Prácticas de Laboratorio de Bioquímica 2024-II PDF

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ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA ASIGNATURA DE BIOQUÍMICA I GUÍA DE PRÁCTICA DE LABORATORIO SEMESTRE ACADÉMICO 2024 – II V CICLO  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I CRONOGRAMA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO BIOQUÍMICA I Semana Tema Organización de grupos y distribución de foros. 1 Reglamento del laboratorio de Bioquímica. Práctica N°1: Seguridad y Bioseguridad en el laboratorio de Bioquímica. 2 Práctica N°2: Equipos de laboratorio de bioquímica y afines. 3 Práctica N°3: Determinación de pH y su regulación. Valores normales. 4 Práctica N°4: Amortiguadores y tampones fisiológicos 5 Práctica N°5: Espectrofotometría: Preparación de la Curva de Calibración 6 Práctica N°6: Enzimas: Determinación de la actividad catalítica. 7 Evaluación de Laboratorio 8 EXAMEN PARCIAL Práctica N°7: Factores que modifican la actividad enzimática I: Efecto del pH y la 9 temperatura sobre la velocidad de reacción. Práctica N°8: Factores que modifican la actividad enzimática II: Efectos de 10 concentración de sustrato y de enzima de la fosfatasa alcalina. Práctica N°9: Modelamiento de proteínas: reconocimiento de la enzima glucokinasa por 11 modelos computacionales. 12 Práctica N°10: Determinación de la glucemia por el método de la glucosa oxidasa 13 Práctica N°11: Test de tolerancia oral a la glucosa. 14 Práctica N°12: Balance energético de la glucosa. 15 Evaluación de Laboratorio 16 EXAMEN FINAL 17 EXAMEN SUSTITUTORIO UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 2  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I PRESENTACIÓN La Bioquímica es la ciencia que estudia los procesos químicos de los seres vivos desde dos puntos de vista: estructural y funcional. Mediante el primero conocemos la distribución espacial de la materia viva; con el segundo, el papel que juega en el organismo. Durante este estudio de las diversas sustancias que se encuentran en todos los organismos vivos se podrá comprender las reacciones químicas en las que se basan los procesos vitales. La palabra Bioquímica etimológicamente proviene de bio, término griego que significa "vida" y química “ciencia que estudia la materia”, uniendo estas dos voces se desprende “estudio de la materia viva” pero desde una visión ampliación del mismo para comprender la organización, estructura, interrelación y función de los proceso químicos del ser vivo. Para comprender la influencia de la Bioquímica en la Medicina, es preciso conocer los elementos químicos que conforman la materia viva, la estructura de las biomoléculas (proteínas, carbohidratos, lípidos, nucleótidos, vitaminas, etc.), su comportamiento que bajo los principios básicos de la termodinámica llevan a cabo para que las células logren realizar sus funciones de crecimiento, reproducción, envejecimiento y muerte. La bioquímica ofrece respuestas a diversas interrogantes como “¿De qué estamos hechos?” o “¿Cómo funcionamos?”. Además de generar técnicas que son la base de los avances en otros campos como Genética, Biología Celular e Inmunología, también ofrece indicios sobre el tratamiento de enfermedades como cáncer y diabetes y mejora la eficiencia de industrias como las de tratamiento de residuos, producción de alimentos y manufactura de fármacos. El curso de Bioquímica I de la Facultad de Farmacia y Bioquímica tiene como misión la preparación integral del alumno, participando en un proceso constante de aprendizaje, construcción de ideas y formulación de preguntas e investigación, a fin de que obtenga todas las herramientas adecuadas para enfrentar los cursos posteriores que desarrollarán en la carrera. Tenemos como objetivo que el alumno adquiera y comprenda los conocimientos básicos y fundamentales de los diversos procesos bioquímicos y sus aplicaciones, así como introducirlo en el mundo de la Investigación UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 3  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I Científica con el fin de generar profesionales con capacidad de liderazgo y con un alto nivel de análisis crítico. La guía de práctica está diseñada para ayudar y orientar al alumno en el desarrollo de la práctica de laboratorio de una forma sencilla y dinámica, a fin de alcanzar un aprendizaje significativo con la supervisión del Docente. Para lograr lo anteriormente descrito es necesario que el estudiante tenga presente siempre: ✓ Leer sus prácticas antes de realizarlas. ✓ Consultar los libros de texto, o las páginas web propuestas, para aclarar dudas y resolver los cuestionarios. ✓ Realizar los experimentos con cuidado, procurando entender el ¿por qué? de los resultados. ✓ Observar minuciosa y críticamente cada uno de los cambios ocurridos. ✓ Anotar sus observaciones y resultados para que con un análisis crítico buscar la explicación científica. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 4  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I REGLAMENTO PARA BUENAS PRÁCTICAS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 1. Al inicio de cada sesión se pasará lista y la asistencia es obligatoria para tener derecho a la calificación de cada práctica. 2. Se tendrá en cuenta una tolerancia de cinco minutos para el ingreso y se registrará inasistencia si el estudiante aún no ha llegado. NO HAY TARDANZA. 3. El estudiante debe de asistir a la práctica habiendo revisado previamente la información teórica concerniente al tema en la fecha respectiva. 4. Para cada sesión de laboratorio es indispensable el uso del guardapolvo o bata blanca de manga larga y de textura gruesa. Queda prohibido el uso de pantalones cortos, sandalias, aretes, collares, maquillaje u otros accesorios innecesarios para el desarrollo de la práctica. 5. Al momento de ingresar a la práctica, el alumno debe estar completamente uniformado, según la normativa de la Institución y del laboratorio. 6. Queda estrictamente prohibido ingresar con bebidas y alimentos, así como comer y/o fumar dentro del laboratorio. 7. Para el desarrollo de la práctica, cada equipo deberá traer sin excepción el material solicitado con anterioridad. 8. Durante el desarrollo de la práctica, los integrantes deben tener una participación activa en el desarrollo de la misma. 9. El reporte y/o informe de práctica puede ser grupal y debe ser redactado a mano, con excepción de las ilustraciones que pueden ser digitalizadas. Se deberán presentar en la siguiente sesión de práctica y para todas las sesiones. 10. La evaluación de cada práctica es de forma individual ya sea mediante examen escrito o evaluación oral. 11. Al término de cada sesión, TODOS los integrantes de trabajo se asegurarán que su mesa y el material entregado quede limpio y ordenado. 12. La eliminación de residuos, agujas y/o contaminantes biológicos se deben realizar siguiendo las normas de bioseguridad. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 5  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I REPORTES DE LABORATORIO Con la elaboración del reporte se busca preparar al estudiante para que en el ejercicio de su carrera profesional pueda presentar informes de actividades, elaborar propuestas, reportar y analizar resultados confiables. Contenido del reporte: 1. Nombre de la práctica. 2. Introducción. En él se indica la finalidad de la práctica, se presenta de forma general un resumen de la teoría que se pretende corroborar con una descripción de la terminología usada en la práctica. 3. Antecedentes. Esta sección contiene toda la información necesaria para comprender el tema que se está revisando en la práctica. 4. Objetivos. 5. Parte experimental. Corresponde a lo que realmente se hizo en el laboratorio, evitando que sea una copia textual de la guía de laboratorio, las observaciones deben ser escritas de manera concisa, pero claras y redactadas de forma impersonal. 6. Cálculos y resultados. En esta parte se muestra las ecuaciones químicas, se describe lo observado en la práctica. Se pueden reportar en forma de gráficos o tablas. 7. Discusión de resultados. Se presentan los argumentos teóricos comparados con los resultados experimentales obtenidos, se analizan las diferencias de los datos teóricos con los experimentales, indicando las posibles causas. 8. Conclusiones. Se expresan en forma resumida los resultados del análisis efectuado, derivado del trabajo experimental y de las interrogantes planteadas. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 6  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I 9. Bibliografía. Se enlista el material bibliográfico consultado para la realización del reporte siguiendo la normativa vancouver. A continuación, se muestran algunos ejemplos de cómo se debe reportar la bibliografía dependiendo de las fuentes más comunes. Libros (aparecen según la secuencia de numeración) Primer apellido seguido de la inicial del primer nombre. Título del libro. Edición. Lugar de publicación, Estado/país: Editorial, año de publicación. N° de páginas. Fecha de la consulta. Sitio web o dirección URL de la página consultada. Ejemplo: Voet, D.; Voet, J.G.; Pratt, C.W.: Fundamentos de Bioquímica. 