PRÁCTICA Nº 8. Determinación manipuladores, superficies, equipos y aire 2024 PDF

TABLA DE CONTENIDOS MEPR216_2024 PRÁCTICA 8. DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS EN SUPERFICIES, MANIPULADORES, EQUIPOS Y AIRE 1. Introducción....…………………………………………………………..…………………………………………2 2. Objetivos……………………………………………………………………………………..………………………2 3. Métodos utilizados…………………………………………………………………………….………...

TABLA DE CONTENIDOS MEPR216_2024 PRÁCTICA 8. DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS EN SUPERFICIES, MANIPULADORES, EQUIPOS Y AIRE 1. Introducción....…………………………………………………………..…………………………………………2 2. Objetivos……………………………………………………………………………………..………………………2 3. Métodos utilizados…………………………………………………………………………….………………….3 3.1. Métodos utilizados para el control de superficies, ambiente y manipuladores …………….4 3.1.1. Método de la tórula ……………………………………………………….………….………………..4 3.1.2. Método de las paletas con medio de cultivo…………………………………………….………7 3.1.3. Método de placas con medios de cultivo……………………………………………….………..9 3.1.4. Técnica para las muestras de ambiente ……………………………………………….…………9 3.1.5. Muestras de manos de manipuladores..………………………………………………….…….10 3.1.6. Método de la esponja..………………………………………………………………………….…….12 3.2. VERIFICACION MICROBIOLOGICA OFICIAL en establecimientos pecuarios de exportación……………………………………………………………………………………………..…………… 13 1  MEPR216 Control Sanitario e Inocuidad de alimentos_2024 PRÁCTICA Nº 8. DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS EN SUPERFICIES, MANIPULADORES, EQUIPOS Y AIRE 1. Introducción: Las prácticas del buen manejo en una industria de alimentos requieren de superficies de trabajo, manipuladores, equipos, agua y aire ambiental, libres de contaminación. Las causas de contaminación de estas superficies son diversas, dentro de las cuales podemos encontrar: ❑ Contaminación cruzada entre alimentos crudos y procesados. ❑ Malas prácticas de higiene de los manipuladores. ❑ Contaminación por roedores, insectos, etc. ❑ Corrientes de aire, entre otros. 2. Objetivos: El objetivo general es determinar la contaminación de superficies, equipos y utensilios, etc., que son utilizados en la elaboración de alimentos en la industria alimentaria, incluyendo a l@s manipuladores de alimentos y también el aire ambiental, con el fin constatar la eficiencia de los métodos de limpieza y desinfección utilizados. Objetivos Específicos: 1. Evaluar la eficiencia de los métodos de limpieza y desinfección: - Determinar si los procedimientos de limpieza y desinfección aplicados en las superficies y equipos de la industria alimentaria son efectivos para mantener niveles microbiológicos seguros. - Identificar posibles fallos o áreas donde los métodos actuales puedan requerir mejoras o ajustes. 2. Cuantificar la contaminación microbiológica: - Realizar un recuento preciso de las unidades formadoras de colonias (UFC) presentes en diferentes superficies, incluyendo equipos, utensilios, y manos de los manipuladores, para establecer el nivel de higiene alcanzado. 2  MEPR216 Control Sanitario e Inocuidad de alimentos_2024 - Evaluar el aire ambiental en las zonas de producción para detectar la presencia de microorganismos en suspensión que puedan comprometer la inocuidad de los alimentos. 3. Identificar potenciales fuentes de contaminación: - Detectar y analizar las posibles fuentes de contaminación cruzada, como el contacto entre alimentos crudos y procesados o la manipulación inadecuada de los trabajadores. - Examinar la influencia de factores externos, como la presencia de roedores, insectos o corrientes de aire, en la contaminación de las superficies y el ambiente. 4. Asegurar el cumplimiento de normativas y estándares: - Verificar que las superficies, el ambiente y los manipuladores cumplen con los límites de aceptación microbiológicos establecidos por normativas nacionales e internacionales para la industria alimentaria. - Documentar y reportar los resultados de manera sistemática para facilitar auditorías y garantizar la trazabilidad de las acciones correctivas. Estos objetivos proporcionan un marco claro y detallado para la práctica, asegurando que cada aspecto importante del control microbiológico se evalúe de manera exhaustiva y con un enfoque en la mejora continua de los procesos de higiene y seguridad. 