Molekulinė Biologija Pastarųjų Metų Replikacijos 2024 PDF

Molekulinė biologija. 2024.12.19 Replikacija 1. DNR biosintezės (replikacijos) principai ir enzimologija ​ Pagrindiniai principai: ○​ Replikacija yra pusiau konservatyvi, t.y., nauja DNR sudaryta iš vienos senos ir vienos naujai...

Molekulinė biologija. 2024.12.19 Replikacija 1. DNR biosintezės (replikacijos) principai ir enzimologija ​ Pagrindiniai principai: ○​ Replikacija yra pusiau konservatyvi, t.y., nauja DNR sudaryta iš vienos senos ir vienos naujai susintetintos grandinės. ○​ Procesas vyksta trimis etapais: inicijacija, elongacija ir terminacija. ○​ Replikacija prasideda nuo specifinių sričių, vadinamų "origins" arba ori. ​ Enzimologija: ○​ Replikacijos metu dalyvauja įvairūs fermentai: DNR polimerazės, helikazės, praimazės, topoizomerazės, SSB baltymai ir DNR ligazės. ○​ Šie fermentai užtikrina grandinių atskyrimą, stabilizavimą, kopijavimą ir galutinių grandinių uždarymą. 2. DNR replikacijos prokariotuose ir eukariotuose panašumai bei skirtumai ​ Panašumai: ○​ Abiem atvejais replikacija vyksta pusiau konservatyviai ir dviem kryptimis nuo pradžios taško. ○​ Dalyvauja replisomos kompleksai, kurie atlieka grandinių sintezę. ​ Skirtumai: ○​ Prokariotai: ​ Turi vieną ori sritį (pvz., E. coli oriC). ​ Replikacijos greitis apie 1000 nukleotidų per sekundę. ​ Dalyvauja mažiau baltymų ir fermentų. ○​ Eukariotai: ​ Kiekviena chromosoma turi daugelį ori sričių. ​ Replikacija koordinuojama per ląstelės ciklo S fazę. ​ Dalyvauja sudėtingi kompleksai, įskaitant žiedo baltymus (PCNA). E. coli DNR replikacijos fermentai. Replikacinės šakutės fermentai. Bakterijų (E. coli) DNR polimerazės: bendrosios savybės, struktūra ir įvairovė. Savybė Prokariotai Eukariotai Chromosomos Viena žiedinė chromosoma Daugelis linijinių chromosomų Pradžios taškai (ori) Vienas (pvz., E. coli oriC) Daugelis (žmoguje ~60 000 ori) Replikacijos greitis ~1000 nukleotidų/s ~50 nukleotidų/s Replisomų skaičius Viena replisoma Daugelis replisomų per chromosomą Reguliacija Replikacija prasideda greitai Skirtinguose ori replikacija ir viskas vyksta vienu metu vyksta skirtingu metu Baltymai ir fermentai Paprastesni kompleksai Sudėtingi kompleksai (pvz., PCNA) 3. E. coli DNR replikacijos fermentai ir replikacinės šakutės komponentai DNR polimerazės: ○​ Pol I: dalyvauja Okazaki fragmentų užbaigime ir klaidų taisyme (5'→3' egzonukleazinis aktyvumas). ○​ Pol II: dalyvauja DNR reparacijoje, aktyvinami UV pažeidimų metu. ○​ Pol III: pagrindinis replikacijos fermentas, sudaro holofermentą su slystančiuoju žiedu (β subvienetas). Pagrindinė replikacinė polimerazė. Sudaro holofermentą, kurį sudaro: Šerdinis fermentas (α, ε, θ): Polimerizacija ir klaidų taisymas. Slystantysis žiedas (β subvienetas): Užtikrina procesyvumą. Žiedo užkėlimo kompleksas (γ-τ): Įjungia žiedą ant DNR. Replikacinės šakutės fermentai: ○​ Helikazės (DnaB): išvynioja DNR. ○​ Praimazės (DnaG): sintetina trumpus RNR pradmenis. ○​ SSB baltymai: stabilizuoja viengrandę DNR ir užtikrina procesų koordinaciją. ○​ Topoizomerazės: pašalina torsinę įtampą išvyniojant DNR. Bakterijų (E. coli) DNR polimerazės: bendrosios savybės, struktūra ir įvairovė. Funkciniai tipai: ​ E. coli turi penkias skirtingas DNR polimerazes (Pol I, Pol II, Pol III, Pol IV, Pol V), kurios atlieka skirtingas funkcijas replikacijoje, reparacijoje ar mutagenezėje. Cheminė veikla:  ​ Visos nuo matricos priklausomos DNR polimerazės katalizuoja DNR sintezę, jungdamos dNTP (deoksiribonukleozido trifosfatus) prie sintetinamos DNR grandinės laisvos 3′-OH grupės. Sintezės metu susidaro fosfoesteriniai ryšiai. Reikalingos sąlygos veiklai: ​ DNR matrica ir pradmuo su 3'-OH grupe. ​ dNTP substratai (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). ​ Kofaktoriai (pvz., Mg²⁺ jonai). Tikslumas: ​ Kai kurios polimerazės turi 3'→5' egzonukleazinį aktyvumą, leidžiantį šalinti neteisingai prijungtus nukleotidus (klaidų dažnis apie 1 klaida 10⁶ nukleotidų). Struktūra 1.​ Pagrindiniai struktūriniai domenai: ○​ Polimerazės struktūra primena „pusiau atgniaužtą dešinį delną“: ​ Delno domenas: turintis aktyvųjį centrą, kur vyksta katalizinė reakcija. ​ Pirštų domenas: atlieka sąveiką su matrica ir nukleotidais. ​ Nykščio domenas: stabilizuoja DNR duplekso sąveiką. 2.​ Egzonukleazinis aktyvumo centras: ○​ Kai kurios polimerazės turi papildomą egzonukleazės aktyvumą, užtikrinantį klaidų taisymą. 3.​ Dydžių įvairovė: ○​ DNR polimerazių molekulinė masė svyruoja: ​ Mažiausios, kaip Pol IV (~40 kDa), veikia reparacijoje. ​ Didžiausios, kaip Pol III holofermentas (~900 kDa), dalyvauja replikacijoje. Įvairovė 1. DNR Pol I ​ Funkcijos: ○​ Pašalina RNR pradmenis (5'→3' egzonukleazinis aktyvumas). ○​ Užpildo tarpus tarp Okazaki fragmentų. ○​ Dalyvauja reparacijoje. ​ Struktūra: ○​ Viena polipeptidinė grandinė (928 aminorūgštys, ~109 kDa). ○​ Sudėtiniai domenai: ​ Didysis fragmentas (Klenovo fragmentas): Turi 5'→3' polimerazinį ir 3'→5' egzonukleazinį aktyvumą. ​ Mažasis fragmentas: Turi 5'→3' egzonukleazinį aktyvumą. 