2ª Edición. Editorial Médica Panamericana. 2006. Revistas Autores, (fecha de publicación). Título del artículo. Título de la revista, número del volumen y del ejemplar, número de las páginas del artículo. Ejemplo: Aguilar y Pineda (2009). Cáñamo: Una alternativa textil ecológica. Revista de Química Textil, No. 195, noviembre-diciembre 2009, 334-337. Medios electrónicos Autor, (fecha de publicación), titulo, identificación de la referencia para acceder a la información (URLo DOI), URL (Uniform Resource Locator). Dirección de internet Ejemplo: http://www.cmpr.edu/biblioteca/docs/resena.pdf http://library.nmu.edu/guides/userguides/styleapa.ht ml 10. Anexo 1: Medidas de seguridad. Incluir la información de seguridad de reactivos manejados en la práctica. 11. Anexo 2: Disposición de reactivos. Indicar las medidas tomadas para la disposición de los desechos generados en la práctica. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 7  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I MECANISMO EVALUACIÓN La evaluación se llevará a cabo como se muestra a continuación: UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 8  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I RELACIÓN DE REACTIVOS REACTIVO Aceite mineral frasco de 1 L Acetato de plomo trihidratado frasco de 100 gr Acido clorhídrico frasco de 2.5 L Acido etilendiaminotetraacético anhidro (EDTA) frasco de 1 Kg Acido nítrico frasco de 1 L Almidón frasco de 500 gr Arena de cuarzo (arena de sílice) bolsa de 3 Kg Azul de bromotimol frasco de 100 gr Azul de metileno cloruro indicador frasco de 25 gr Buffer de referencia pH 4 frasco de 1 L Buffer de referencia pH 7 frasco de 1 L Cianuro de sodio frasco de 500 gr Cloruro de sodio frasco de 2.5 Kg Dodecil sulfato sódico (SDS) frasco de 500 gr Fosfato de sodio dibásico anhidro frasco de 500 gr Fosfato de sodio monobásico frasco de 500 mg Grenetina grado farmacéutico frasco de 500 gr Hidróxido de amonio frasco de 1 L Hidróxido de sodio frasco de 1 Kg Malonato de sodio frasco de 500 gr Papel indicador pH 0-14 caja con 100 Parafenildiamina frasco de 100 gr Pimienta negra en polvo Sacarosa 100 gr Sodio succinato anhidro frasco de 500 gr Sulfato cúprico anhidro frasco de 100 gr Yodo Lugol concentrado frasco de 500 ml UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 9  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I PREPARACIÓN DE REACTIVOS Los reactivos se deben preparar con agua destilada a pH de 7.0, si no es posible conseguirla se pueden preparar con agua Bonafont. Las cantidades de reactivos que se proponen a continuación pueden variar, si aumenta (multiplicar) o si disminuyen (dividir) según lo solicitado; algunos de ellos pueden almacenarse durante un tiempo razonable (3 0 4 meses), a temperatura ambiente o en refrigeración. Es muy importante pesar o medir las cantidades de reactivos de manera exacta y siempre disolver en un recipiente de mayor volumen para tener la libertad de agitar el reactivo. Posteriormente se debe llevar a un matraz aforado adecuado para que las soluciones queden bien preparadas. 1. Solución de NaCl al 2% Pesar 2 g de Cloruro de sodio y disolver en 100 ml de agua destilada a pH de 7.0 en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Puede guardarse en refrigeración por 30 días. 2. Solución de NaCl al 0.9% Pesar 0.9 g de Cloruro de sodio y disolver en 100 ml de agua destilada a pH de 7.0 en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Puede guardarse en refrigeración por 30 días. 3. Solución de NaCl al 0.5% Pesar 0.5 g de Cloruro de sodio y disolver en 100 ml de agua destilada a pH de 7.0 en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Puede guardarse en refrigeración por 30 días. 4. Solución saturada de NaCl En un matraz Erlenmeyer de 2L añadir un litro de agua destilada pH de 7 ir agregando cloruro de sodio y agitar, continuar agregando hasta que este ya no se disuelva. Puede guardarse en refrigeración por 90 días. 5. Solución de NaH2P04 al 0.1 M Disolver 12 gr de fosfato de sodio monobásico en 1 lt de agua destilada pH de 7. Puede guardarse en refrigeración por 30 días. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 10  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I 6. Solución de NaOH al 0.1 N Disolver 4 g de hidróxido de sodio en un vaso de precipitados de 250 ml con 80 ml de agua, agitar suavemente y con cuidado ya que es un reactivo que puede quemar la piel. Se deja enfriar y se pasa el contenido a un matraz aforado de 1000 ml y se completa hasta la marca con el agua destilada. Se puede conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente indefinidamente. 7. Solución de NaHC03 al 3% Disolver 3 gr de bicarbonato de sodio en 100 ml de agua destilada pH de 7. Puede guardarse en refrigeración por 90 días. 8. Solución de grenetina al 10% Disolver en baño maría 10 gr de grenetina en 100 ml de agua destilada pH de 7, en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Mantenerse a 37°C en la estufa bacteriológica. Desecharse después de su uso. 9. Solución de almidón al 10% Disolver 10 gr de almidón en 100 ml de agua destilada pH de 7. Si no se utiliza el mismo día, guardar en refrigerador a 4°C, solamente por tres días. 10. Solución de sacarosa al 10% Disolver 10 gr de sacarosa en 100 ml de agua destilada pH de 7. Desecharse después de su uso. 11. Solución de HN03 al 20% En un matraz Erlenmeyer de 250 ml con 80 ml de agua destilada a pH 7.0 añadir 20 ml de ácido nítrico lentamente. Guardar en frasco ámbar con tapón de hule indefinidamente a temperatura ambiente. 12. Solución de HCI IM En un matraz aforado de 1L con 300 ml de agua destilada a pH 7.0 añadir 83.5 ml de ácido clorhídrico lentamente y aforar hasta la marca. Guardar enfrasco ámbar con tapón de hule indefinidamente a temperatura ambiente. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 11  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I 13. Solución de NaOH 1M Disolver 40 g de hidróxido de sodio en un vaso de precipitados de 250 ml con 150 ml de agua, agitar suavemente y con cuidado ya que es un reactivo que puede quemar la piel. Se deja enfriar y se pasa el contenido a un matraz aforado de 1000 ml y se completa hasta la marca con el agua destilada pH de 7. Se puede conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente indefinidamente. 14. Solución de CuS04 0.1M Disolver 1.59 gr de sulfato cúprico anhidro en 100 ml de agua destilada pH de 7. Se puede conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente indefinidamente. 15. Solución de PB(CH3C00)2.3H20 0.1M Disolver 3.79 gr de acetato de plomo trihidratado en 100 ml de agua destilada pH de 7. Se puede conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente indefinidamente. 16. Solución de azul de bromotimol al 0.01 % Disolver 0.01 gr de azul de bromotimol en 100 ml de agua de la llave. Se puede conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente durante 3 meses. 17. Solución de Na2H4C405 al 1% Disolver 1 gr de malonato de sodio en 100 ml de agua destilada pH de 7. Se puede conservar en refrigeración durante 3 meses. 18. Solución de parafenilendiamina al 1 % De acuerdo a la cantidad solicitada por grupo, pesar la parafenildiamina necesaria y colocarla en un matraz Erlenmeyer de 125 ml forrado con papelaluminio. Aparte en otro matraz colocar el agua destilada pH de 7 necesaria para disolver el reactivo. Desechar el sobrante. 19. Solución de Na2HP04 al 0.06 % Disolver 0.06 gr de fosfato de sodio dibásico anhidro en 100 ml de agua destilada pH de 7. Se puede conservar en refrigeración por 7 días. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 12  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I 20. Solución de azul de metileno al 0.01 % Disolver 0.01 gr de azul de metileno en 100 ml de agua destilada pH de 7. Se puede guardar en frasco ámbar con tapón de hule a temperatura ambiente. Si se forma una natilla en la superficie se debe desechar. 21. Solución de al Na2C4H404 1.5 % Disolver 1.5 gr de succinato de sodio en 100 ml de agua destilada pH de 7. Se puede conservar en refrigeración por 7 días. 22. Solución de NaCN al 0.01 % Disolver 0.01 gr de cianuro de sodio en 100 ml de agua destilada pH de 7. Se puede guardar en frasco ámbar con tapón de hule a temperatura ambiente indefinidamente. 23. Solución de lugol al 10% En un matraz Erlenmeyer añadir 10 ml de yodo lugol concentrado y agregar 100 ml de agua destilada pH de 7. Conservar en frasco ámbar y con tapón de hule. 24. Solución de NaCl 5M Disolver 292 gr de cloruro de sodio en 1 L de agua destilada pH 7. Puede guardarse en refrigeración por 90 días. 25. Solución de dodecil sulfato sódico (SDS) al 20% Disolver 20 gr de SDS en 100 ml de agua destilada pH de 7. Puede guardarse en refrigeración por 90 días. 26. Solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0.5 M En un matraz aforado de 1L añadir 146 gr de EDTA anhidro y aforar con agua destilada pH de 7. Puede guardarse en refrigeración por 90 días. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 13  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I GLOSARIO DE BIOQUÍMICA 1. Acidófilo: Es un organismo, o la estructura del cual, que se desarrolla preferentemente en un medio ácido. 