3. Métodos utilizados El método que se utilizará para el muestreo de superficies dependerá de las características de ésta. Se deberá justificar la selección de un método específico con respecto a otro, basándose en las características de las superficies y la posible presencia de biopelículas. Existen diferentes métodos, por ejemplo, se utiliza el método de lavado con torula para las superficies rugosas, lisas o lugares con vértices, grietas, manos de manipuladores, etc. y, el método de impresión en agar para superficies planas y lisas. Por ejemplo, si existiera la posibilidad de biopelículas se utilizan la metodología del hisopado intenso, de forma que se utilizan hisopos estériles, aplicándolos con una presión adicional o 3  MEPR216 Control Sanitario e Inocuidad de alimentos_2024 haciendo movimientos repetitivos y vigorosos para romper la estructura de la biopelícula y recoger más material. Se puede combinar con solución tamponada enriquecida que ayude a desprender los microorganismos de la biopelícula. Y, su uso es adecuado para áreas donde el raspado no es posible, como esquinas estrechas o equipos delicados. Otra metodología en el caso de la posible existencia de biopelículas sería utilizar esponjas estériles (prehumedecidas con una solución de neutralización o tamponada) que se pasan sobre las superficies de manera vigorosa para recolectar tanto microorganismos como la matriz de biopelícula. Tienen la ventaja de una mayor superficie de contacto y capacidad para recoger más material en comparación con los hisopos. Se utilizan comúnmente en superficies grandes o en zonas de procesamiento de alimentos donde se sospecha que hay biopelículas. 3.1. Métodos utilizados para el control de superficies, ambiente y manipuladores 3.1.1. Método de la torula Materiales: - Tórulas estériles, de algodón alginato o rayón, de mango quebrable. - Plantilla estéril de área interna de 20 cm2 (o equivalente, para muestrear un área total de 100 cm2). - Tubo con 4 ml de solución tamponada (agua peptonada tamponada, buffer fosfato a pH 7,5 o solución de peptona a 1g/L). - Tubo con 1 ml de solución tamponada para humedecer la torula. - Agar Plate Count preparado y mantenido a 47 ± 1 ºC. - Placas Petri estériles. - Pipetas de 1 ml. Toma de muestra: - Lavar y desinfectar minuciosamente las manos, según el método de rutina. - Desinfectar la superficie a muestrear según el método de rutina (ejemplo: alcohol 70º). - Sacar la tórula del envase estéril teniendo cuidado de no contaminar la porción que luego será insertada en el tubo. 4  MEPR216 Control Sanitario e Inocuidad de alimentos_2024 - Humedecer la tórula en el tubo con 1 ml de diluyente y luego drenar el exceso de líquido en la pared del tubo con movimientos de rotación. - Frotar la superficie a muestrear (delimitada por la plantilla) con la tórula húmeda, en sentido vertical y horizontal, procurando que no queden espacios sin torulado. - Repetir el proceso en distintas partes de la superficie para tomar una muestra representativa, hasta completar 100 cm2. Enjuagar la tórula en el diluyente entre cada repetición y remover el exceso de líquido cada vez. - Finalizada la toma de muestra, colocar la tórula en el tubo con 4 ml de solución tamponada y quebrar o cortar asépticamente el palo de la tórula, dejando caer la porción con el algodón dentro del tubo. - Cerrar el tubo y almacenar en refrigeración hasta su análisis (1°C a 4 ºC/ ≤ 24 h). Siembra: - Agitar vigorosamente los tubos antes de la siembra - Sembrar en duplicado 1 ml (10º) del tubo que contiene la tórula mediante el método de siembra en profundidad. - Depositar el inóculo en una placa Petri estéril vacía y luego agregar aproximadamente 15 ml de Agar Plate Count, para el caso de RAM. - Incubar a 35°C ± 1 ºC/ 48 h Cálculo y expresión de resultados: Contar las colonias recuperadas. Calcular el número de UFC/ cm2 de superficie muestreada usando la siguiente fórmula: N = número de UFC en 1 ml de solución tamponada, correspondiente al promedio de las dos placas contadas F = cantidad en ml de solución tamponada D = recíproco de la dilución usada A = superficie muestreada (cm2) 5  MEPR216 Control Sanitario e Inocuidad de alimentos_2024 Laboratorios microbiológicos: Límite de aceptación ≤ 2 UFC/ cm2 (RAM) Superficies en general para el Programa de Reducción de Patógenos: Límite de aceptación 0 - 10 UFC/cm2 (RAM) Límite de aceptación 0 - 1 UFC/cm2 (Enterobacterias) RAM ENTEROBACTERALES 6  