2. DNR Pol II ​ Funkcijos: ○​ Dalyvauja DNR reparacijoje. ○​ Aktyvinama SOS atsako metu, atsiradus DNR pažeidimams.  ​ Savybės: ○​ 5'→3' polimerazinis ir 3'→5' egzonukleazinis aktyvumas. ○​ Tikslumas yra didelis (klaidų dažnis apie 1 klaida per 1 mln. nukleotidų). 3. DNR Pol III ​ Pagrindinis replikacinis fermentas: ○​ Atsakinga už chromosomos sintezę replikacijos metu. ​ Struktūra: ○​ Kompleksas sudarytas iš: ​ Šerdinio fermento: α (polimerazinis aktyvumas), ε (proofreading), θ (stimuliuoja ε aktyvumą). ​ Slystančiojo žiedo (β subvienetas): Užtikrina procesyvumą. ​ Žiedo užkėlimo komplekso (γ-τ subvienetai): Įjungia slystantį žiedą ant DNR. ​ Savybės: ○​ Aukštas procesyvumas (~1000 nukleotidų per sekundę). ○​ Turi didelį tikslumą dėl proofreading mechanizmo. 4. DNR Pol IV ir Pol V ​ Funkcijos: ○​ Dalyvauja DNR pažaidų perėjime (TLS – translesion synthesis). ○​ Veikia SOS atsako metu, kai kiti fermentai negali replikuoti pažeistos DNR. ​ Savybės: ○​ Polimerazės palieka daugiau klaidų (mutageninės). ○​ Pol IV dažnai sukelia mutacijas plazmidėse ar chromosomose, kai aktyviai dalyvauja DNR reparacijoje. 4. Replikacijos iniciacija E. coli bakterijose. Replikacijos ori sritys. Replikacija prasideda oriC srityje (245 bp), kurią sudaro: ○​ DnaA dėžutės: Penki pasikartojantys motyvai, prie kurių jungiasi DnaA baltymai. ○​ DUE elementas: AT-turtinga sritis, kur lengvai atsiskiria dvigrandė DNR. ○​ GATC metilinimo vietos: Hemimetilinimas kontroliuoja iniciacijos dažnį. Procesas: 1.​ DnaA baltymai su ATP jungiasi prie oriC ir destabilizuoja DNR dupleksą. 2.​ DnaC padeda prijungti helikazę (DnaB), kuri toliau išvynioja DNR. 3.​ Praimazės sintetina pradmenis. 4.​ Pol III holofermentas pradeda sintezę 5. Replikacijos terminacija bakterijose. ​ Vyksta ter regione, kuris yra priešingoje chromosomos pusėje nuo oriC. ​ Tus baltymas: Susijungia su ter sekomis ir sustabdo helikazės DnaB judėjimą. ​ Replikacijos kompleksas išardomas, o DNR molekulės atskiriamos topoizomerazių pagalba. 6. DNR replikacija eukariotuose. Eukariotų replikacinės šakutės komponentai ir jų funkcijos. Replikacijos šakutės komponentai: ​ MCM baltymai: Pagrindinė eukariotų helikazė (heksamerinis kompleksas MCM2-7). ​ DNR α polimerazė-praimazė: Sintetina mišrų pradmenį (RNR + trumpas DNR fragmentas). ​ PCNA (slystantysis žiedas): Užtikrina replikatyvinių polimerazių procesyvumą. ​ Pol δ: Vėluojančiosios grandinės sintezė. ​ Pol ε: Pirmaujančiosios grandinės sintezė. ​ RPA baltymai: Stabilizuoja viengrandę DNR ir užtikrina jos apsaugą. 7. Eukariotų DNR polimerazės. 1. Polimerazė α (alfa) ​ Lokalizacija: Branduolyje. ​ Pagrindinė funkcija: Inicijuoja DNR replikaciją, sintetindama pradmenis. ​ Ypatybės: ○​ Kompleksas su praimaze sintetina mišrų pradmenį (RNR ~7–14 nukleotidų + trumpas DNR fragmentas ~20 nukleotidų). ○​ Neturi 3'→5' egzonukleazinio proofreading aktyvumo, todėl yra mažo tikslumo. ​ Unikalumas: Pagrindinė fermentų funkcija – pradėti replikaciją, po kurios ji pakeičiama Pol δ arba Pol ε. 2. Polimerazė β (beta) ​ Lokalizacija: Branduolyje. ​ Pagrindinė funkcija: DNR reparacija, dalyvauja bazinio iškirpimo reparacijoje (BER). ​ Ypatybės: ○​ Užpildo nedidelius plyšius DNR, susidariusius reparacijos metu. ○​ Neturi proofreading mechanizmo, tačiau veikia tik trumpais DNR segmentais, todėl klaidų tikimybė yra ribota. ​ Unikalumas: Specializuota fermento funkcija – taisyti mažus pažeidimus. 3. Polimerazė γ (gama) ​ Lokalizacija: Mitochondrijose. ​ Pagrindinė funkcija: Replikuoja ir taiso mitochondrijų DNR (mtDNR). ​ Ypatybės: ○​ Turi 3'→5' egzonukleazinį proofreading aktyvumą, užtikrinantį aukštą tikslumą. ○​ Dviejų subvienetų fermentas: didysis subvienetas vykdo polimerazės ir egzonukleazės funkcijas, mažasis subvienetas užtikrina procesyvumą.  ​ Unikalumas: Vienintelis polimerazės tipas, atsakingas už mitochondrijų genomą. 4. Polimerazė δ (delta) ​ Lokalizacija: Branduolyje. ​ Pagrindinė funkcija: Atsakinga už vėluojančiosios grandinės sintezę replikacijos metu. ​ Ypatybės: ○​ Turi 3'→5' egzonukleazinį proofreading aktyvumą, kuris užtikrina didelį tikslumą. ○​ Sąveikauja su PCNA (slystančiu žiedu) ir žiedo užkėlimo kompleksu (RFC), kurie užtikrina procesyvumą. ​ Unikalumas: Dalyvauja ne tik replikacijoje, bet ir reparacijos procesuose. 5. Polimerazė ε (epsilon) ​ Lokalizacija: Branduolyje. ​ Pagrindinė funkcija: Pirmaujančiosios grandinės sintezė DNR replikacijos metu. Taip pat gali dalyvauti DNR reparacijoje (nors tai ne iki galo patvirtinta). ​ Ypatybės: ○​ Turi 3'→5' egzonukleazinį proofreading aktyvumą. ○​ Veikia kartu su PCNA, užtikrinančiu fermento stabilumą ir procesyvumą. ​ Unikalumas: Pagrindinis pirmaujančiosios grandinės replikacijos fermentas. 