2. Ácidos nucleicos: Moléculas biológicas grandes que están formados por moléculas de azúcares pentacarbonados uniformando esteres con ácidos fosfóricos. 3. Albúmina: La albúmina es una proteína producida por el hígado. El examen de albúmina en suero mide la cantidad de esta proteína en la parte líquida y transparente de la sangre. 4. Amilasa: La amilasa es una enzima que ayuda a digerir los carbohidratos. Se produce en el páncreas y en las glándulas salivales. Cuando el páncreas está enfermo o inflamado, se libera amilasa en la sangre. 5. Aminoácidos: Los aminoácidos son compuestos orgánicos que se combinan para formar proteínas. Los aminoácidos y las proteínas son los pilares fundamentales de la vida. Cuando las proteínas se digieren o se descomponen, los aminoácidos se acaban. El cuerpo humano utiliza aminoácidos para producir proteínas. 6. Carbohidratos: Los carbohidratos son moléculas formadas por carbono, hidrógeno y oxígeno (C, H, O) e incluyen algunas de las moléculas más relevantes en la vida de los organismos, como son la glucosa, que es universalmente utilizada por las células para la obtención de energía metabólica, el glucógeno contenido en el hígado y el músculo, que forma la reserva de energía más fácilmente accesible para las células del organismo y la ribosa y desoxirribosa que forman parte de la estructura química de los ácidos nucleicos. Incluyen tanto azucares como los polímeros de los azucares. Los hidratos de carbono más simples son los monosacáridos, disacáridos y polisacáridos. 7. Cistatina: Es una proteína de bajo peso molecular, propuesta como marcador de función renal más sensible que la creatinina al detectar de forma precoz alteraciones en la función renal. La medida de cistatina en suero en determinados grupos de pacientes como ancianos, niños o diabéticos parece aportar más información que la creatinina. 8. Deshidrogenasa: Son enzimas capaces de catalizar la oxidación o reducción de un sustrato por sustracción o adición de dos átomos de hidrógeno (deshidrogenación). 9. Desnaturalización: Pérdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 14  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I 10. Dilución: Es la reducción de la concentración de una sustancia química en una disolución. La dilución consiste en rebajar la cantidad de soluto por unidad de volumen de disolución. Se logra adicionando más diluyente a la misma cantidad de soluto: se toma una poca porción de una solución alícuota y después esta misma se introduce en más disolvente 11. Electrolitos: Son minerales presentes en la sangre y otros líquidos corporales que tienen una carga eléctrica. Es cualquier sustancia que contiene iones libres, los que se comportan como un medio conductor eléctrico. Debido a que generalmente consisten en iones en solución, los electrólitos también son conocidos como soluciones iónicas. Los comunes abarcan: sodio, potasio, calcio, cloro, fosfatos. Son importantes porque, las células (especialmente del sistema nervioso, corazón y músculo) los utilizan para mantener tensiones a través de sus membranas celulares y para llevar los impulsos eléctricos (impulsos nerviosos, contracciones musculares) a través de ellos mismos y a otras células. Los riñones trabajan para mantener las concentraciones de electrolitos en la sangre constante a pesar de los cambios en tu cuerpo. 12. Entramado orgánico: Es formado por restos de la destrucción de bacterias y polisacáridos de cadena larga sintetizados por las propias bacterias a partir de los azúcares de la dieta. Tiene tres funciones: sujeción, sostén y protección de las bacterias de la placa, que luego puede progresar a patologías bucales como la caries. 13. Equilibrio dinámico: Un equilibrio dinámico ocurre cuando dos procesos reversibles ocurren al mismo paso. Muchos procesos (como algunas reacciones químicas) son reversibles y cuando están en un equilibrio dinámico, reacciones opuestas ocurren al mismo paso (es demasiado eficiente). 14. Fibronectina: Es una glicoproteína adhesiva presente en forma soluble en plasma e insoluble en la matriz extracelular de la mayoría de los tejidos. Es sintetizada y secretada por una gran variedad de células, por lo tanto, es uno de los componentes de mayor distribución en el cuerpo, que participa en las reacciones bioquímicas de diversos procesos fisiológicos y patológicos. 15. Fofatasas: Enzimas que catalizan la hidrólisis de fosfatos orgánicos. Se encuentra en casi todos los tejidos, especialmente en los huesos donde participan activamente en su mineralización. Se clasifican en fosfatasas ácidas y alcalinas en función de su pH óptimo. 16. Glucosa: Es un carbohidrato, y es el azúcar simple más importante en el metabolismo humano. La glucosa es un monosacárido, porque es una de las unidades más pequeñas que tiene las características de esta clase de hidratos de carbono. La glucosa también se llama a veces dextrosa. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 15  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I 17. Heterogénea: Es un adjetivo que significa que algo está compuesto de por elementos o partes de distinta naturaleza. 18. Hidrolisis de proteína: Se denomina así a la ruptura de la estructura primaria, es decir la ruptura de la secuencia de una proteína, la hidrólisis de las proteínas termina por fragmentar las proteínas en aminoácidos. 19. Hidrólisis ácida: Se basa en la ebullición prolongada de la proteína con soluciones ácidas fuertes (HCI y H2S04). Este método destruye completamente el triptófano y parte de la serina y la treonina. 20. Hidrólisis básica: Respeta los aminoácidos que se destruyen por la hidrólisis anterior, pero con gran facilidad. Normalmente se utiliza (NaOH e BaOH). 21. Hidrolisis enzimática: Se utilizan enzimas proteolíticas cuya actividad es lenta y a menudo incompleto, sin embargo, no se destruyen los aminoácidos; por lo tanto, es muy específica. 22. Histamina: Una sustancia química presente en algunas células del organismo, provoca muchos de los síntomas de las alergias, como secreciones en la nariz o estornudos. Cuando una persona es alérgica a una sustancia en particular, como un alimento o el polvo, el sistema inmune cree, erróneamente, que esta sustancia, normalmente inocua para el organismo, es en realidad nociva. En un intento de proteger al organismo, el sistema inmune desata una reacción en cadena que induce a algunas células del cuerpo a liberar histamina y otras sustancias químicas en el torrente sanguíneo. Después, la histamina actúa en los ojos, la nariz, la garganta, los pulmones, la piel o el tracto gastrointestinal de una persona y provoca síntomas de alergia. 23. Homeóstasis: Es el conjunto de fenómenos de autorregulación que llevan al mantenimiento de las propiedades y la composición del medio interno de un organismo. 24. Iones: Los átomos de un elemento tienen electrones, cada elemento pierde, gana o comparte sus electrones, de manera característica cuando interactúan con otros átomos. La forma en que se comportan los electrones hace que los átomos se encuentren en el cuerpo como partículas con carga eléctrica; a estos llamaremos Iones. Si un átomo cede o gana electrones, se convierte en un ion el cual puede ser con carga positiva o negativa. 25. Inmunoglobulinas: Son anticuerpos; son producidas por el sistema inmunológico para atacar a los antígenos, como las bacterias, los virus y los alérgenos. El cuerpo genera diferentes inmunoglobulinas para combatir cada antígeno. Por ejemplo, el anticuerpo de la varicela no es el mismo que el anticuerpo de la mononucleosis. A veces, el cuerpo puede equivocarse y generar UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 16  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I anticuerpos que atacan a su propio tejido, afectando a los órganos sanos ya que los identifica como cuerpos extraños. 26. Inmunoglobulina A (IgA): Presente en grandes concentraciones en las membranas mucosas, particularmente en las paredes internas de las vías respiratorias y el tracto gastrointestinal, como también en la saliva y las lágrimas. 27. Inmunoglobulina G (IgG): El tipo de anticuerpo más abundante en los líquidos corporales. Brinda protección contra las bacterias y las infecciones virales. 28. Inmunoglobulina M (IgM): Se encuentra principalmente en la sangre y en el líquido linfático. Es el primer anticuerpo que el cuerpo genera para combatir una infección. 29. Lipasa: La lipasa es una enzima secretada por el páncreas dentro del intestino delgado. Ayuda a que el cuerpo absorba la grasa descomponiéndola en ácidos grasos. 30. Lípidos: Son un grupo de moléculas hidrófobas, los lípidos son una clase de moléculas que no se componen de polímeros, el comportamiento hidrófobo de los lípidos se basa en su estructura molecular. 31. Lisozima: Enzima lítico que actúa sobre bacterias gram-positivas destruyendo su pared bacteriana. Se encuentra en las lágrimas, la saliva, mucosidades y en la leche materna. Se utiliza en ocasiones en el tratamiento de las aftas bucales y de algunas. 