenti come peptoni (derivati proteici), estratti di lievito o di carne di cui non si conosce l’esatta composizione si parla di TERRENI COMPLESSI. Terreni di coltura e isolamento colture pure 2 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro I vari terreni di coltura sono classificati in base alla funzione ed alla composizione come: qTERRENI PER USO GENERICO, tipo PCA (Plate count Agar) qTERRENI ARRICCHITI con particolari nutrienti per stimolare la crescita di un determinato microrganismo, (MRS, MSA, TSA etc) qTERRENI SELETTIVI contengono sali biliari o coloranti basici come il blu di metilene che inibiscono la crescita dei gram + favorendo lo sviluppo dei gram -, qTERRENI DIFFERENZIALI in grado di distinguere tra diversi gruppi di organismi. Il terreno di coltura può essere solidificato con l’aggiunta di AGAR, un polisaccaride complesso che deriva dalle alghe rosse. Terreni di coltura e isolamento colture pure 3 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro I primi terreni di coltura erano liquidi e di difficile gestione, solo nel 1881 Koch usò terreni solidi derivati da fette di patate bollite e poi sterilizzati. Nello stesso periodo un collaboratore di Koch, Loeffler sviluppò un terreno che contenesse come ingrediente base un peptone e riscosse un buon successo. Data la passione per la fotografia di Koch, fu il primo a fare microfotografie ai batteri, ed essendo capace di prepararsi le lastre fotografiche con Sali d’argento e gelatina, intuì che lo stesso metodo poteva essere usato per i terreni solidi, usò quindi il terreno con il peptone più la gelatina ma vi erano numerosissimi svantaggi, la gelatina non resisteva alle alte temperature ed alcuni batteri erano in grado di idrolizzarla. Terreni di coltura e isolamento colture pure 4 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Nel 1882 fu usato per la prima volta l’Agar già noto da molto tempo come agente solidificante nella preparazione della gelatina. Fu FANNIE HESSE la moglie di un collaboratore di Koch a suggerire l’uso dell’agar quando viene a conoscere le difficoltà incontrate con la gelatina. Fu un grande successo!!! Cinque anni più tardi nel 1877 JIULIUS RICHARD PETRI, un altro assistente di Koch inventò la piastra per coltura che porta il suo nome, da quel momento caddero in disuso le piastre di vetro ricoperte di agar. Queste innovazioni resero possibile l’isolamento di colture pure, che contenevano un solo tipo di batterio, dando un notevole impulso in tutti i campi della Batteriologia. Terreni di coltura e isolamento colture pure 5 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Terreni di coltura Terreni di coltura e isolamento colture pure 6 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Nutrizione Microbica Macronutrienti: Carbonio ( C) Ossigeno ( O) Carboidrati Calcio Attività Idrogeno ( H ) Lipidi Magnesio enzimi Proteine Azoto ( N) Ferro Cofattori Acidi Ecc. Zolfo( S) nucleici Fosforo ( P) Micronutrienti (sufficienti intracce) Manganes Attività enzimi e Cofattori Zinco Ecc. Cobalto UBIQUITARI Molibdeno Terreni di coltura e isolamento colture pure 7 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro FORMULAZIONE DEI TERRENI DI COLTURA I vari ingredienti, riportati nella composizione di ciascun terrenodi coltura, possono essere raggruppati a seconda delle loro funzioni Fonti di carbonio glucosio lattosio carboidrati saccarosio maltosio Fonti di azoto composti di ammonio (NH4)2SO4 - nitrati NH4NO3 NaNO3- peptoni e idrolizzati KNO3 Ottenuti tramite digestione enzimatica (peptoni) o tramite idrolisi acida (idrolizzati) peptidi e aminoacidi di matrici ricche di proteine animali (caseina, carne) o vegetali (soia) Terreni di coltura e isolamento colture pure 8 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Fattori di crescita estratto di lievito fonte ottimale di vit. gruppo B, azoto, carbonio, oligoelementi Sali NaCl sostanzetamponanti fosfati, acetati; è importante che il pH di un terreno colturale sia scelto intorno al valore ottimalenecessario per la crescita dei microrganismi desiderati. L’uso di questi tamponi è necessario quando si aggiungono carboidrati fermentabili come fonti di energia. Metalli e mineraliessenziali Ca, Mg, Fe, P Terreni di coltura e isolamento colture pure 9 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Agenti selettivi Agenti selettivi Azione Antibiotici Inibizione in funzione dello spettro d’azione dell’antibiotico utilizzato Cloruro di sodio Favorisce la crescita