8. Replikacijos iniciacija eukariotuose. Iniciacija: ​ Prasideda ori srityse, kurių gausu (pvz., žmogaus genome ~60 000). ​ ORC kompleksas (origin recognition complex) atpažįsta ori sritį. Jis nustato kur vyks replikacijos iniciacija. ​ Pre-RC kompleksas (ORC, Cdc6, Cdt1, MCM2–7) susidaro G1 fazės metu. ​ Pereinant į S fazę, MCM2–7 aktyvinami ir pradedama replikacija. Terminacija: ​ Okazaki fragmentai užbaigiami FEN1 ir Dna2 pagalba, o galutinius fragmentus sujungia DNR ligazė. —------------------------------------------------------------------------------------------ Papildoma info: Ląstelėse DNR sintezė ir genetinės medžiagos paskirstymas turi būti tiksliai valdomi, nepriklausomai nuo to, ar ląstelė turi tik vieną chromosomą (bakterijose) ar DNR organizuota į daug chromosomų (eukariotuose). Pagrindiniai šio valdymo principai yra tokie: ​ genominė DNR turi būti kopijuojama vieną kartą per ląstelės ciklą; ​ DNR replikacija turi būti koordinuojama atsižvelgiant į ląstelių dalijimąsi; ​ ląstelių dalijimasis turi būti koordinuojamas atsižvelgiant į ląstelių augimą;  ​ DNR kopijos turi būti tiksliai paskirstomos palikuoniams. — Arthuras Kornbergas, Nobelio premijos laureatas ir kitas biochemikai išvedė replikacijos etapus Iniciacija. - Baltymai prisijungia prie DNR ir atveria dvigubą spiralę; - Paruošia DNR papildomam bazių suporavimui. Ilginimas. Elongacija. - Baltymai sujungia teisingas sekas nukleotidų sekas į vientisą naują DNR grandinę. Užbaigimas. Terminacija. - Baltymai atpalaiduoja replikacijos kompleksą. – Replikacijos iniciacijos metu DNR replikacijos iniciacijos sritį atpažįsta baltymų kompleksas. Komplekso baltymai užtikrina, kad prieš prasidedant DNR replikacijai abi DNR duplekso grandinės būtų laikinai atskiriamos ir stabilizuojamos. —- Replikacijos svarba ​ Replikacija yra gyvybiškai svarbus procesas, kuris užtikrina tikslią genetinės informacijos perdavimą iš vienos ląstelės kartos kitai. ​ Po inicijacijos replikacija tęsiasi be pertrūkių, kol visas genomas padvigubėja. ​ Proceso tikslumas užtikrinamas specializuotais fermentais ir mechanizmais (pvz., proofreading). —---- Replikacijai reikalingi fermentai ir baltymai ​ DNR polimerazės: Atsakingos už naujų DNR grandinių sintezę, prijungiant nukleotidus prie esamos DNR matricos. ​ Praimazės: Sintetina trumpus RNR pradmenis, reikalingus DNR polimerazės veikimui pradėti. ​ Helikazės: Atvynioja dvigrandę DNR, kad būtų galima sintezuoti naują grandinę. ​ Topoizomerazės: Pašalina torsinę įtampą, susidarančią dėl DNR atvyniojimo. ​ DNR jungiantys baltymai (SSB): Stabilizuoja viengrandę DNR, apsaugodami nuo pervyniojimo ar degradacijos. ​ DNR ligazės: Sujungia Okazaki fragmentus vėluojančiojoje grandinėje, suformuodamos vientisą DNR molekulę. ​ Redagavimo fermentai: Atlieka klaidų taisymą, užtikrinant replikacijos tikslumą. Fermento delne yra DNR polimerazės aktyvusis centras. Pirštų domenas svarbus katalizei. Pirštai sąveikauja su DNR matrica. Nykščio domenas sąveikauja su DNR dupleksu. Delno domeno aminorūgštys sudaro vandenilinius ryšius su DNR mažuoju grioviu. Jeigu yra įjungiamas nekomplementarus nukleotidas: ryšių susidaro mažiau, reakcijos greitis sumažėja, o matrica yra nukreipiama į DNR polimerazės egzonukleazės aktyvųjį centrą. — Praimazės sąveika su DNR helikaze padidina praimazės aktyvumą > 1 000 kartų. DNR helikazė aktyvina praimazę, valdo, kur ir kiek pradmenų ji sintetina. E. coli praimazės sąveika su kitais replisomos komponentais – SSB baltymais – yra labai stipri. Manoma, kad praimazę nuo RNR pradmens pašalina γ-τ kompleksas. – Topoizomerazės DNR replikacijos metu, kai helikazės (pvz., DnaB) išvynioja dvigrandę DNR, priekinėse šakutės judėjimo vietose susidaro torsinė įtampa, sukurianti superspirales. I tipo topoizomerazės: Pašalina torsinę įtampą viengrandės DNR pjūvio būdu ir nereikalauja ATP energijos. II tipo topoizomerazės (pvz., DNR girazė): ​ Pjauna abi DNR grandines, keičia superspiralizacijos lygį ir reikalauja ATP. ​ Bakterijų girazė sugeba panaikinti teigiamas superspirales ir sukurti neigiamas superspirales, kurios yra būtinos efektyviai replikacijai. Katenanai: Po replikacijos susidaro katenuotos (susijungusios) DNR molekulės. II tipo topoizomerazės atlieka katenanų išpynimą, atskirdamos naujai susintetintas DNR molekules. Girazės vaidmuo: ​ Replikacijos metu E. coli replikacijos šakutės judėjimui būtina girazė, kuri pašalina susidariusias teigiamas superspirales. ​ Šis procesas užtikrina, kad replikacijos mašinerija galėtų efektyviai judėti išilgai DNR. —--- SSB ​ Didelis giminingumas viengrandinei DNR (ssDNA): ○​ SSB (Single-Strand Binding) baltymai jungiasi prie viengrandės DNR, užkirsdami kelią: ​ DNR duplekso ar antrinių struktūrų susidarymui. ​ Viengrandės DNR degradacijai, apsaugodami ją nuo nukleazių. ​ Sekos atrankos nebuvimas: ○​ SSB baltymai jungiasi prie ssDNA nepriklausomai nuo sekos sudėties. Replikacija: ​ Užtikrina pirmaujančiosios ir vėluojančiosios grandinių sintezės koordinaciją. ​ Nukreipia praimazę prie tinkamų vietų pradmenų sintezei ir neleidžia sintetinti pradmenų per anksti. ​ Stiprina DNR Pol III polimerazinį aktyvumą ir 3'→5' egzonukleazinį proofreading. Rekombinacija ir reparacija: ​ SSB baltymai yra