32. Moléculas orgánicas grandes: Se trata de otro nivel de jerarquía en la organización biológica se alcanza cuando pequeñas moléculas orgánicas se unen dentro de las células para formar moléculas más grandes de las cuales se reconocen cuatro clases principales de moléculas biológicas grandes que son: a. Hidratos de carbono b. Lípidos c. Proteínas d. Ácidos nucleicos 33. Moléculas orgánicas pequeñas: Son compuestos de carbono se encuentran en estado libre disueltas en el citoplasma y cumplen diversas funciones. Algunas son monómeros que forman parte de macromoléculas, otras sirven como fuentes de energía y se descomponen. 34. Neutralización de ácidos: Es aquella en la que un ácido (o un óxido ácido) reacciona con una base (u óxido básico). En la reacción se forma una sal y en la mayoría de los casos agua. 35. Polímeros: Son macromoléculas (generalmente orgánicas) formadas por la unión de moléculas más pequeñas llamadas monómeros. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 17  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I 36. Polisacáridos: Cadenas moleculares formadas de monosacáridos a diferencia de las proteínas no tienen peso molecular definido, ya que son sintetizados a partir de un molde de (RNAm) como las proteínas. 37. Puentes iónicos: Los enlaces por puente iónico (puente de hidrógeno) consisten en interacciones que mantienen dos moléculas unidas. Son de mucha menor intensidad que los enlaces covalentes y se producen por interacciones entre átomos muy electronegativos situados en una molécula. 38. Proteínas: Son macromoléculas compuestas por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. La mayoría también contienen azufre y fósforo. Las mismas están formadas por la unión de varios aminoácidos, unidos mediante enlaces peptídicos. 39. Peptidasas: Son enzimas que rompen los enlaces peptídicos de las proteínas. Para ello, utilizan una molécula de agua por lo que se clasifican como hidrolasa. 40. Peroxidasas salivales: Es un agente inhibidor que genera la intoxicación directa de gran cantidad de microorganismos, incluido Streptococcus mutans implicado en la caries dental. 41. Ribonucleasas: abreviada comúnmente como RNAasa, es una enzima (nucleasa) que cataliza la hidrólisis de ARN en componentes más pequeños. Pueden dividirse en endonucleasas y exonucleasas, y comprenden varias subclases dentro de las clases de enzimas. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 18  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I PRÁCTICA N°1: NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO I. COMPETENCIAS ✓ Reconocer las normas de seguridad, las políticas de trabajo y el manejo adecuado de las sustancias tóxicas y los desechos peligrosos en un laboratorio de bioquímica para evitar riesgos en nuestra integridad y en el entorno. ✓ Brindar información, recomendando los procedimientos seguros y normalizar el manejo de todos los agentes de riesgo promoviendo el interés por la seguridad y favorecer la práctica de trabajo seguro en el laboratorio. II. INTRODUCCIÓN Las condiciones de seguridad en el laboratorio se definen como cualquier característica que pueda tener influencia significativa en la generación de riesgos para la seguridad y la salud del trabajador. Se incluyen en esta definición: lugares de trabajo, herramientas, máquinas, instalaciones, insumos y procedimientos de trabajo. Las normas generales de seguridad para laboratorios están dirigidas a todas aquellas personas cuya actividad tienen relación con el trabajo de laboratorio, en donde es necesario observar medidas y precauciones para evitar accidentes, manejar correctamente los incidentes y para minimizar sus consecuencias. Algunas de estas normas representan la información básica, para adoptar las medidas de seguridad durante el tiempo de trabajo y de permanencia en el laboratorio, que debemos aplicar por el bien propio y el bien común, estimulando el conocimiento de las precauciones de seguridad. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 19  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I El principio básico de la conciencia de seguridad en el trabajo son el conocimiento de: ✓ Los peligros generales del trabajo en un laboratorio. ✓ Los peligros específicos del área de trabajo. ✓ El peligro de los reactivos y las reacciones químicas. ✓ Las acciones a tomar en caso de emergencia. ✓ Los documentos de seguridad relacionados con la preparación del trabajo. III. ALCANCE Será de aplicación en todos los Laboratorios y Cátedras de Salud de la Universidad María Auxiliadora. IV. NORMAS GENERALES PARA EL MANEJO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS A. NORMAS PERSONALES 1. Durante la estancia en el laboratorio el alumno deberá llevar obligatoriamente gafas de seguridad, guantes, gorra y bata. 2. Los lentes de contacto pueden resultar muy peligrosas. Las personas que necesiten llevar lentes de contacto durante los trabajos de laboratorio deben ser conscientes de los peligros potenciales. 3. El pelo largo debe llevarse recogido y usar gorro para evitar que ellos entren en contacto con materiales biológicos o químicos durante la manipulación, o que se prendan en los equipos. 4. No se dejarán en el laboratorio mochilas, abrigos, bolsos..., utilizar casilleros. 5. Está terminantemente prohibido fumar o consumir alimentos o bebidas en el laboratorio. 6. No se debe pipetear con la boca ninguna clase de sustancia, ni tocarlos con las manos. 7. Lavarse las manos y quitarse la bata antes de salir del laboratorio. 8. Se debe lavar por separado la ropa que has utilizado en el laboratorio. 9. Evita que las mangas, pulseras, etc. estén cerca de las llamas o de maquinaria eléctrica en funcionamiento. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 20  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I 10. Cúbrete la piel que pudiera resultar expuesta a salpicaduras, roces u objetos expulsados. 11. No se debe llevar pantalones cortos, faldas o sandalias en el laboratorio. 12. Se recomienda llevar zapatos que cubran y protejan completamente los pies. 13. Cada responsable del laboratorio debe verificar que al final del día no queden equipos conectados o experimentos en marcha, excepto aquellos que cuenten con su aviso de operación nocturna. 14. Cuando se trabaja en el laboratorio, todas las puertas deberán estar sin llave y libres de obstáculos. EQUIPO DE PROTECCIÓN PERSONAL UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 21  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I B. NORMAS A SEGUIR PARA EL ALMACENAMIENTO DE SUSTANCIAS QUÍMICAS 1. Comprobar que las sustancias se encuentran adecuadamente etiquetadas. 2. Disponer de la ficha de datos de seguridad; ya que, ésta brinda toda la información en forma concisa de la sustancia. 3. Llevar un registro actualizado permite tener un control sobre su antigüedad evitando envejecimientos. 4. Agrupar y clasificar los productos por su riesgo. 5. Los guantes deberán utilizarse durante la manipulación de productos cáusticos. 6. Disponer de un área de trabajo que cumpla con los requerimientos mínimos. Clasificación de PQ según UN/NTC 1692 (Naciones Unidas/Norma Técnica Colombiana) Clasificación de PQ según NFPA 704 Etiqueta de Modelo ROMBO - 704 GRADOS DE RIESGO: 4. Muy alto 3. Alto 2. Moderado 1. Ligero 0. Mínimo RIESGO ESPECIAL: Oxidante OXI Ácido ACID Alcalino ALK Corrosivo CORR No se exponga al AGUA Radioactivo UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 22  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I Clasificación según la Directiva o Comisión Económica Europea Muestra los riesgos de un Símbolos de riesgo (Pictogramas) de la CEE componente químico; generalmente se utiliza para almacenamiento. Usualmente se encuentra en la etiqueta de la sustancia química. C. NORMAS PARA LA UTILIZACIÓN DE PRODUCTOS QUÍMICOS 1. Evitar el contacto de los productos químicos con la piel. No pipetear con la boca, utilizar embudos para trasvasar líquidos. 2. Si accidentalmente se vierte un ácido u otro producto químico corrosivo se debe comunicar al docente. 3. Para detectar el olor de una sustancia, no se debe colocar la cara directamente sobre el recipiente: utilizando la mano abierta como pantalla, es posible hacer llega una pequeña cantidad de vapor hasta la nariz. Los frascos deben cerrarse inmediatamente después de su uso. 4. En la preparación de disoluciones debe agitarse de modo suave y controlado para evitar salpicaduras. 5. Los ácidos requieren un cuidado especial. Manipularlos con precaución y en la vitrina. Cuando queramos diluirlos, nunca echaremos agua sobre ellos; siempre, al contrario, es decir, ácido sobre agua. 6. Antes de utilizar cualquier producto, debemos fijarnos en los pictogramas de seguridad de la etiqueta, con el fin de tomar las medidas preventivas oportunas. 7. Cuando se caliente una sustancia en un tubo de ensayo, el extremo abierto del tubo no debe dirigirse a ninguna persona cercana a fin de evitar accidentes. 8. Extremar las precauciones en el encendido de los mecheros, manteniendo la llama encendida durante el tiempo estrictamente necesario. 9. En principio, si no se tiene otra información fiable, se debe suponer que todos los productos químicos son tóxicos, y que todos los disolventes orgánicos son inflamables debiendo mantenerlos alejados del fuego. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 23  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I D. NORMAS PARA LA UTILIZACIÓN DE INSTRUMENTACIÓN 1. Cuando se determinan masas de productos químicos con balanza se utilizará un recipiente adecuado. 2. Se debe mantener perfectamente limpio y seco el lugar dónde se encuentre situado cualquier instrumento con contactos eléctricos. Leer las instrucciones de uso de los instrumentos. 3. Debe revisarse el material de vidrio para comprobar posibles fisuras, especialmente antes de su uso a vacío o presión. 4. En los montajes de reflujo y destilación hay que añadir el germen de ebullición (plato poroso) en frio, las juntas esmeriladas deben estar bien ajustadas. No abandonar nunca el puesto de trabajo mientras se esté llevando a cabo alguna reacción, destilación o medida. 5. En el laboratorio existen contenedores debidamente etiquetados donde se introducirán en su caso, los residuos generados. E. NORMAS PARA LA PREPARACIÓN DE REACTIVOS 1. Para la preparación de reactivos, trabaje en un campo ordenado y limpio, use guantes, mascarilla, utilice la balanza mecánica, no traslade los materiales, consérvelos en su lugar original y tare antes de cualquier pesada; utilice la campana extractora para cualquier preparación con solventes, ácidos, corrosivos, vapores tóxicos, etc., use bombillas de succión, no pipetee con la boca. 2. Debe leer cuidadosamente las concentraciones y precauciones que indica el frasco madre del reactivo químico que va a preparar, realice los cálculos respectivos cerciorándose que los datos son correctos. 3. Trabaje con estricto orden, limpieza y tomando en cuenta las Normas de Seguridad en Laboratorios y Bioseguridad, cuide su vida e integridad y la de sus compañeros. 4. Lave sus materiales con abundante agua destilada ANTES de realizar las preparaciones, de igual manera sus envases de vidrio esmerilado (para las soluciones liquidas) y los frascos ámbar de plástico (para reactivos sólidos) cualquier tipo de frasco no debe contener ninguna clase de agente extraño que pueda alterar las características del UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 24  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I reactivo original, todos los envases deben tener la tapa correcta que encaje y brinde seguridad al usuario, si es un reactivo volátil debe colocar un tapón de plástico antes que la tapa rosca. 5. Los reactivos ya preparados deben contar con su etiqueta, con todos los datos consignados, sin derrames, ni borrones, letra legible y separada en bandejas con el nombre del curso y docente. 6. Se cumplirá el lavado de frascos con escobilla y detergente según corresponda. 7. Al lavar el interior de los frascos y las tapas, remover los rótulos con cuchilla con esponja la superficie de los frascos (vidrio y plástico), enjuague el frasco con abundante agua y con una solución de ácido nítrico al 10%. 8. Colocar los frascos en la mesa boca abajo sobre una franela o tela absorbente, de igual manera las tapas y remuévalas constantemente. Finalmente, enjuague con agua destilada antes de usar el frasco. 9. Antes de guardar los materiales realizar la verificación del buen estado de las mismas desechando los materiales rotos, rajados, deformados, mal lavados colocarlos nuevamente en el lavadero para repetir el proceso. 10. Recuerde que este proceso es muy importante y forma parte de un buen proceso de preparación de reactivos. Actúe con responsabilidad 11. Al finalizar la jornada deje todo limpio y ordenado, verificará antes de retirarse que todo quede apagado, desconectado y conforme si hay algo pendiente debe quedar rotulado con fecha, nombre de la sustancia y responsable. 12. Recuerde que TODOS los reactivos con los que trabajan deben hacerlo con mucho CUIDADO. F. NORMAS EN CASO DE EMERGENCIA En caso de tener que evacuar el laboratorio, cerrar la llave del gas y salir de forma ordenada siguiendo en todo momento las instrucciones que haya impartido el docente. Localizar al iniciar la sesión de prácticas los diferentes equipos de emergencia en el correspondiente laboratorio: D-Duchas y lavaojos, E-Extintores, M-Mantas ignífugas, B-Botiquín, AB- Absorbente para derrames, AL-Alarma de emergencia, S-Salida de emergencia y V- Recipiente para el vidrio roto. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 25  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I G. PROCEDIMIENTOS EN CASO DE ACCIDENTES EN EL LABORATORIO 1. INOCULACIÓN ACCIDENTAL, CORTES O ABRASIONES, QUEMADURAS PEQUEÑAS: ✓ Quitar la ropa que cubra la parte afectada ✓ Lavar la parte lesionada con abundante agua y jabón y cubrir con gasa. ✓ Llevar inmediatamente al tópico. 2. ROTURA O DERRAMAMIENTO DE RECIPIENTES DE CULTIVOS, MUESTRAS BIOLÓGICAS: ✓ Cubrir el derrame con papel periódico, empapar cuidadosamente con fenol al 5% y dejar actuar por 30 minutos como mínimo antes de limpiar el área. ✓ Utilizar guantes descartables para la limpieza. ✓ Proceder a descartar en bolsas bien cerradas y autoclavar. ✓ Realizar la limpieza habitual. 3. INGESTIÓN ACCIDENTAL DE MATERIAL POSIBLEMENTE INFECCIOSO: ✓ Quitarse el mandil inmediatamente ✓ Informar al docente de práctica sobre el accidente ✓ Trasladar inmediatamente al hospital más cercano ✓ Registrar el accidente. 4. ABSORCIÓN DE UN GAS POSIBLEMENTE PELIGROSO: ✓ Evacuar de la zona contaminada. ✓ Las personas afectadas deben ser atendidas en el tópico e inmediatamente ser llevadas a un centro médico. ✓ Al cabo de una hora efectuar la descontaminación del ambiente (ventilando), debe llevar ropa protectora, guantes, y mascarilla. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 26  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I H. SANCIONES POR INCUMPLIMIENTO DE LAS NORMAS EN EL LABORATORIO El incumplimiento de cualquiera de las normas durante la estancia en el laboratorio podrá implicar desde una seria amonestación hasta la expulsión del alumno del laboratorio. El alumno debe declarar y afirmar “Quedo enterado de las normas para la estancia en el laboratorio, así como de la obligación de su cumplimiento”. I. PICTOGRAMAS DE SEGURIDAD Un pictograma de peligro es una imagen adosada a una etiqueta que incluye un símbolo de advertencia y colores específicos con el fin de transmitir información sobre el daño que una determinada sustancia o mezcla puede provocar a la salud o al medio ambiente. Figura 1: Pictograma de seguridad UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 27  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I CATEGORÍA DESCRIPCIÓN CLASE PICTOGRAMA Sustancias y preparados quepuedan explosionar Explosivos bajo el efecto de una E: Explosivo llama o que son más sensibles a los choques o a la fricción que el dinitrobenceno. Sustancias y preparados Comburentes queen contacto con una O: Comburente reacciónfuerte exotérmica son extremadamente inflamables. F: Fácilmente Sustancias y preparados inflamable Inflamables cuyo punto de destello seaigual o superior a F+: Extremadamente 21ª C e inferior o igual a inflamable 55ª C Muy tóxicos Sustancias y preparados quepor inhalación, ingestión o penetración T+: Muy tóxico cutánea puedan entrañar riesgos extremadamente graves agudos o crónicos e incluso la muerte. Tóxicos Sustancias y preparados quepor inhalación ingestión o penetración T: Tóxico cutánea puedan entrañar riesgos graves agudos o crónicos e incluso la muerte. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 28  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I Sustancias y preparados queen contacto con los Corrosivos tejidos vivos puedan C: Corrosivo ejercer sobre ellos una acción destructiva. Sustancias y preparados Nocivos que por inhalación, ingestión o penetración Xn: Nocivo cutánea puedan entrañar riesgos de gravedad limitada. Sustancias y preparados no Irritantes corrosivos que por contacto inmediato, Xi: Irritante prolongado o repetido con la piel o mucosas puedan provocar una reacción inflamatoria. Sustancias y preparados Peligrosos cuya utilización presenta o para el medio puedan presentar riesgos N: Peligroso para ambiente. inmediatos o diferidos elmedio para elmedio ambiente. ambiente UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 29  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO I. COMPETENCIAS ✓ Establecer los procesos y protocolos para el manejo de las normas de Bioseguridad en las prácticas del laboratorio de Bioquímica. ✓ Determinar los diferentes niveles de Bioseguridad ✓ Establecer la importancia de los elementos de bioseguridad ✓ Comprender las normas generales de Bioseguridad II. INTRODUCCIÓN Es un conjunto de normas y medidas preventivas para mantener controlado los factores de riesgo procedentes de trabajar con agentes biológicos o químicos que pueden poner en peligro nuestra salud. Estas normas intentan minimizar los riesgos de esta actividad diaria de los trabajadores y todas las personas que trabajan en un laboratorio con agentes nocivos para la salud. Principios de la bioseguridad: La bioseguridad tiene tres principios que sustentan y dan origen a las normas generales. Estos son: Universalidad, Barreras de protección y Medidas de eliminación. 