dei soli microrganismi alofili Sali biliari Inibizione dei batteri Gram+ Indicatori di variazioni di pH Indicatore Colore Colore Intervallo di forma acida forma basica viraggio Rossofenolo Giallo Rosso 6.4-8.0 Giallo di metile Rosso Giallo 2.9-4.0 Blu di bromotimolo Giallo Blu 6.0-7.6 S. aureus cresce su MSA Metilarancio Rosso Giallo 3.1-4.4 producendo composti acidi Terreni di coltura e isolamento colture pure 10 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Terreni liquidi e solidi Utilizzati quotidianamente neilaboratori Aspetto Categoria Necessità di O2 Specie (esempi) 1 Aerobi obbligati Necessario Micrococcus spp., Bacillus subtilis, Muffe 2 Anaerobi obbligati Tossico Clostridium botulinum 3 Anaerobi Richiesto, ma E.coli, Salmonella spp., facoltativi sopravvivono anche Listeria monocytogenes, in assenza S.cerevisiae… 4 Microaerofili Necessario, ma a Campylobacter spp., conc. inferiori Aerococcus spp. 5 Anaerobi Non richiesto, S.thermophilus, L. aerotolleranti ma plantarum, sopravvivono in Enterococcus spp. sua presenza Terreni di coltura e isolamento colture pure 11 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Sostanze gelificanti Agar polisaccaride usato come gelificante naturale ricavato da alghe rosse composto da 30% agaropectina e 70% agarosio solidifica sotto i 45°C e si liquefa sopra i 95°C Terreni di coltura e isolamento colture pure 12 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Preparazione Terreni Liquidi Pesare la quantità di polvere per il volume di terreno desiderato seguendo le proporzioni riportate in etichetta, e trasferire in flacone. Aggiungere l’adatta quantità di acqua deionizzata o distillata, mescolando per portare in sospensione omogenea la polvere. Agitare il brodo sopra agitatore magnetico mettendo nel flacone un’ancoretta. Attendere 10-15 minuti Sterilizzare in autoclave, a 121°C per 15 min. Dopo la sterilizzazione lasciare raffreddare a temperatura ambiente Aliquotare il brodo nelle provette con il dosatore posizionato in corrispondenza del volume desiderato (sotto cappa microbiologica o vicino al bunsen per mantenere la sterilità). Terreni di coltura e isolamento colture pure 13 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Preparazione Terreni Solidi Pesare la quantità di terreno, terreno agarizzato o separatamente di brodo ed agar (la concentrazione per agarizzare un terreno è di 15 g/l) e versare in una beuta Aggiungere la quantità di acqua secondo le proporzioni descritte in etichetta Aliquotare nei boccetti chiudendo con il tappo ma non completamente Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15 minuti (salvo diverse indicazioni del terreno) Terreni di coltura e isolamento colture pure 14 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Finito il processo di sterilizzazione terreni e brodi si lasciano raffreddare a temperatura ambiente e si conservano in frigo, ad eccezione del caso in cui occorrano per un’analisi immediata. In tal caso i brodi si lasciano raffreddare a temperatura ambiente mentre i terreni solidi si lasciano all’interno di un bagno termostatato a circa 46-48°C per impedire la solidificazione dell’agar prima del momento in cui vengono utilizzati. La permanenza del terreno solido in bagnetto non deve essere protratta a lungo poiché si alterano i complessi vitaminici che sono importanti coenzimi per le attività metaboliche dei batteri (di conseguenza una volta raffreddato il terreno solido deve essere utilizzato entro 2-3 ore) Ogni terreno solido dopo che è stato utilizzato si lascia raffreddare e quindi solidificare. Successivamente si conserva in frigo ed ogni volta che si utilizza si scioglie al microonde e si pone in bagnetto. Tale processo freddo/caldo è preferibile non farlo più di tre volte per possibili degradazioni che possono avvenire a carico dei costituenti del terreno. Terreni di coltura e isolamento colture pure 15 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro ISOLAMENTO COLTURE PURE Terreni di coltura e isolamento colture pure 16 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro COLTUREPURE DEF:Per coltura pura o axenica si intende una popolazione di organismi che derivano da un unico organismo viventeiniziale. 