būtini šiems procesams, stabilizuojant ssDNA tarpinių formų metu. SSB baltymai sąveikauja su įvairiais DNR procesų baltymais, įskaitant:  ​ DNR helikazė: Skatina jos aktyvumą, padedant išvynioti DNR. ​ Praimazė: Reguliuoja pradmenų sintezę. ​ DNR polimerazės: Tiesiogiai stimuliuoja jų veiklą. SSB baltymai aptinkami nuo virusų iki žmonių, o jų pagrindinė funkcija yra užtikrinti stabilų ir efektyvų DNR procesų vykdymą. —-- DNR ligazės: Okazaki fragmentai formuojasi vėluojančiojoje DNR grandinėje, replikacijos metu. Pradmenų pašalinimas: ​ Prokariotuose: atlieka DNR polimerazė I. ​ Eukariotuose: dalyvauja FEN1 endonukleazė ir DNR polimerazė δ. DNR ligazė: ​ Svarbi, nes sujungia DNR fragmentus, sudarydama fosfoesterinius ryšius. ​ Užtikrina vientisą DNR grandinę tiek DNR-DNR, tiek DNR-RNR jungtyse. —- E. coli replikacinės šakutės Trombono modelis: ​ Viena DNR Pol III šerdinė dalis sintetina pirmaujančiąją grandinę, kita – vėluojančiąją. ​ Holofermentas juda pirmaujančiosios grandinės sintezės kryptimi. Replikacijos inicijacija: ​ Prasideda specifinėse ori srityse, veikiančiose kaip cis elementai (replikatoriai). ​ Reikalingi transveiksniai (baltymai iniciatoriai), kurie jungiasi prie ori ir surenka replikacijos kompleksą. — Bakterijų ori sritis atlieka šias funkcijas: ​ ties ori sritimi vyksta DNR replikacijos iniciacija; ​ ori sritis valdo replikacijos iniciacijos dažnį; ​ ori sritis užtikrina chromosomų padalijimą (segregaciją) į dukterines ląsteles. —------ E. coli oriC sritis ir DnaA baltymo vaidmuo: ​ DnaA dėžutės (R1–R5): Penki nanomerai (5′TTATCCACA3′) yra DnaA baltymo atpažinimo ir prisijungimo vietos, svarbios replikacijos inicijavimui. ​ DUE elementas: Trys A/T turtingos sritys (13-tukai), kurios lengvai atsidaro ir yra DnaB helikazės prisijungimo vietos. ​ GATC sekos: OriC srityje yra 11 metilinimo vietų. Prieš replikaciją abi grandinės yra metilintos; po replikacijos – hemimetilintos, todėl iniciacija laikinai sustabdoma.  ​ OriC funkcija: Minimalus 245 bp oriC fragmentas užtikrina replikacijos pradžią ir dažnio reguliavimą, tačiau aplinkinės sekos taip pat turi įtakos procesui. OriC sritys yra labai konservatyvios. —--- E. coli replikacijos iniciacijos esmė: 1.​ DNR atpažinimas ir atskyrimas: Iniciacijos baltymas DnaA prisijungia prie oriC sekos (R1-R5 dėžutės), atskiria DNR grandines DUE srityje, įtraukiami papildomi baltymai. 2.​ Viengrandės DNR stabilizavimas: SSB baltymai apsaugo viengrandes DNR. 3.​ Helikazės aktyvinimas: Helikazė DnaB prijungiama su DnaC pagalba. Po to DnaC atsiskiria. 4.​ Praimerių sintezė: Praimazė DnaG sintetina pradmenis, kai helikazė atskiria ~65 bp DNR. 5.​ Replikacija: DNR III polimerazė sintetina naujas grandines, veikdama kartu su topoizomeraze ir kitais baltymais. Replikacijos terminacija: 1.​ Ter sritis sustabdo šakutę su baltymu Tus (kontra-helikazė), kuris blokuoja DnaB helikazės judėjimą. 2.​ Replikacija užbaigiama, šakutės kompleksas suyra. Valdymas: Replikaciją užtikrina replikonai, sudaryti iš replikatoriaus (DNR cis sekos, pvz., oriC) ir iniciatoriaus (trans baltymas, aktyvinantis replikaciją). Replikacija vyksta tik kartą per ciklą. —- Eukariotų DNR replikacijos baltymai: 1.​ RPA (Replication Protein A): ○​ Veikia kaip bakterijų SSB baltymai. ○​ Stabilizuoja viengrandinę DNR, neleidžia susidaryti antrinėms struktūroms ir saugo nuo nukleazių. ○​ Sąveikauja su DNR α polimeraze-praimaze ir stimuliuoja polimerazės aktyvumą. 2.​ PCNA (Sliding Clamp): ○​ Proliferuojančių ląstelių branduolio antigenas – svarbus replikacijoje, reparacijoje ir rekombinacijoje. ○​ Homotrimerinis baltymas, padidina DNR polimerazių procesyvumą (veikia kaip E. coli beta žiedas). ○​ Užkeliamas ant DNR RFC kompleksu, prisijungia prie DNR δ polimerazės. 3.​ RFC (Replication Factor C): ○​ Žiedo užkėlimo kompleksas, analogiškas E. coli γ-τ kompleksui. ○​ Užtikrina PCNA ir replikatyvinių polimerazių procesyvumą. 4.​ MCM (Minichromosome Maintenance): ○​ Eukariotų replikatyvinės helikazės, sudarytos iš MCM2–7 baltymų komplekso. ○​ Funkcionuoja ties ori sritimi, skatina DNR atskyrimą replikacijos metu. Pagrindiniai kompleksai eukariotų replikacijoje:​ RPA, PCNA, RFC, DNR polimerazės α, δ, ε, MCM helikazės, RNA pradmenys, eksonukleazė (MF1), DNR ligazė. —- Okazaki fragmentų brendimas eukariotuose: 1.​ Fragmentų sintezė: ○​ Vėluojančioje grandinėje susidaro trumpi, 100–200 nukleotidų Okazaki fragmentai su mišriais pradmenimis. 2.​ Pradmenų pašalinimas: ○​ Pol δ išstumia pradmens 5′ galą, suformuodama trumpą (1–2 nt) arba ilgesnę DNR uodegą (flap). ○​ Trumpą flap skelia FEN1 (flap endonukleazė 1). Ilgesnius flap pašalina Dna2, pasižymintis helikazės ir nukleazės aktyvumu. 3.​ Plyšių užpildymas: ○​ Pol δ sintezuoja DNR, užpildydama tarpą tarp fragmentų. 4.​ Fragmentų sujungimas: ○​ DNR ligazė sujungia fragmentus, suformuodama vientisą grandinę. FEN1 ir Dna2 vaidmuo: ​ FEN1: Pašalina trumpus flap ir leidžia tęsti sintezę. ​ Dna2: Skelia ilgesnius flap, sąveikauja su RPA ir kitais replikacijos baltymais. Reparacija 1.