Multiplex PCR for DNA Fingerprinting PDF

Asst. Prof. Dr. Krung Phiwpan 1 ผลการเรียนรู้ทคี่ าดหวัง : เมื่อสิน้ สุดการเรียนรู้หวั ข้อวิชานี้ นิสิตสามารถ 1.ทราบถึงความหมาย และประโยชน์ของ Multiplex PCR 2.ทราบวิธีและขัน้ ตอนในการตรวจ ลายพิมพ์ดีเอ็นเอด้ วยวิธี Multiplex PCR 3.เข้ าใจการแปลผลลายพิมพ์ดเี...

Asst. Prof. Dr. Krung Phiwpan 1 ผลการเรียนรู้ทคี่ าดหวัง : เมื่อสิน้ สุดการเรียนรู้หวั ข้อวิชานี้ นิสิตสามารถ 1.ทราบถึงความหมาย และประโยชน์ของ Multiplex PCR 2.ทราบวิธีและขัน้ ตอนในการตรวจ ลายพิมพ์ดีเอ็นเอด้ วยวิธี Multiplex PCR 3.เข้ าใจการแปลผลลายพิมพ์ดเี อ็นเอ 2  PCR PCR products Conventional PCR F R PCR products Duplex PCR F1 F2 R1 R2 3 Multiplex PCR ใน 1 หลอดปฏิกิรยิ าตรวจมากกว่า 3 ยีนขึน้ ไป แต่ละขนาดของ PCR products ต้องแตกต่างกันชัดเจน ตรวจวิเคราะห์ผลด้วย gel electrophoresis F1 F2 F3 R1 R2 R3 DNA marker Sample - 3 2 1 4 + Multiplex PCR ใน 1 หลอดปฏิกิรยิ าตรวจมากกว่า 3 ยีนขึน้ ไป ขนาดของ PCR products สามารถเท่ากันได้หรือใกล้เคียงกัน แต่ตอ้ งติดฉลากด้วยสีท่ีตา่ งกัน ตรวจวิเคราะห์ผลด้วย capillary gel electrophoresis (DNA sequencer) F1 F2 F3 R1 R2 R3 5 DNA fingerprinting 6  Human Genome แต่ละบุคคลมีดีเอ็นเอเหมือนกัน 99.9% ต่างกัน 0.1 % 7  Repetitive DNA(ดีเอ็นเอที่เป็นเบสซ้ำ) Tandem repeats (เบสซ้ำต่อเนื่อง) Satellite (เบสซ้ำสัน้ ขนำด 1-6 เบสหรือเบสซ้ำยำว > 100 เบส โดยทีจ่ ำนวนซำ้ แต่ละตำแหน่งตัง้ แต่ 103-107 ครัง้ ) Minisatellite (เบสซ้ำขนำด 9-100 เบส ที่มจี ้ำนวนซ้ำตังแต่ 10 และไม่เกิน 1000 ครัง) หรือเรียกว่ำ Variable number of tandem repeats (VNTR) Microsatellite (เบสซ้ำขนำด 1-6 เบส โดยที่มี จ้ำนวนซ้ำแต่ละต้ำแหน่งไม่เกิน 100 ครัง) บำงครัง อำจเรียกว่ำ Simple sequence repeats (SSR) หรือ Short tandem repeats (STR) 8 ตาแหน่งทีใ่ ช้ ในการตรวจลายพิมพ์ดเี อ็นเอ 1. Minisatellite :Variable number of tandem repeats (VNTR) : Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) ใครคือพ่อ? 1 = แม่ Sample RE Electrophoresis 2 = ลูก 3 = ผช 1 Hybridization Blotting 4 = ผช 2 2. Microsatellite : Short tandem repeats (STR) : Multiplex PCR 9 ขัน้ ตอนในการตรวจลายพิมพ์ดเี อ็นเอ Sample collection (Presumptive testing : การตรวจสอบตัวอย่างเบือ้ งต้ น) DNA extraction: การสกัดดีเอ็นเอ DNA fingerprinting : การตรวจลายพิมพ์ดีเอ็นเอ 10  ขัน้ ตอนในการตรวจลายพิมพ์ดเี อ็นเอ 1. Sample collection (Presumptive testing : การตรวจสอบตัวอย่างเบือ้ งต้ น) Biological Material 11  Presumptive testing โลหิต อสุจิ Flavin 12  Presumptive testing (เส้นขน) Cat Horse Pig Human ภายใน ภายนอก Deer Dog Rabbit Human Rat 13 Presentation developed by T. Trimpe 2006 http://sciencespot.net/  2. DNA Extraction Magnetic Based DNA Extraction 14  ตรวจวัดปริมาณ DNA ปริมาณ DNA ที่ได้ขึ้นอยู่กับชนิดของตัวอย่างโดยแต่ละเซลล์ที่มนี ิวเคลียส(2n)จะ มีดีเอ็นเอ 6 pg - เลือดสด 1 ml จะมีเซลล์ที่มนี วิ เคลียส(2n) 5000-10000เซลล์ - น้้าอสุจิ 1 ml จะเซลล์ที่มีนวิ เคลียส(n) 66ล้านเซลล์ - Epithelial cell พบได้น้อยในที่เกิดเหตุ I. Ethidium bromide staining II. Ultraviolet spectroscopy (260 nm) III. Real Time PCR (Taq-Man PCR) IV. Hybridization สามารถตรวจวัดได้ ถึง ng/µL V. Fluorescent spectroscopy นิยมใช้ ตรวจวัดในตัวอย่างทีค่ าดว่ามีดีเอ็นเอปริมาณน้ อย 15  3. DNA Fingerprinting 2. Multiplex PCR ส่วนที่เป็ นไมโตคอนเดรีย - พบมากกว่า 1,000 ชุด/เซลล์ - ได้รบั การถ่ายทอดจากแม่เท่านัน้ - ไม่มีความเป็ นเอกลักษณ์เฉพาะบุคคล STR XY ส่วนที่เป็ นนิวเคลียส - Autosomal STRs - 2 ชุด/เซลล์ - Y STRs - ได้รบั การถ่ายทอดจากพ่อและแม่ - X STRs - มีความเป็ นเอกลักษณ์เฉพาะบุคคล -Mitochondrial DNA ดีเอ็นเอในไมโทคอนเดรียสามารถใช้ พิสูจน์ บุคคลได้ ในกรณีทเี่ กิดเหตุมีน้อยมาก เช่น ตัวอย่างจากเศษผงกระดูก, คราบเลือด, 16,569 คูเ่ บส เส้ นผม, ตัวอย่างเน่าสลาย 16  3. DNA Fingerprint 2. Multiplex PCR STR STR loci in the Combined DNA Index System (CODIS) - Autosomal STRs เอกลักษณ์ในแต่ละคน - Y STRs เอกลักษณ์ฝ่ายบิดา - X STRs ความสัมพันธ์พ่อ-ลูกสาว, ย่า-หลานสาว -Mitochondrial DNA เอกลักษณ์ฝ่ายมารดา 17  Multiple Dye STRs Kit Multiplex PCR Reactions Thermocycler (PCR machine) 18 การแปลผลการตรวจ ลายพิมพ์ดีเอ็นเอด้วย วิธี Multiplex PCR 19 ผลตรวจสารพันธุกรรม(เพศชาย) 20 ผลตรวจสารพันธุกรรมเพศหญิง 21 ผลตรวจสารพันธุกรรม(มากกว่าหนึ่ งคน) 22 ผลตรวจสารพันธุกรรม(บุคคลจานวนมาก) 23 ผลตรวจสารพันธุกรรม(เสือ่ มสภาพ) 24 ผลตรวจสารพันธุกรรม(ปริมาณน้อยมาก) 25 ANY QUESTION? 26