MEPR216 Control Sanitario e Inocuidad de alimentos_2024 3.1.2. Método de las paletas con medio de cultivo: Se pueden utilizar dispositivos adquiridos comercialmente, que contienen medios de cultivo sólidos para determinar un microorganismo específico o para recuento total de gérmenes. Procedimiento: - Inoculación por contacto (Figuras 1A y 1B): La paleta se saca de su contenedor y se ponen en contacto la superficie del agar con la superficie a muestrear. Se aplica una presión firme y uniforme, para luego colocar la paleta en el contenedor, cerrar e incubar a 30°C a 35ºC según corresponda, por 24 a 48 h. Figura 1A y 1B - Uso de tórula (Figura 2): Muestras líquidas o semisólidas se inoculan mejor utilizando una tórula de algodón estéril. Luego de humedecer la tórula en la muestra, se siembra cuidadosamente sobre ambas superficies de agar. Una tórula humedecida en un diluyente estéril puede utilizarse también para muestrear superficies secas. Figura 2 7  MEPR216 Control Sanitario e Inocuidad de alimentos_2024 - Paleta sumergida (Figura 3): Las muestras líquidas se Figura 3 muestrean mejor sumergiendo la paleta en el líquido por 3 a 4 segundos. Esto no afecta la calidad del alimento. - Incubación (Figura 4). Figura 4 - Lectura e interpretación de resultados (Figura 5). Figura 5 Evaluación: Existen varias formas de evaluar los resultados. a) Contar el número de colonias y expresarlo por la superficie total de la paleta o bien hacer el cálculo para expresarlo por unidad de superficie (cm2). b) Hacer un recuento estimado de bacterias, comparando la cantidad de colonias obtenidas con una escala adjunta proporcionada por el proveedor. 8  MEPR216 Control Sanitario e Inocuidad de alimentos_2024 3.1.3. Método de placas con medios de cultivo Este método puede ser utilizado para analizar muestras de dedos, paños, pelos, pequeños utensilios, aire, etc. Procedimiento: En una placa Petri se coloca medio de cultivo nutritivo o selectivo, según necesidades, sobre el cual se coloca o presiona suavemente el utensilio a analizar para después ser incubados por el tiempo y temperatura adecuados para el microorganismo a pesquisar. Evaluación: Se evalúa subjetivamente el resultado como muy contaminado/ poco contaminado. 3.1.4. Técnica para las muestras de ambiente Una técnica muy simple y bastante efectiva para determinar la carga microbiana del ambiente de trabajo, consiste en dejar abierta en el lugar de trabajo, por un tiempo determinado, una placa Petri con el medio seleccionado para el tipo de microorganismo que se desea contabilizar. Procedimiento: i) Recuento de mohos y levaduras: 1. Dejar abierta durante 15 minutos una placa de agar Papa Dextrosa. 2. Cerrar la placa e incubar a 22ºC por 4 a 5 días. ii) Recuento de bacterias: ✓ Dejar abierta durante 15 minutos una placa de agar Plate Count ✓ Cerrar la placa e incubar a 35ºC por 48 h. Expresión de resultados: Contar el número de colonias obtenidos y expresar el resultado como: número de bacterias/ tiempo de exposición. 9  MEPR216 Control Sanitario e Inocuidad de alimentos_2024 3.1.5. Muestras de manos de manipuladores La toma de muestra de las manos de manipuladores se realiza para detectar hábitos higiénicos, se detecta especialmente Staphylococcus aureus y coliformes fecales. 3.1.5.1. Agua de lavado Materiales: Bolsas estériles con diluyente, selladas. Procedimiento: Lavar la o las manos del manipulador (objeto o utensilio a examinar), con una cantidad conocida de solución estéril dispuesta en una bolsa plástica sellada herméticamente. Luego se procede a hacer el recuento de la manera habitual haciendo diluciones de la solución de lavado y utilizando la técnica de recuento en placa o la del NMP. Evaluación: determinar el número de bacterias/ml, multiplicarlo por el total de ml usados en el lavado, para obtener la cantidad de bacterias por mano(s)/objeto/utensilio lavado. 