​ Mutacijų bendrieji bruožai Apibrėžimas: Mutacija – paveldima genetinio kodo (DNR ar RNR sekos) pokyčio forma. Savybės: ​ Gali būti neutralios, žalingos arba naudingos. ​ Suteikia genetinę įvairovę ir leidžia evoliucijai vykti. ​ Dauguma mutacijų yra neutralios arba žalingos, tačiau naudingosios išlieka per natūralią atranką. 2.​ Mutacijų tipai, greitis, dažnis, veiksniai Tipai: ​ Taškinės mutacijos: Vienos bazės pakeitimas (substitucija). ○​ Tylioji mutacija: Nekeičia baltymo sekos. ○​ Nonsense mutacija: Sukuria „stop“ kodoną. ○​ Missense mutacija: Pakeičia vieną aminorūgštį į kitą. ​ Rėmelio poslinkio mutacijos: Insercijos arba delecijos, kurios keičia skaitymo rėmelį. ​ Chromosominės mutacijos: Chromosomų dalies iškritimas, įsiterpimas, perstūmimas ar dubliavimas. Mutacijų greitis: ​ Nuo 10⁻⁶ iki 10⁻⁸ mutacijų vienam genui per ląstelės ciklą. ​ Skiriasi priklausomai nuo geno dydžio ir lokacijos („karštosios zonos“ – hot spots). Dažnis: ​ Mutacijų dažnis populiacijoje priklauso nuo mutacijų greičio ir natūralios atrankos. Veiksniai: ​ Endogeniniai: DNR replikacijos klaidos, spontaniniai nukleotidų pokyčiai (pvz., deamininimas, tautomeriniai virsmai). ​ Egzogeniniai: Radiacija (UV, rentgeno spinduliai), cheminiai mutagenai (pvz., bromuracilas), virusai. 3.​ DNR pažaidos Pavojai: Pažeista DNR gali sukelti mutacijas, ląstelių žūtį arba vėžį. Dažniausi pažeidimai: ​ Timino dimerai: UV spindulių sukeliami kovalentiniai ryšiai tarp timino bazių. ​ Deaminacija: Citozino virtimas uracilu. ​ DNR pertrūkiai: Viengrandžiai ar dvigrandžiai plyšimai. ​ Alkilinimas: DNR bazių modifikacijos, pvz., metilinimas. 4.​ DNR reparacija Bendri principai: ​ Fazės: 1.​ Pažeidimo atpažinimas. 2.​ Pažeistos vietos pašalinimas. 3.​ DNR sintezė ir atstatymas. ​ Pagrindinės sistemos: DNR neatitikimo, bazės iškirpimo, nukleotido iškirpimo, rekombinacijos ir SOS reparacija. 5. DNR neatitikimo reparacijos sistema Mechanizmas: ​ Pašalina replikacijos metu neteisingai poruotus nukleotidus. ​ Sistema atskiria naują DNR (hemimetilinimą) nuo senosios, identifikuodama klaidą. Baltymai (E. coli): ​ MutS: Atpažįsta neatitikimą. ​ MutL: Koordinuoja procesą. ​ MutH: Kerpa nemetilintą grandinę šalia neatitikimo. 6. Tiesiogine pazeistu baziu reparacija Fotoliazė: Naudoja šviesos energiją timino dimerams suardyti. O⁶-alkilguanino metiltransferazė: Pašalina alkil grupes nuo pažeistų bazių. 7. Bendra iškirpimo reparacijos sistema Sistema apima dvi pagrindines šakas: a) Bazės iškirpimo reparacija (BER) ​ Pašalina nedidelius pažeidimus, pvz., neteisingas ar modifikuotas bazes (uracilas, oksiduoti guaninai, alkilinti nukleotidai). ​ Procesas: 1.​ Pažeistos bazės atpažinimas: DNR glikozilazė pašalina pažeistą bazę, palikdama apurininį/apirimidininį (AP) saitą. 2.​ AP endonukleazė: Nukerpa DNR karkasą šalia AP saito. 3.​ DNR polimerazė: Užpildo susidariusį plyšį tinkamais nukleotidais. 4.​ DNR ligazė: Sujungia DNR grandinę, atkurdama vientisumą. b) Nukleotidų iškirpimo reparacija (NER) ​ Pašalina didesnius DNR pažeidimus, pvz., UV spindulių sukeltus timino dimerus, cheminiais mutagenais sukurtas aduktas. ​ Procesas: 1.​ Pažeidimo atpažinimas: Kompleksiniai baltymai suranda pažeistą vietą (pvz., DNR paviršiaus deformaciją). 2.​ DNR įkirpimas: Endonukleazės kerpa DNR abiejose pažeidimo pusėse (dažniausiai ~12–24 nukleotidai). 3.​ Pažeistos sekos pašalinimas: Pažeista grandinė pašalinama helikazių pagalba. 4.​ DNR sintezė: Polimerazės sintezuoja naują DNR fragmentą, naudodamos nepažeistą grandinę kaip šabloną. 5.​ Grandinės užbaigimas: DNR ligazė užtikrina pilną grandinės uždarymą. Prokariotų ir eukariotų skirtumai Prokariotuose (E. coli) ​ Dalina Uvr baltymai: ○​ UvrA/B: Atpažįsta pažeidimą ir suriša jį. ○​ UvrC: Kerpa pažeistą DNR abiejose pusėse (~12–13 nukleotidų fragmentas). ○​ UvrD: Helikazė, pašalinanti iškirptą DNR fragmentą. ○​ DNR Pol I ir DNR ligazė užpildo ir sujungia naują DNR. Eukariotuose ​ Dalina daugiau baltymų, įskaitant: ○​ XPC/XPE: Atpažįsta pažeidimus globalioje genomo DNR. ○​ CSA/CSB: Nukreipia reparacijos kompleksą į aktyviai transkribuojamus genus. ○​ XPA: Koordinuoja reparacijos procesą. ○​ XPB/XPD: Helikazės, atskiriančios DNR grandines. ○​ Pažeidimai pašalinami kaip ~24–32 nukleotidų fragmentai. Pažeidimų tipai, kuriuos šalina bendra iškirpimo reparacijos sistema ​ UV sukelti pažeidimai: Timino dimerai. ​ Cheminiai aduktai: Poliaromatiniai junginiai ar kancerogenai, kovalentiškai prisijungę prie DNR. ​ DNR kryžminiai ryšiai: Kovalentiniai ryšiai tarp grandinių. ​ Oksidaciniai pažeidimai: Modifikuotos bazės ar DNR karkaso deformacijos. Reikšmė organizmui ​ Užtikrina DNR stabilumą ir apsaugą nuo kancerogenezės. ​ Defektai NER sistemoje: Susiję su genetinėmis ligomis, pvz.: ○​ Xeroderma pigmentosum (XP): Sumažėjęs gebėjimas taisyti UV sukeltus pažeidimus. ○​ Cockayne sindromas: Defektai aktyviai transkribuojamos DNR reparacijoje. 