1) Strisciare un campione su piastra 2)Incubare 3) Isolare le singolecolonie Postulati di Henle – Koch (fine 1800) 1.il presunto agente responsabile della malattia deve essere presente in tutti i casi riscontrati di quella malattia 2.deve essere possibile isolare il microrganismo dall'ospite malato e farlo crescere in colturapura 3. ogni volta che una coltura pura del microrganismo viene inoculata in un ospite sano, si riproduce la malattia 4.il microrganismo deve poter essere isolato nuovamente dall'ospite infettato sperimentalmente Terreni di coltura e isolamento colture pure 17 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro TECNICHE DI ISOLAMENTO COLTURE 1.Isolamento per diffusione PURE 1) Depositare una gocciolina di campione 4) piastrare INCUBAZIONE 2) e 3) sterilizzare un‘ansa di vetro Terreni di coltura e isolamento colture pure 18 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro TECNICHE DI ISOLAMENTO COLTUREPURE 2. Isolamento per striscio Otterremo delle colonie singole, da cui poter ricavare colturepure 1) Prelevare una piccola 2) Strisciare l’ansa, diluendo quantità dicampione (B) il campione sulla sup. solida INCUBAZIONE Terreni di coltura e isolamento colture pure 19 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro 3. Isolamento per inclusione TECNICHE DI ISOLAMENTO Utile per campioni con basse concentrazioni microbiche COLTUREPURE Consente la crescita di batteri anaerobi INCUBAZIONE Terreni di coltura e isolamento colture pure 20 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro Terreni di coltura e isolamento colture pure 21 di 21 Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Il microscopio e la conta batterica diretta  Maria Luisa Savo Sardaro MICROSCOPIO OTTICO È uno strumento costituito da una serie di parti meccaniche, elettriche e ottiche che consente di superare i limiti di risoluzione dell’occhio umano e della lente di ingrandimento, grazie a un sistema di lenti opportunamente disposte che sfruttano una sorgente luminosa permette di visualizzare la struttura e la morfologia delle cellule. I microscopi possono essere suddivisi in due categorie in funzione dei principi su cui si basano: Microscopio ottico; Microscopio elettronico; Il microscopio e la conta batterica diretta 2 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro MICROSCOPIO OTTICO Parti meccaniche: a) Stativo: elemento centrale di sostegno e di assemblaggio di tutte le parti che costituiscono il microscopio. (3) b) Tavolino portaoggetti: piano mobile destinato a sorreggere il preparato da osservare. (5) c) Traslatore: permette di spostare il tavolino in direzione X, Y. d) Tubo: struttura cilindrica entro la quale si forma l’immagine intermedia. A una delle sue estremità è montato l’oculare di tipo monoculare oppure di tipo bioculare (2). E’ anche possibile l’acquisizione dell’immagine mediante telecamera inserita nell’ apposito tubo (1). Il microscopio e la conta batterica diretta 3 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro e) Revolver portaobiettivi: supporto girevole destinato a sorreggere più obiettivi a diverso ingrandimento. (4) f) Comandi di messa a fuoco: meccanismi di regolazione che consentono di focalizzare l’immagine del preparato. La vite macrometrica consente grandi spostamenti in verticale. La vite micrometrica consente una messa a fuoco più fine (7) g) Diaframma di apertura: Permette di variare la quantità di luce che viene fatta transitare attraverso l’obiettivo. (6) Parte elettriche: a) Trasformatore b) Regolatore della luminosità c) Lampada d’illuminazione (8) Il microscopio e la conta batterica diretta 4 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Componenti ottiche: Condensatore: Sistema di lenti interposto tra la sorgente luminosa e il tavolino portaoggetti. Ha il compito di far convergere (condensare) la luce sul piano del preparato da osservare. Obiettivi: Sistema di lenti che riproduce l’immagine ingrandita del preparato in esame. Sono montati sul revolver portaobiettivi. Ingrandimenti: 10x, 20x, 40x e 100x (in immersione) Oculari: Sistema di lenti che ingrandisce ulteriormente l’immagine prodotta dall’obiettivo, consentendone l’effettiva percezione visiva. È posto all’estremità superiore del tubo. Ingrandimento: 10x Il microscopio e la conta batterica diretta 5 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro 4°) INGRANDIMENTO: è pari al prodotto FUNZIONAMENTO dell’ingrandimento apportato dall’obiettivo 10x per l’ingrandimento e apportato dall’oculare. Es. Obiettivo 40x e oculare 10x, il potere d’ingrandimento totale sarà 40 X 10 = 400 volte. 3°) La lente dell’oculare produce una seconda rifrazione e un secondo 100x ingrandimento della immagine (10x). 