2.1. NIVELES DE BIOSEGURIDAD Se define como nivel de seguridad (Biosafety Level, BSL) a las condiciones bajo las cuales los agentes biológicos pueden comúnmente manipularse de forma segura. La OMS clasifica los microorganismos infecciosos en cuatro grupos en función del riesgo intrínseco que suponen. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 30  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I Se especifican cuatro niveles de bioseguridad, cuando se tratan agentes biológicos; esta clasificación identifica el riesgo biológico que representan para la salud de las personas por el tipo de agentes que ahí se utilizan. a. Nivel de bioseguridad 1: Peligro mínimo para el personal del laboratorio. Acceso no restringido. No se requiere equipo de trabajo especial. b. Nivel de bioseguridad 2: Se manipulan agentes de peligro moderado para el personal. El personal que trabaja en el laboratorio tiene un tipo de entrenamiento específico. Acceso restringido. c. Nivel de bioseguridad 3: Se trabaja con agentes que pueden causar daño importante para la salud. Es el tipo de seguridad en laboratorios clínicos o universitarios. Se necesita vestimenta y equipo de protección. d. Nivel de bioseguridad 4: Existe alto riesgo de contagio y que los agentes tratados son muy perjudiciales para la vida. Se trabaja con trajes especiales que cubren todo el cuerpo y tienen sobrepresión con respecto al exterior Las instalaciones de los laboratorios se clasifican, asimismo, en cuatro niveles de bioseguridad que están relacionados con los grupos de riesgo en los que se clasifican los microorganismos infecciosos. Laboratorio Básico 1 - Nivel 1 de Bioseguridad Laboratorio Básico 2 - Nivel 2 de Bioseguridad Laboratorio de Contención - Nivel 3 de Bioseguridad Laboratorio de Contención máxima - Nivel 4 de Bioseguridad Esta clasificación está basada en un conjunto de aspectos tales como: las características de diseño y construcción del laboratorio, elementos de contención, equipos y procedimientos de trabajo que se requieren para el trabajo con agentes biológicos de los diferentes grupos de riesgo. En la normativa española el término «nivel de bioseguridad» se corresponde con el de «nivel de contención» y, en ella, se incluyen las medidas específicas de contención para los niveles 2, 3 y 4. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 31  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I GRUPOS DE RIESGOS DE LOS AGENTES BIOLÓGICOS Riesgo de Profilaxis o Grupo de Riesgo Infeccioso propagación a la tratamiento Riesgo colectividad eficaz 1 Poco probable que cause enfermedad. No Innecesario Puede causar una enfermedad y Posible 2 constituir un peligro para los Poco probable generalmente trabajadores. Puede provocar una enfermedad grave Posible 3 y constituir un serio peligro para los Probable generalmente trabajadores. Provocan enfermedad grave y No conocido 4 constituyen un serio peligro para los Elevado en la trabajadores. actualidad TIPOS DE LABORATORIOS SEGÚN GRUPO DE RIESGO Grupo de Nivel de Tipo de Práctica de Equipo de Riesgo Bioseguridad laboratorio laboratorio Bioseguridad Ninguno, trabajo en Enseñanza básica, 1 1 TMA mesa de laboratorio investigación al descubierto. Servicios de TMA y ropa Trabajo en mesa al atención protectora, señal descubierto y CSB 2 2 primaria, de riesgo para posibles diagnóstico, biológico aerosoles. investigación Prácticas BSL-2 más ropa CSB además de Diagnóstico especial, acceso otros medios de 3 3 especial, controlado y flujo contención para investigación direccional de todas las actividades aire Prácticas BSL-3 más cámara de CSB de clase III o entrada con CSB clase II más Unidades de cierre hermético, trajes presurizados, 4 4 patógenos muy salida con ducha autoclave de doble peligrosos y eliminación puerta y aire especial de filtrado. residuos TMA: Técnicas microbiológicas apropiadas CSB: Cámara de bioseguridad biológica UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 32  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I III. CUESTIONARIO 1. Describa los niveles de bioseguridad y su importancia. Debe indicar las especificaciones y requerimientos de cada tipo de laboratorio por nivel de bioseguridad y los riesgos biológicos asociados que tiene. 2. Indique los requerimientos para la eliminación de residuos biológicos como sangre, orina, heces, esputo, muestras microbiológicas (cultivos bacterianos, etc.), entre otras. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 33  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I PRÁCTICA N°2: EQUIPOS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA Y AFINES I. COMPETENCIAS ✓ Describir los equipos de mayor uso en el laboratorio de bioquímica. ✓ Comprender la importancia y los usos de los diversos equipos. ✓ Comprender los fundamentos de las técnicas involucradas a los diversos equipos en el laboratorio de bioquímica. II. INTRODUCCIÓN Los equipos de laboratorio son aparatos altamente especializados que se usan frecuentemente para el ensayo y análisis de sustancias químicas, biológicas o físicas. A través del uso de estos equipos se pueden realizar experimentos de identificación, cuantificación y control y procesos de calidad entre otros; son manipulados por personal capacitado y pueden ser utilizados en diferentes laboratorios asociados a la ciencia, investigación o medicina, posibilitando así, el desarrollo de la sociedad. Estas herramientas se utilizan en muchísimos ámbitos, desde la industria farmacéutica, alimentaria, biotecnológica, medicina, ingeniería e investigación y dependiendo del tipo de actividades que realice en el laboratorio, los equipos deben poseer características técnicas y de seguridad específicas. Para garantizar la fiabilidad de los resultados de una investigación, es necesario que estos aparatos cuenten con certificados de calibración y mantenimiento preventivo que corroboren su eficacia. III. EQUIPOS MÁS USADOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA a. Sistema frigorífico ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 34  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I b. Sistema cromatográfico _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ c. Potenciómetro ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 35  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I d. Espectrofotómetro ______________________________________________ ______________________________________________ ______________________________________________ ______________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ e. Cabinas de seguridad biológica ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 36  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ f. Campanas extractoras ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ g. Cabina de trabajo para PCR ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ ________________________________________ UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 37  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I h. Termociclador ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ ___________________________________________ i. Sistema de esterilización ________________________________ _________________________________ ________________________________ _________________________________ ________________________________ _________________________________ j. Cámara electroforética ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 38  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I k. Balanza analítica n. Baño María l. Estufa o. Rotavapor m. Mufla I. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 39  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I IV. CUESTIONARIO 1. Indicar el funcionamiento y la importancia de los equipos discutidos en clase. 2. En referencia a las cabinas de seguridad biológica, explique brevemente su clasificación, especificaciones y requerimientos de cada tipo. 3. Describa brevemente el fundamento de potenciometría, cromatografía, electroforesis. 4. Describa el funcionamiento y fundamento de los siguientes equipos o procesos: rotavapor, esterilización vapor seco y vapor húmedo. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 40  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I PRÁCTICA N°3: DETERMINACIÓN DEL PH I. COMPETENCIAS ✓ Comprender la importancia del pH en los procesos fisiológicos. ✓ Identificar los métodos que nos permiten determinar el valor de pH. ✓ Determinar el valor de pH de productos cotidianos para reconocer la importancia en los productos comerciales. II. INTRODUCCIÓN El pH es una escala numérica utilizada para especificar la acidez o alcalinidad de una sustancia, frecuentemente en solución acuosa, significa potencial de hidrógeno o potencial de hidrogeniones. El significado exacto de la p en “pH” no está claro, pero, de acuerdo con la Fundación Carlsberg, significa “poder de hidrógeno”. Otra explicación es que la p representa los términos latinos pondus hydrogenii “cantidad de hidrógeno” o potentia hydrogenii “capacidad de hidrógeno”. Este término fue acuñado por el bioquímico danés S. P. L. Sorensen, quien lo definió en 1909 como el logaritmo negativo (en base 10) de la actividad de los iones de hidrógeno. El pH se ha utilizado universalmente por lo práctico que resulta su manejo, en el área de bioquímica es de mucha importancia, pues muchas enzimas y otras proteínas tienen un pH óptimo para realizar su actividad. 