8. Bazių iškirpimo reparacijos sistema Mechanizmas: ​ Pažeistas bazes pašalina DNR glikozilazės, palikdamos apurininį arba apirimidininį (AP) saitus. ​ AP endonukleazė nukerpa DNR karkasą, o DNR polimerazė ir ligazė užpildo spragą. Substratai: Uracilas, oksiduotos arba alkilintos bazės. 9. Nukleotidų iškirpimo reparacijos sistema Mechanizmas: ​ Pašalina didesnius DNR pažeidimus, pvz., timino dimerus. ​ Prokariotuose (E. coli): Dalina UvrA, UvrB, UvrC ir UvrD baltymai. ​ Eukariotuose: Į procesą įtraukiamas daug baltymų, įskaitant XPA, XPB ir XPC. 10. Rekombinacijos reparacija Tikslas: Atstato plyšimus, kurie stabdo replikaciją. Mechanizmas: ​ Dalyvauja RecA baltymas (E. coli), kuris naudoja nepažeistą homologinę grandinę kaip šabloną pažeidimui pataisyti. 11. Aktyviai transkribuojamos DNR reparacija ​ Mechanizmas: Aktyviai transkribuojami genai reparuojami greičiau nei kiti. ​ E. coli: TRCF (transkripcijos-reparacijos jungiklis) nukreipia reparacijos fermentus į aktyvius genus. 12. Pažaidas apeinančios DNR polimerazės Funkcija: TLS (translesion synthesis) polimerazės replikuoja per pažeistas DNR sritis. Pavyzdžiai: Pol η, Pol ι ir Pol κ (eukariotuose). 13. Fotoreaktyvacija Mechanizmas: Pašalina UV sukeltus timino dimerus, naudodama fermentą fotoliazę ir šviesos energiją. Pavyzdys: Vyksta daugelyje organizmų, tačiau ne visuose žinduoliuose 14. SOS reparacinė sistema Funkcija: Aktyvuojama masinių DNR pažeidimų metu. Procesas: ​ RecA baltymas aktyvina SOS atsaką, suardydamas LexA represorių. ​ Aktyvuojamos pažeidas apeinančios polimerazės ir reparacijos fermentai. 15. Reparacija eukariotuose Specifika: ​ Daug sudėtingesnė nei prokariotuose dėl linijinių chromosomų ir chromatino organizacijos. ​ Aktyvios sistemos: BER, NER, homologinė rekombinacija (HR), netikslus galo sujungimas (NHEJ). 16. Dvigrandės DNR reparacija eukariotuose Homologinė rekombinacija (HR): ​ Naudoja homologinę seką kaip šabloną. ​ Tikslus procesas, vyksta S ir G2 fazėse. Netikslus galo sujungimas (NHEJ): ​ Greitas, tačiau klaidų tikimybė didesnė. ​ Apima Ku baltymus ir DNR priklausomą baltymų kinazę (DNA-PK). —----- Papildoma info: DNR replikacija - tai procesas, kurio metu kopijuojama genetinė medžiaga. Originalios DNR grandinės yra naudojamos kaip matricos naujoms grandinėms sintetinti. DNR dvigubėjimo metu naujai sintetinama DNR grandinė yra komplementari senajai Replikacija vyksta labai greitai, labai tiksliai ir tik tam tikru ląstelės gyvenimo metu. — Mutacija: Tai negrįžtamas genetinės medžiagos pokytis. Daugelis mutacijų yra žalingos. Tačiau žalingos mutacijos būna pervertinamos, nes yra labiau pastebimos. Labai dažnai neigiamas mutacijų poveikis yra minimalus, o dauguma mutacijų turi nedidelį arba neturi jokio reikšmingo poveikio organizmo išlikimui -- jos yra neutralios. Be to mutacijos gali būti naudingos organizmo išlikimui ir vystymuisi. Naudingų mutacijų kaupimasis leidžia organizmui reaguoti į besikeičiančias aplinkos sąlygas, evoliucionuoti. Mutacijų paveldimumas: ​ Vienaląsčiai organizmai: Mutacijos perduodamos per kartas ląstelių dalijimosi metu. ​ Daugialąsčiai organizmai: Paveldimos tik lytinėse ląstelėse atsiradusios mutacijos, perduodamos lytinio dauginimosi metu. ​ Somatinės mutacijos: Perduodamos tik tos pačios ląstelės klonams, gali lemti vėžinių ląstelių atsiradimą. Genų kopijų svarba: ​ Daugialąsčiai organizmai turi dvi kiekvieno geno kopijas. Jei viena kopija pažeista, kita gali kompensuoti. ​ Haploidiniai organizmai (viena geno kopija) būtų jautresni letalioms mutacijoms. Mutacijų dažnis: ​ Vidutiniškai žmogus turi 75–100 potencialiai žalingų alelių, dažniausiai tik vienoje geno kopijoje. Mutacijų rūšys ir ypatumai: ​ Taškinės mutacijos: Vieno nukleotido pakeitimas, įterpimas ar pašalinimas. ​ Mutavimo greitis: Naujos mutacijos tikimybė gene, priklauso nuo aplinkos veiksnių (pvz., mutagenų) ir geno savybių (pvz., dydžio ar "karštųjų taškų" jautrumo). Mutacijų dažnis: ​ Apskaičiuojamas padalijus mutavusių genų skaičių iš visų genų populiacijoje. ​ Pvz., jei iš milijono bakterijų nustatyta 10 mutantų, dažnis yra 10⁻⁵. ​ Priklauso nuo mutavimo greičio, mutacijų pasireiškimo laiko ir jų perdavimo kitoms kartoms tikimybės. Mutacijų tipai: ​ Indukuotos: Sukeltos aplinkos veiksnių: ○​ Cheminės medžiagos (pvz., toksiškos medžiagos, azotinių bazių analogai). ○​ Radiacija, temperatūra. ​ Spontaninės: Atsiranda dėl ląstelinių procesų klaidų (pvz., DNR replikacijos klaidos). Cheminių mutagenų veikimas: ​ Toksiškos cheminės medžiagos reaguoja su DNR ir keičia bazių struktūrą. ​ Azotinių bazių analogai (pvz., bromuracilas) pakeičia bazių poras, sukelia neteisingą replikaciją ir mutacijas. ○​ Pvz., A-T pora gali virsti G-C dėl bromuracilo poveikio po kelių replikacijos ciklų. —-- Spinduliuotės sukeliamos mutacijos: ​ Aukšto dažnio elektromagnetinė spinduliuotė (UV, rentgeno, gama spinduliai) tiesiogiai pažeidžia DNR. ​ UV spinduliai: ○​ Sukuria timino dimerus, kurie trikdo DNR struktūrą. ○​ DNR polimerazė gali praleisti dimerus, tačiau lieka viengrandės