2°) I raggi luminosi, passando attraverso il sistema di lenti dell’obiettivo, rifrattando la luce, producono un primo ingrandimento dell’oggetto in esame (es. 100x). 1°) Fascio di luce prodotta dalla sorgente luminosa viene inviato sul preparato tramite il condensatore. Il microscopio e la conta batterica diretta 6 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro POTERE DI INGRANDIMENTO: OBIETTIVO X OCULARE PROPRIETÀ DI UN MICROSCOPIO POTERE DI RISOLUZIONE (D): La distanza minima alla quale due punti possono ancora essere visualizzati come distinti e separati. Questo parametro limite rappresenta un dato fondamentale in quanto determina il massimo ingrandimento possibile di un oggetto all’ interno del preparato. Con un microscopio ottico si possono ottenere un ingrandimento massimo di 1500x e 0,2 µm di potere di risoluzione. Il limite di risoluzione D : 0.5 l l: lunghezza d’onda della luce utilizzata D: a: angolo di apertura del cono di luce che entra N sen a nell’obiettivo APERTURA NUMERICA (AN) , DESCRIVE N: indice di rifrazione del mezzo interposto tra LE PROPRIETA’ DELL’OBIETTIVO. Es 0,3 l’oggetto e la lente dell’obbiettivo Più il limite di risoluzione è basso, migliore è la definizione dell’immagine Si interpone tra oggetto e obiettivo un fluido (olio) di indice di rifrazione maggiore dell’unità (aria N= 1, olio N= 1,515) (obbiettivi a immersione). CONTRASTO: Può essere definito come la differenza di intensità di illuminazione fra l’immagine di un oggetto e quella dei suoi dintorni. Il microscopio e la conta batterica diretta 7 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro TIPI DI MICROSCOPIO MICROSCOPI IN CAMPO CHIARO: il preparato apparirà più scuro su uno sfondo chiaro e illuminato. I campioni analizzati vengono spesso colorati, poichè il basso contrasto rende il campione poco visibile. MICROSCOPI IN CAMPO OSCURO: solo la luce riflessa dalle cellule è in grado di raggiungere l’obiettivo. Il preparato appare chiaro su sfondo oscuro. MICROSCOPI A CONTRASTO DI FASE: incrementa il contrasto tra cellule e mezzo circostante, consente una migliore visualizzazione senza ricorrere all’uso di preparati colorati. Le cellule appaiono scure contro un sfondo più chiaro. MICROSCOPI A FLUORESCENZA Il microscopio e la conta batterica diretta 8 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro COLORAZIONI BATTERICHE: Per fornire informazioni specifiche sulla struttura interna o sulle proprietà chimiche delle cellule. ü Colorazioni semplici: Rendono le cellule meglio evidenziabili all'osservazione microscopica. Richiedono l'uso di un solo colorante (es. blu di metilene, cristal violetto, fucsina basica). ü Colorazioni differenziali: colorazione di Gram Richiedono l'uso di più coloranti. Mettono in evidenza non solo la morfologia, ma anche determinate caratteristiche di gruppi di microrganismi. Colorante primario (cristal violetto), mordente iodato, agente decolorante (etanolo) e un colorante di contrasto (safranina). Le differenti reazioni sono dovute alla composizione e allo spessore della parete cellulare. Gram positivi: blu-violetto, Gram negativi (parete cellulare più complessa): rosa. ü Colorazioni strutturali: colorazione endospora con il verde malachite Il microscopio e la conta batterica diretta 9 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Preparati a secco Preparati a fresco Sono vetrini con sospensioni cellulari Sono vetrini preparati con cellule trattati al calore. ed acqua. Poiché molte procedure di colorazione E’ il modo più semplice e migliore uccidono le cellule, quest’ultime per osservare microrganismi allo vengono fissate con trattamenti tesi a stato vivente (es: osservazione minimizzare i cambiamenti post- della mobilità dei microrganismi) mortem. Il fissatore più usato è il calore, nonostante spesso provochi cambiamenti nella forma e dimensione delle cellule. Il microscopio e la conta batterica diretta 10 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro METODI DI CONTA 1. Metodi di conta diretti: a) con l’ausilio di microscopi vengono visualizzate e contate direttamente le cellule usando camere di conta (Thoma, Burker, Neubauer), filtri o vetrini speciali; b) con coloranti fluorescenti è possibile contare separatamente cellule vive e cellule morte; c) con sonde oligonucleotidiche marcate con coloranti fluorescenti (FISH) è possibile contare gruppi diversi di microrganismi e quindi identificare le specie. 