3.1.5.2. Tórula Materiales: Tubos de tapa rosca con 2 a 3 ml de diluyente estéril (buffer fosfato o solución de peptona al 0,1 % o solución Ringer), tórulas de algodón estériles en un tubo de ensayo o sobres de papel. Procedimiento: ✓ Sacar la tórula estéril de su envoltorio y humedecerla en el diluyente. ✓ Lavar la superficie de la mano haciendo rotar la tórula. ✓ Lavar la tórula en el diluyente y drenar el exceso de líquido en la pared del tubo. ✓ Lavar la zona entre los dedos, repetir la limpieza de la tórula y pasarla luego por debajo de las uñas. ✓ Finalizado el lavado quebrar el palo, dejando caer la porción con algodón dentro del tubo con diluyente. ✓ Repetir la misma operación para la otra mano. 10  MEPR216 Control Sanitario e Inocuidad de alimentos_2024 ✓ Ambas tórulas se colocan en el mismo tubo con diluyente, es decir, se consideran una sola muestra. Evaluación: se procede a hacer el recuento de la manera habitual haciendo diluciones de la solución de lavado y utilizando la técnica de recuento en placa o la del NMP. RECUENTO EN PLACA Colonias características de S. aureus en Agar Baird Parker 11  MEPR216 Control Sanitario e Inocuidad de alimentos_2024 3.1.6. Método de la esponja Existen esponjas de celulosa que absorben 25 veces su peso en líquido, estas pueden ser utilizadas en plantas procesadoras de alimentos para determinar la presencia de patógenos en grandes superficies o bien realizar recuentos microbianos por cm2 de superficie muestreada. 12  MEPR216 Control Sanitario e Inocuidad de alimentos_2024 3.2. VERIFICACION MICROBIOLÓGICA OFICIAL EN ESTABLECIMIENTOS PECUARIOS DE EXPORTACIÓN. D-CER-VPE-PP-009-versión 04. En Chile, la detección de patógenos en canales cárnicas mediante el método de esponja se rige por normativas y procedimientos establecidos por el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) y otras entidades competentes. Objetivo: El presente documento tiene por objeto entregar las directrices a médicos veterinarios oficiales (MVO), para la verificación del cumplimiento de los criterios microbiológicos establecidos tanto por la reglamentación nacional, como aquellos requeridos por el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) y los descritos en la normativa de los mercados/países a los cuales se certifican partidas de mercancías pecuarias de consumo humano. Alcance: Establecimientos inscritos en el listado de establecimientos exportadores de productos pecuarios (LEEPP), que pueden contar o no, con habilitaciones específicas de mercado/país. Esta actividad se llevará a cabo por medio de: ❑ Verificación oficial ejecutada por SAG (VO), en la que el SAG colectará muestras de carácter oficial, mediante las cuales evaluará, tanto el desempeño microbiológico del establecimiento como el cumplimiento de los requisitos de los mercados/países importadores. ❑ Verificación oficial del autocontrol microbiológico (VAM), donde el MVO evaluará, por medio de la revisión de los programas microbiológicos del establecimiento, la eficacia de las medidas de control implementadas por el sistema de aseguramiento de calidad (SAC), para reducir, controlar o eliminar los peligros microbiológicos, según corresponda 13  MEPR216 Control Sanitario e Inocuidad de alimentos_2024 I. Verificación oficial ejecutada por el SAG (VO). A. Verificación Microbiológica Oficial – Salmonella spp. Alcance: Establecimientos faenadores de la especie bovina, ovina, porcina y aves (pollos y pavos), inscritos en el LEEPP. Objetivo: Verificar la suficiencia del plan HACCP desarrollado, implementado y ejecutado por el establecimiento a lo largo del proceso de faena, para prevenir la contaminación por patógenos entéricos de canales o carcasas, según corresponda. Tipo de verificación: Control de higiene de proceso. El MVO evaluará la eficacia de las medidas de control del establecimiento para garantizar un proceso de faena higiénico, por medio de la toma de muestras oficiales para detectar la presencia del microorganismo Salmonella spp. Esta se llevará a cabo por medio de metodología de colecta no destructiva. El encargado de realizar la verificación oficial deberá ser capacitado previamente por el SRIC o el JEIO. Cabe mencionar que si bien, la labor de la toma de muestra podrá ser delegada a un TIO, la responsabilidad de su correcta ejecución continuará en el MVO. Actividades: La frecuencia para la obtención de la muestra oficial será semanal. Se obtendrán cinco unidades muestrales que compondrán la muestra. Se utilizará la metodología de esponjado de superficie de canales/carcasas en bovinos, ovinos, porcinos y pavos. En el caso de pollos, se ejecutará por medio de enjuague de carcasas. El control bacteriológico se realiza mediante el método no destructivo, utilizando esponjas estériles, previamente humedecidas en 10 ml de Agua Peptonada Tamponada (APT) estéril, para inactivar posibles residuos desinfectantes. 