2.1. Escala De Sorensen Los Valores van desde 0 hasta 14, donde el pH igual a 7 es neutro, por abajo de 7 es ácido y por arriba de 7 es básico. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 41  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I La determinación del pH es uno de los procedimientos analíticos más importantes y más utilizados en química y bioquímica. El pH determina muchas características notables de la estructura y de la actividad de las moléculas, por lo tanto, del comportamiento de células y organismos. El agua se considera neutra porque el pH es igual a 7. 2.2. Sistemas Buffers, Amortiguadores o Tampones Fisiológicos La concentración de hidrogeniones o potencial de hidrogeno (pH) en la sangre es regulada de manera estricta para mantener el pH sanguíneo en el intervalo entre 7,35 a 7,45, contrarrestando la producción diaria de ácidos por el metabolismo; esto es necesario para mantener el adecuado funcionamiento de procesos enzimáticos y células de todo el cuerpo. El término acidemia se acuña para describir una disminución del pH, indistintamente de la causa que lo origina. El término alcalemia hace referencia al aumento del pH de cualquier causa. Por otro lado, los términos acidosis y alcalosis hacen referencia al trastorno fisiopatológico que involucra un cambio en el equilibrio de ácidos y bases, con un pH normal o alterado. 2.3. Medida o Valoración del pH Una de las formas para hallar el valor teórico o matemático del pH es usar la ecuación de Sorensen, donde el pH se define como: pH = - Log  H+  pOH = - Log  OH-  pH + pOH- = 14 Como se ha mencionado, el valor a obtenerse es teórico. El pH que es medido en el laboratorio, generalmente no es el mismo que el calculado mediante ecuación o fórmula, porque el valor numérico de la concentración de iones hidrógeno, no es igual al valor de su actividad, excepto, para las disoluciones diluidas. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 42  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I Para medir el pH podemos emplear diferentes métodos, en función de la precisión con que queramos hacer la medida: ✓ Para realizar medidas del pH que no necesiten ser muy precisas se utilizan unas sustancias llamadas indicadores, que varían reversiblemente de color en función del pH del medio en que están disueltas. Se pueden añadir directamente a la disolución o utilizarlas en forma de tiras de papel indicador. ✓ Para realizar medidas exactas se utiliza un potenciómetro o pH-metro que debe estar calibrado y ser capaz de reproducir valores de pH con variaciones menores a 0,02 unidades de pH, empleando un electrodo indicador sensible a la actividad del ion hidrógeno, como el electrodo de vidrio, y un electrodo de referencia apropiado. La determinación del pH se realiza mediante la medición de la diferencia de potencial entre el par de electrodos. Las mediciones se hacen a 25 ± 2 °C preferentemente. El pH-metro o potenciómetro es un sensor utilizado en el método electroquímico para medir el pH de una disolución UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 43  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I Papel indicador universal Las tirillas se sumergen en la solución y se comparan con el patrón de coloración impreso en la caja para asignarles un pH. Indicadores ácido - base y su rango de pH UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 44  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I III. MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS 3.1. MATERIALES ✓ Tubos de ensayo y gradilla ✓ Beacker ✓ Pipetas 5ml y propipeta ✓ Espátula ✓ Pinza metálica ✓ Pisetas ✓ Agua destilada ✓ NaCl 0.9% ✓ NaOH 0.3M ✓ Vinagre ✓ Jugo de naranja ✓ Lejía ✓ Jabón líquido 3.2. PROCEDIMIENTO Experimento N°1: Medida usando indicador universal en tira rígida 1. Rotula los 8 tubos de ensayo con números del 1 al 8 indicando el nombre de cada sustancia y colóquelos en la gradilla. 2. Medir 5 ml de una solución de NaCl 0.9% y añadir al tubo de ensayo correspondiente. 3. Medir 5 ml de una solución de NaOH 3M y añadir al tubo de ensayo correspondiente. 4. Colocar 5 ml de la disolución problema (Agua destilada, Vinagre, Jugo de Naranja, jugo de melón, Lejía y Jabón Líquido) en cada tubo de ensayo correspondiente. 5. Con ayuda de una pinza metálica sumergir el papel indicador en cada disolución problema. 6. Comparar los colores resultantes con la escala de color-pH de la caja del papel indicador. UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 45  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I 7. Registrar el pH de la disolución problema. N° Muestra Problema pH 1 Agua destilada 2 Vinagre 3 Jugo de naranja 4 Jugo de melón 5 Lejía 6 Jabón líquido 7 NaCl 8 NaOH Experimento N°2: Medida usando pH-metro 1. Calibrar el pH-metro mediante las disoluciones patrón de pH 4 y pH 7. 2. Rotula los 2 vasos de precipitado indicando el nombre de las disoluciones problema. 3. Colocar 15 ml de una solución de NaCl 0.9% y NaOH 3M en cada vaso precipitado correspondiente. 4. Introducir el electrodo de pH en el vaso de precipitado con la primera disolución problema y medir el pH. 5. Limpiar el electrodo con agua destilada. 6. Repetir el mismo proceso con la segunda disolución problema. 7. Anotar los valores de pH en la siguiente tabla N° Muestra Problema pH 1 NaCl 2 NaOH UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 46  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I IV. RESULTADOS Grafique los procedimientos y anote los resultados ¿Cuál método demostró tener mayor precisión? Fundamente su Respuesta. V. DISCUSIONES ¿Los resultados obtenidos fueron los esperados? Discute sus resultados. VI. CONCLUSIONES VII. CUESTIONARIO VIII. EJERCICIOS PROPUESTOS 1. Se disuelven 28 mg de KOH (P.F. = 56) en 500 mL de agua destilada, hallar el pH de la solución. 2. Se tiene una solución acuosa de HCl cuyo pH=2, ¿Qué volumen de NaOH 0.2 M se requiere para neutralizar 400 mL de la solución ácida? 3. Se mezclan 20 mL de HCl 0.1M con 80 mL de HNO3 0.05 M ¿Cuál es el pH de la solución resultante? 4. Una solución de detergente tiene un pOH= 2.4 ¿Cuál es la concentración del ion hidrógeno? 5. El jugo gástrico es una solución diluida que contiene HCl 0.001 M ¿Cuál será la concentración del ion hidróxido? 6. Se mezclan 50 Ml de una solución acuosa de NaOH 0.2 M con 50 mL de solución 0.8 M ¿Cuál es el pH de la solución final? UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 47  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I PRÁCTICA N°4: AMORTIGUADORES Y TAMPONES FISIOLÓGICOS I. COMPETENCIAS ✓ Identificar la importancia de la regulación del pH y de los principales sistemas amortiguadores fisiológicos y su participación en la homeostasis. ✓ Conocer los principales sistemas de amortiguadores y sus mecanismos en la regulación del pH en los procesos fisiológicos. II. INTRODUCCIÓN El pH es una escala numérica utilizada para especificar la acidez o alcalinidad de una solución acuosa. La concentración de hidrogeniones o potencial de hidrogeno (pH) en la sangre es regulada de manera estricta mediante sistemas amortiguadores, soluciones reguladoras o buffer, para mantener el pH sanguíneo entre 7,35 a 7,45 contrarrestándose la producción diaria de ácidos por el metabolismo, esto es necesario para mantener el adecuado funcionamiento de procesos enzimáticos y células de todo el cuerpo. Debido a que las propiedades de numerosas moléculas biológicas varían con el pH, es importante que el pH de los sistemas vivos se conserve dentro de ciertos límites estrechos. Para el caso de la sangre, el término acidemia se acuña para describir una disminución del pH, indistintamente de la causa que lo origina. El término alcalemia hace referencia al aumento del pH de cualquier causa. Por otro lado, los términos acidosis y alcalosis hacen referencia al trastorno fisiopatológico que involucra un cambio en el equilibrio de ácidos y bases, con un pH normal o alterado. 2.1 Sistemas amortiguadores Un sistema amortiguador es una mezcla de dos componentes químicos, uno capaz de reaccionar con hidrogeniones cuando éstos se hallan en exceso, y el otro capaz de liberarlos cuando se hallan en concentración baja. Comúnmente los sistemas de amortiguamiento UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 48  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I están integrados por ácidos débiles y sus bases conjugadas (aniones que resultan de la ionización de los ácidos) bajo una condición de equilibrio químico, es decir de igualdad de las velocidades de reacción en ambos sentidos. Existen varios sistemas para regular el equilibrio ácido base, siendo tres los principales: los amortiguadores extra e intracelulares, el aparato respiratorio y el sistema renal. Sistema Hemoglobina: HHb Hb- (eritrocitos) Sistema proteínas: HProt Prot.