sritys, kurias reikia taisyti. ​ Ozono sluoksnis sugeria UV spindulius, bet dėl ozono skylių daugiau UV pasiekia Žemę, didindami odos vėžio atvejų skaičių. Spontaninės mutacijos: ​ Atsiranda dėl DNR replikacijos klaidų (pvz., E. coli klaidos: 1 bazė iš 10 mln.). ​ Sukeliamos: ○​ Tautomerinių virsmų: Bazių cheminiai pokyčiai dėl vandenilio atomų persitvarkymo. ○​ Deamininimo: Bazės hidrolizės metu (pvz., citozino virtimas uracilu arba timinu). —- DNR pažaidų poveikis: ​ Neištaisytos pažaidos sutrikdo DNR sintezę, sukelia ląstelės žūtį arba mutacijas. ​ Ląstelės neleidžia dalytis tol, kol pažaidos neištaisyta, o nepavykus – inicijuojama ląstelės žūtis. ​ Pirmiausia taisomos aktyviai transkribuojamų genų pažaidos. DNR reparacijos mechanizmai: ​ Ląstelės turi sistemas, kurios atpažįsta DNR neatitikimus (bendros ar specifinės sistemos). ​ Reparacijos procesas panašus visuose organizmuose, įskaitant E. coli. ​ Sutrikusi DNR reparacija žmonėms didina mutacijų dažnį, vėžio ir paveldimų ligų riziką. Specifinė reparacija – MutH sistema: ​ Atpažįsta neatitikimus po DNR replikacijos: ○​ Skiria tėvinę (metilintą) grandinę nuo naujos (nemetilintos). ○​ MutS identifikuoja neatitikimą, MutL ir MutH padeda nukirpti nemetilintą grandinę. ○​ DNR polimerazė užpildo spragą, atkurdama teisingą seką. —---------- Tiesioginė reparacija: ​ Specialūs fermentai pašalina DNR kovalentines modifikacijas: ○​ Fotoliazė reparuoja UV suformuotus timino dimerus, atkurdama normalią DNR struktūrą.  ○​ O6-alkilguanino alkiltransferazė perneša metilo ar etilo grupę nuo pažeistos bazės ant savo cisteino, tačiau pati tampa neaktyvi. Nukleotidų iškirpimo reparacija (NER): ​ Atpažįsta DNR grandinės struktūros pokyčius, taiso UV žalą (pvz., timino dimerus) ir chemines pažaidas. ​ Dalyvauja baltymai UvrA, UvrB, UvrC, UvrD: ○​ UvrAB kompleksas ieško pažeidimų ir atpažįsta dimero deformaciją. ○​ UvrC kerpa pažeistą grandinę prieš ir už dimero, o UvrD helikazė pašalina pažeistą segmentą. ○​ DNR polimerazė I sintetina naują DNR grandinę, užpildydama spragą. NER ypatybės: ​ Plačiai paplitusi sistema prokariotuose ir eukariotuose. ​ Efektyviai taiso daugelį pažaidų tipų, įskaitant UV sukeltus timino dimerus ir chemiškai modifikuotas bazes. —-------- 1. Rekombinacijos reparacija: ​ Procesas: Ši sistema užpildo replikacijos spragas, susidarančias dėl pažeidimų, pavyzdžiui, timino dimerų. ​ Mechanizmas: ○​ Timino dimerai sukelia replikacijos trūkius. ○​ RecA baltymas perkelia trūkį į nepažeistą DNR molekulę, kurioje yra teisinga komplementari seka. ○​ DNR polimerazė užpildo trūkus, tačiau pažeistas timino dimeras lieka nepakitęs. ​ Esmė: Rekombinacinė reparacija atstato replikacijos procesą, nors pažeidimai nepašalinami tiesiogiai. 2. Aktyviai transkribuojamos DNR reparacija: ​ Procesas: Efektyviau taisomi aktyviai transkribuojami genai, nes jie svarbesni ląstelės išgyvenimui. ​ Mechanizmas: ○​ Aktyvių genų DNR yra mažiau kompaktiška, todėl lengviau pasiekiama reparacijos fermentams. ​ Esmė: Ši sistema užtikrina, kad svarbiausi genai būtų apsaugoti nuo pažaidų poveikio. 3. Dvigrandės DNR reparacija: ​ Procesas: Naudojama dvigrandės DNR trūkių taisymui. ​ Mechanizmas: ○​ Du Ku baltymai atpažįsta trūkius ir susijungia. ○​ Kompleksas aktyvuoja DNA-PK proteinkinazę, kuri fosforilina XRCC4 baltymą.  ○​ Aktyvuota DNR ligazė IV sujungia trūkio galus, ištaisydama žalą. ​ Esmė: Ši sistema užtikrina DNR vientisumo atstatymą po dvigrandžių trūkių. —---- SOS Reparacija: ​ Procesas: ○​ SOS reakcija aktyvuojama, kai ląstelėje atsiranda daug DNR pažaidų, blokuojančių replikaciją. ○​ Leidžia replikacijai tęstis nepaisant pažeidimų. ​ Mechanizmas: ○​ LexA baltymo slopinimas: Pažaidos aktyvuoja RecA baltymą, kuris inaktyvuoja LexA baltymą (reparacijos genų slopintoją). ○​ Aktyvuojami įvairūs SOS genai, įskaitant klaidų toleravimo DNR polimerazes. ○​ Šios polimerazės sintezuoja DNR per pažeistas vietas, įtraukia atsitiktines bazes. ​ Esmė: SOS sistema leidžia ląstelei išgyventi ekstremaliose sąlygose, tačiau padidina mutacijų riziką. Fotoreaktyvacija: ​ Procesas: ○​ Pažeistos bazės (ypač timino dimerai) taisomos šviesos poveikiu. ​ Mechanizmas: ○​ Fermentas fotoliazė aktyvuojamas UV-A ar mėlynos šviesos ir suskaldo timino dimerus. ○​ Tai atkuria normalią DNR struktūrą. ​ Esmė: Efektyvus ir tikslus mechanizmas, kurį ląstelės naudoja atsikratyti UV sukeltų pažeidimų. Palyginimas: ​ SOS reparacija dažniausiai veikia esant masinėms žaloms, užtikrina išgyvenimą, bet dažnai sukelia mutacijas. ​ Fotoreaktyvacija yra tiksli ir šviesos priklausoma sistema, kuri specializuojasi UV pažeidimų taisyme.  