2. Metodi di conta indiretti: i microrganismi vitali vengono contati sulla base di una manifestazione visibile della crescita; a) su agar (formazione di colonie); b) in provetta (metodo Most Probable Number (MPN)): torbidità, viraggio indicatori. Il microscopio e la conta batterica diretta 11 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro 1a. Metodi di conta diretti: le Camere di Conta Vetrino reticolato di cui è nota l’area di ogni riquadro. Utilizzato per determinare il numero totale di cellule (vitali e non vitali) in un volume noto di campione. Presenta nella parte centrale due aree di conta caratterizzate da dimensioni note, ciascuna suddivisa in un reticolo di quadrati. Unità di conta per la camera di Thoma: Area: 0.05 x 0.05 = 0.0025 mm2 Volume: 0.0025 mm2 x 0.1 mm = 0.00025 mm3 = 0.00025 µl (1/ 4.000.000 ml) Il microscopio e la conta batterica diretta 12 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro 1a. Metodi di conta diretti: le camere di conta 1° QUADRANTE PREPARAZIONE: 1°) Pulire con alcol e carta morbida il vetrino ed il coprivetrino e NON PASSARE SU FIAMMA! 2° QUADRANTE 2°) Diluire il campione 10n 3°) Posizionare il coprivetrino e posizionare 10 µl di campione sul reticolo 4°) CONTA E CALCOLO DEI MICRORGANISMI 3°QUADRANTE PRESENTI 4° QUADRANTE Il microscopio e la conta batterica diretta 13 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro ESEMPIO DI CALCOLO: OSSERVAZIONE DILUIZIONE 10–n DI UN CAMPIONE 1° QUADRANTE Esempio di conta: 1° QUADRANTE 34 Diluizione 10-2 (1/100) 2° QUADRANTE 32 TOTALE: 139 2° QUADRANTE 3° QUADRANTE 38 4° QUADRANTE 35 3° QUADRANTE CALCOLO: 4° N° cellule/ml = ∑ quadranti x 4.106 x 10n QUADRANTE 16 COSTANTE n: diluizione N° cellule/ml = 139 x 4.106 x 102 16 N° cellule/ml = 3,47. 109 Il microscopio e la conta batterica diretta 14 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Vantaggi e svantaggi delle camere di conta Vantaggi: E’ un metodo rapido e poco costoso Svantaggi: Il limite di rivelazione è di circa 106 cellule/ml. Con 1x106 cellule/ml solo poche cellule sono visibili in ogni campo; Non è possibile distinguere cellule vive da cellule morte; Difficoltà di conta di cellule mobili o molto piccole; L’affaticamento degli operatori può causare errori. Il microscopio e la conta batterica diretta 15 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Morfologia di cellule (preparato microscopico a fresco) Materiale: Anse sterili Coltura liquida o in piastra. Pipette Vetrini porta e copri-oggetti Acqua Microscopio ottico Alcol Procedura: Da coltura liquida (a): 1-Omogeneizzare Da colonia (b): 2-Prelevare con pipetta una goccia e depositare sul 1-Depositare una goccia di acqua sterile sul vetrino. vetrino 2- Prelevare con un’ansa sterile parte di una colonia ben isolata 3- Stemperare il materiale microbico nell'acqua. (a) (b) 4- Coprire con il vetrino copri-oggetto, evitare la formazione di bolle d’aria. 5- Osservare al microscopio. N.B. Per una buona osservazione le lenti devono essere pulite, il campo deve essere ben illuminato, non devono essere presenti bolle d’aria o quantità eccesiva di liquido sotto il vetrino. Il microscopio e la conta batterica diretta 16 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Possono presentare diverse forme: Morfologia delle cellule batteriche: A) cellule sferiche (cocchi): Ø diplococchi (in coppia); Ø streptococchi (in catene); Ø stafilococchi (grappolo); Ø Tètradi (4) e sarcine (8); B) cellule bastoncellare (bacilli): Ø In coppia (diplobacilli) o in catena (streptobacilli); C) cellule bastoncellare: a forma di bastoncino corto, rigonfio e con margini arrotondati: coccobacilli; D) cellule bastoncellare: a forma di bastoncino ricurvo (vibrioni); a spirale (spirilli, spirochete). Il microscopio e la conta batterica diretta 17 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Il microscopio e la conta batterica diretta 18 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Osservazione al microscopio a contrasto di fase, ingrandimento 1000X: Streptococchi Streptobacilli Il microscopio e la conta batterica diretta 19 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Diplobacilli Spirali, formata da più cellule Il microscopio e la conta batterica diretta 20 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Diplococchi bifido Il microscopio e la conta batterica diretta 21 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Micelio vegetativo Colorazione blue di metilene Il microscopio e la conta batterica diretta 22 di 23  Maria Luisa Savo Sardaro Buono studio Il microscopio e la conta batterica diretta 23 di 23