14  MEPR216 Control Sanitario e Inocuidad de alimentos_2024 Por ejemplo, el procedimiento para canales de carnes rojas (bovina, porcina, ovina y caprina): método no destructivo, es el siguiente: ❑ Bovinos y porcinos: de cada hemicanal seleccionada aleatoriamente, se toma una muestra compuesta por cuatro áreas de 100 cm2 cada una (plantilla estéril de un área interior de 10 x 10 cm), con una esponja. ❑ En el caso de ovinos y caprinos se utilizarán cuatro áreas de 50 cm2 cada una (5 x 10 cm), con una esponja. Áreas de muestreo para bovinos y ovinos: A1 - Cadera/parte posterior del muslo/M. semitendinoso. A2 - Falda/parte ventral del abdomen/M. recto abdominal. A3 - Pecho/parte ventral del tórax/M. pectorales. A4 - Cuello/cara dorsolateral del cuello/ M. trapecio porción cervical. Áreas de muestreo para porcinos: A1 - Pierna (Jamón). A2 - Lomo. A3 - Vientre. A4 - Cabeza (Carrillos). ❑ Para las tres especies: En el área delimitada por la plantilla se frota primero 10 veces verticalmente (arriba hacia abajo) y luego 10 veces horizontalmente de derecha a izquierda. ❑ Aplicar la mayor presión posible. ❑ Introducir la esponja en la bolsa de origen y retirar cuidadosamente el exceso de aire atrapado 3 o 4 veces hacia la abertura de ésta. ❑ Mantenga la muestra en refrigeración, entre ≥2 y ≤8 °C 15  MEPR216 Control Sanitario e Inocuidad de alimentos_2024 Utilizar técnica de recuento (NMP o placa) según microorganismo a cuantificar o técnicas de detección según microorganismo patógeno a detectar. Fórmula para recuento en placa: Utilizar la formula anterior para obtener el n° de microorganismos por cm2 de superficie muestreada. Donde: N = Es el número de UFC en 1 ml de líquido de dilución (o líquido Neutralizante). F = Es la cantidad en mililitros de líquido de dilución (o neutralizante) en el tubo. D = Es el recíproco de la dilución usada. A = Es la superficie muestreada, en centímetros cuadrados. 16  MEPR216 Control Sanitario e Inocuidad de alimentos_2024 PROCEDIMIENTO La esponja estéril se coloca en una bolsa que contiene líquido que puede ser un diluyente o bien un caldo de enriquecimiento específico. Después del muestreo, se estruja la esponja y se desecha o bien se puede introducir la esponja con todo su contenido dentro del matraz con el caldo de enriquecimiento correspondiente. El líquido respectivo se analiza según los requerimientos del agente patógeno que se quiera pesquisar. 17  MEPR216 Control Sanitario e Inocuidad de alimentos_2024 Análisis e interpretación de resultados: (i) Análisis de la muestra El análisis de la muestra solo podrá ser realizado por laboratorios oficiales de la Red SAG o aquellos laboratorios autorizados por el SAG, por medio de las siguientes metodologías validadas internacionalmente: - Rápido: Screening Detección por Metodología Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) para Salmonella, AFNOR BIO 12/16-09/05 ó Screening Inmunoseparación magnética seguido de Real Time - Polimerase Chain Reaction (RT-PCR) / PCR Tiempo Real Salmonella. AFNOR TRA 02/12 – 01/09. - Tradicional: ISO 6579:2017 o su versión vigente. Detección de Salmonella. (ii) Interpretación de los resultados Cada ciclo estará compuesto de 50 resultados consecutivos. Los criterios de aceptación para Salmonella spp. en cada ciclo serán: Pollos ≤ 4 presencias. Pavos ≤ 4 presencias. Cerdos: ≤ 5 presencias. Bovinos (adulto y ternero) ≤ 2 presencias. Bovinos (adulto y ternero) ≤ 1 presencia en Establecimientos habilitados para EE.UU. Ovinos: ≤ 2 presencias. En el caso que los resultados oficiales muestren una tendencia del proceso al FALLO, el MVO deberá informar al establecimiento y al SVA dicha situación. Asimismo, se deberá evaluar que se revisen las medidas de control implementadas para reducir, controlar o eliminar Salmonella. En el momento del ciclo en que se supere el criterio de aceptación establecido por especie, se considera automáticamente el sistema en FALLO. 18  MEPR216 Control Sanitario e Inocuidad de alimentos_2024 Referencias bibliográficas: - ISO 18593:2004 Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for sampling techniques from surfaces using contact plates and swabs. - VERIFICACIÓN MICROBIOLÓGICA OFICIAL EN ESTABLECIMIENTOS PECUARIOS DE EXPORTACIÓN. SAG. Gobierno de Chile. https://www.sag.gob.cl/sites/default/files/D-CER-VPE-PP-009_v04_0.pdf 19