- (intracelular) Sistema fosfáto: H2PO4- HPO-4 (intracelular) Sistema bicarbonato: CO2/H2CO3- HCO3- (extracelular) El sistema amortiguador del bicarbonato, compuesto por al ácido carbónico y el bicarbonato de sodio, es el más importante en la sangre y el más rápido en actuar; no obstante, no elimina el exceso de hidrogeniones del cuerpo, únicamente los neutraliza temporalmente mientras actúan sistemas que corregirán de manera definitiva el trastorno. El sistema nervioso central y los pulmones actúan coordinadamente para modificar la ventilación por minuto y de esta manera modificar la concentración de dióxido de carbono (CO2). El riñón es un órgano de importancia cardinal al ser el responsable de eliminar el exceso de hidrogeniones, reabsorber el bicarbonato filtrado y producir bicarbonato nuevo. La fórmula de Henderson – Hasselbach es la más utilizada dentro de la enseñanza médica tradicional para el cálculo del pH a partir de sus dos determinantes más importantes, la concentración de bicarbonato (HCO3) y la concentración de dióxido de carbono arterial (pCO2). UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 49  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I 2.2 Cálculo de pH Ecuación de Sorensen: la escala de pH fue sugerida por Sorensen en 1909, con la finalidad de evitar el uso de exponenciales y potencias negativas al expresar la concentración del ion hidrógeno en soluciones ácidas muy diluidas (donde [H+] < 1 M). De tal modo que, formuló la versión moderna del concepto de pH en 1924 utilizando las definiciones y medidas en términos de celdas electroquímicas. El pH se define como: pH = - Log  H+  pOH = - Log  OH-  Recuerde: pH + pOH- = 14 Ecuación de Henderson – Hasselbach: el manejo matemático del amortiguamiento de pH se halla determinado por la fórmula de Henderson-Halsselbalch. El pK es un valor constante para cada sistema amortiguador, ya que corresponde al logaritmo negativo de la constante de equilibrio del sistema que se considere. La importancia del valor del pK es que constituye el centro del intervalo de pH donde se observa la mayor capacidad de amortiguamiento. Por ejemplo, si el pK de un sistema amortiguador es 6.8, el sistema actuará con máxima eficacia a un pH de 6.8 y el intervalo de amortiguamiento satisfactorio sería 6.8 ± 1.0. A−  BH+  pH = 𝑝𝐾𝑎 + 𝑙𝑜𝑔 pOH = 𝑝𝐾𝑏 + 𝑙𝑜𝑔 HA B Ecuación de Henderson y Hasselbach y su relación con el sistema bicarbonato UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 50  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I III. MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS 3.1 MATERIALES ✓ 2 bureta de 25 ml ✓ 1 agitador magnético ✓ 4 vaso de precipitado de 250 ml ✓ NaH2P04 0.1 M ✓ 2 pinza para bureta ✓ NaOH 0.1 M ✓ 4 vaso de precipitado de 50 ml ✓ Solución reguladora a pH de 7.0 ✓ 20 tubos de ensaye de 13X100 mm ✓ Papel milimetrado ✓ 1 potenciómetro 3.2 PROCEDIMIENTOS Experimento N°1: Titulación del fosfáto monosódico 1. En un vaso de precipitados de 250 ml, colocar 50 ml de la solución de monofosfato de sodio 0.1 M, introducir los electrodos del potenciómetro y medir su pH. 2. En agitación constante agregar lentamente solución de hidróxido de sodio 0.1 M mediante una bureta y anotar los cambios de pH después de la adición de cada 2 ml. Añadir hidróxido de sodio hasta que el pH llegue a 11. 3. Con los resultados obtenidos elaborar una gráfica en papel milimétrico (pH vs ml de hidróxido de sodio 0.1 M gastados) y observar si hay una zona de amortiguación e indicarla en su gráfica. IV. RESULTADOS Grafique procedimiento UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 51  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I V. DISCUSIONES VI. CONCLUSIONES VII. CUESTIONARIO 1. Defina qué es un amortiguador y cómo funciona. 2. Diga cómo se encuentran las concentraciones de los componentes de un amortiguador cuando se encuentran a un pH que es igual a su pK. 3. Escribe la reacción que se lleva a cabo entre el monofosfato de sodio y el hidróxido de sodio. 4. Explica por qué se forma una solución amortiguadora durante la titulación del monofosfato de sodio con el hidróxido de sodio. 5. Mencione los principales amortiguadores del organismo humano, de que compuestos está constituido cada uno. VIII. EJERCICIOS PROPUESTOS 1. Si preparamos un litro de solución agregando 0.9 moles de ácido carbónico y 0.7 moles de bicarbonato de sodio. ¿Cuál será el pH de esta solución? ¿Cómo prepararíamos una solución a pH 5.9 usando la misma cantidad de ácido carbónico? (pKa del ácido carbónico es 6.35) 2. Calcule los moles de acetato de sodio que hay que añadir a un litro de una solución 0.2 M de ácido acético para hacer una disolución reguladora de pH=5. (pKa=4.76) 3. ¿Cuál es el pH de una solución amortiguadora ácido acético/acetato de sodio que tiene una concentración de ácido acético 0.1 M y de acetato de sodio 0.08 M? El Ka para ácido acético es 1.8x10-5 4. Se desea preparar un litro de buffer fosfáto a pH 7.3, partiendo de dos soluciones: una de fosfáto monobásico de sodio 0.2 M y una solución de fosfáto dibásico de sodio 0.1 M. Calcular las cantidades de la solución que deben mezclarse para preparar esta solución amortiguadora. (pKa del fosfáto monobásico de sodio=7.2) UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 52  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I PRÁCTICA N°5: ESPECTROFOTOMETRÍA I. COMPETENCIAS ✓ Comprender y relacionar los conceptos de fotocolorimetría y curva de calibración. ✓ Entrenarse experimentalmente en el funcionamiento del fotocolorímetro. ✓ Establecer el espectro de absorción para una solución muestra. II. INTRODUCCIÓN La espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizada para la detección específica de moléculas. Se basa en medir cuánta luz absorbe una sustancia química, midiendo la intensidad de la luz cuando un haz luminoso pasa a través de la solución muestra. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc.). Los fundamentos físico-químicos de la espectrofotometría son relativamente sencillos. Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía interna (esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos, como la fotosíntesis en plantas y bacterias); cuando se afirma que una sustancia química absorbe luz de longitud de onda λ, significa que las moléculas de esa sustancia absorben fotones de esa longitud de onda. La espectrofotometría, de manera resumida, es un método de análisis cuantitativo que se basa en la capacidad de las sustancias de absorber luz, a una longitud de onda () determinada, en proporción directa a la cantidad de materia presente. Los espectros de absorción se miden mediante un instrumento denominado espectrómetro que utiliza como fuente la luz visible del espectro ultravioleta (UV), estos instrumentos constan de una fuente de luz “blanca” caracterizada por un espectro de emisión continuo en un intervalo amplio de longitudes de onda (325 nm-900 nm) y de un monocromador que actúa como filtro óptico transmitiendo un haz de luz de longitud de onda fija λ e intensidad I0. Este haz de luz penetra en la cubeta de análisis donde se encuentra la muestra, un detector sensible a la luz mide la intensidad del haz a la salida If. La intensidad del haz de luz se va atenuando a medida UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 53  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I que atraviesa la cubeta debido a la absorción de las moléculas de la muestra. El ritmo de absorción depende de la intensidad inicial de luz y de la concentración de moléculas. Las técnicas espectroscópicas se basan en la medida de los efectos de interacción de las radiaciones electromagnéticas con la materia. Al incidir un haz de luz de determinada longitud () de onda sobre la muestra, una parte de esta luz es absorbida y la otra parte es refleja o transmitida (L), lo que puede representarse de la siguiente manera: Luz que atraviesa la cubeta If I0 I0: Intensidad de luz que incide en la muestra  If: Intensidad de luz que se transmite La cantidad de luz absorbida por la muestra es directamente proporcional a la concentración de la muestra, es decir, a mayor concentración mayor absorción y menor transmisión. En una determinada longitud de onda (), la luz incide sobre una cubeta cuyas medidas de diámetro y espesor deben estar validadas. Por lo tanto, se tiene: UNIVERSIDAD MARIA AUXILIADORA - UMA 54  ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BOQUÍMICA Guía de Práctica de Bioquímica I donde: A = absorbancia A= .b.c  = coeficiente de extinción molar b = diámetro de la cubeta (1cm) c = concentración de la muestra En esta cuantificación de sustancias un parámetro importante son las cubetas o celdas, que deben ser tan claras o transparentes como sea posible, sin impurezas que puedan afectar a una lectura espectroscópica. El coeficiente molar de extinción ( ) es un parámetro que define cuán fuertemente una sustancia absorbe la luz a una longitud de onda dada por unidad de concentración molar. Cada solución o muestra presenta este parámetro de manera, que se considera, fija. Los espectrofotómetros actuales miden la absorbancia de manera directa, pero si se tiene uno que da únicamente lecturas de porcentaje de tramitancia (%T), se