Rekombinacija REKOMBINACIJOS BENDRIEJI BRUOŽAI · Mutacijos svarbios organizmų kintamumui, evoliucijai. · Kitas mechanizmas, keičiantis genetinę informaciją – rekombinacija. · Genetinė rekombinacija - tarp dviejų DNR molekulių vykstantys genetiniai mainai, kurių metu susidaro nauji genų deriniai palikuoniams, kai įvairiais būdais keičiamasi genais, genetinėmis struktūromis arba jų dalimis. · Genetinė rekombinacija būdinga visiems organizmams nuo virusų iki sudėtingiausios sandaros augalų ir gyvūnų. · Rekombinacijos būdu sukuriama rūšies, populiacijų genetinė įvairovė. · Dėl jos chromosomose vyksta genų persiskirstymas. Ø Eukariotų atveju genetinė rekombinacija vyksta lytinio dauginimosi metu, ląstelių genetinės medžiagos susiskirstymas į chromosomas sudaro palankiausias sąlygas genetinės medžiagos mainams. · Kitas būdas apsikeitimas genetine medžiaga tarp homologinių chromosomų. Ø Prokariotuose DNR fragmentai į chromosomą gali patekti transformacijos (svetima DNR patenka į recipiento ląstelę), transdukcijos (virusas perneša DNR fragmentą), konjungacijos (pasinaudojama plazmidėmis) būdu. · Genetinės rekombinacijos metu formuojasi chromosomų trūkiai, o susidarę fragmentai jungiasi, sudarydami naujas kombinacijas. · Ląstelės genetinė rekombinacija gana konservatyvi, todėl pagrindiniai šio proceso etapai yra universalūs visiems gyviems organizmams. Pagrindiniai universalūs etapai yra šie: o trūkių atsiradimas DNR molekulėse; o viengrandžių DNR fragmentų susidarymas; o heteroduplekso (hibridinio DNR fragmento) susiformavimas; o geno konversija ir (ar) krosingoveris. REKOMBINACIJOS TIPAI Skiriami keturi pagrindiniai rekombinacijos tipai: 1. Homologinė rekombinacija. Vyksta tarp homologinių DNR segmentų. Būdinga visiems organizmams. 2. Nehomologinė rekombinacija. Vyksta tarp molekulių, neturinčių jokios homologijos arba ji labai maža. 3. Saitspecifinė rekombinacija. Vyksta rekombinuojant nehomologiniams DNR segmentams specifinėse vietose (saituose) 4. Transpozicija. Vyksta kai maži DNR segmentai, vadinami transpozonais, persikelia į įvairias chromosomų vietas HOMOLOGINĖ REKOMBINACIJA · Homologinė, arba bendroji genetinė rekombinacija – tai genetiniai mainai tarp nukleorūgščių molekulių, turinčių identiškas arba labai panašias (homologines) sritis. · Būtinas tam tikras homologinių DNR sekų ilgis. · Jei homologijos saito ilgis yra trumpesnis už tam tikrą kritinį dydį, tai homologinė rekombinacija nevyks, nes su DNR negalės sąveikauti specifiniai homologiją atpažįstantys ir procesą vykdantys baltymai. · DNR dupleksų homologinė rekombinacija gali būti skirstoma į: Konservatyvioji Nekonservatyvioji Produktų susidaro tiek kiek Molekulių susidaro mažiau jų buvo prieš rekombinaciją · Homologinės rekombinacijos pagrindinį mechanizmą numatė dar T. H. Morganas su kolegomis aptikę krosingoverį. · Mejozės I ir mitozės metu vyksta krosingoveris. Tai yra DNR mainai tarp homologinių chromosomų neseserinių chromatidžių; jie sukuria naujas alelių kombinacijas. o Seserinių chromatidžių mainai nesukuria naujų alelių kombinacijų, todėl nėra laikomi genetinės rekombinacijos forma. NEHOMOLOGINĖ REKOMBINACIJA · Nehomologinė rekombinacija yra daug retesnė. · Nehomologinė rekombinacija vyksta DNR (RNR) sekų, turinčių labai mažą (keleto nukleotidų) homologiją arba neturinčių jokios. · Joje dalyvauja specifiniai baltymai, kurie atpažįsta tam tikras sekas ir suformuoja genetinės informacijos mainus tarp jų. Įvairios rekombinacijos sistemos gali koegzistuoti toje pačioje ląstelėje. Tačiau jų indėlis į bendrąją rekombinaciją įvairiose organizmų grupėse yra skirtingas. · Mikroorganizmuose vyrauja homologinė rekombinacija. · Augalų ląstelėse vienam homologinės rekombinacijos atvejui tenka 100-10 000 nehomologinės rekombinacijos įvykių. GENU KONVERSIJA · Kartais genetinė rekombinacija du skirtingus alelius paverčia dviem identiškais aleliais. · Procesas, kai vienas alelis yra paverčiamas kitu aleliu, yra vadinamas genų konversija. Genų konversija gali atsirasti dviem būdais: · (1) DNR spragų reparacinės sintezės metu. · (2) Vykstant DNR bazių neatitikimo reparacijai. HOLIDJAUS JUNGTIS Remiantis šiuo modeliu, išskiriamos šios pagrindinės homologinės rekombinacijos ypatybės: · mainus sukelia simetriški homologinių grandinių trūkiai (b); · dėl mainų susidaro X tipo Holidėjaus jungtis (c, d) · simetriški grandinių mainai nulemia heterodupleksų susidarymą (c, d); · Holidėjaus jungtis yra sukarpoma dvejopai (e), todėl susidaro dviejų rūšių rekombinaciniai palikuonys. kerpant vertikaliai vyksta mainai flanginiais segmentais - krosingoveris (f). · kerpant horizontaliai vyksta apsikeitimas vidinėje dalyje esančiais fragmentais - geno konversija (g). · kad grandinių mainai vyktų krosingoverio būdu, reikalinga izomerizacija – DNR molekulių erdvinis persigrupavimas. Holidėjaus jungties migracija · Kita įdomi Holidėjaus jungties savybė yra ta, kad ji gali judėti DNR spirale. Procesas vadinamas „šakojimosi migracija". · Vyksta suardant ir vėl suformuojant vandenilinius ryšius. · Procesas labai lėtas ir reikalauja daug energijos. · Reikalingi specialūs fermentai procesui pagreitinti. · E. coli RuvA baltymai prisikabina prie jungties, RuvB baltymai leidžia migruoti. DVIGRANDŽIU TRŪKI REKOMBINACIJOS MODELIS · Vienoje iš dviejų homologinių DNR molekulių susidaro dvigrandis trūkis (a). Laisvi galai veikiami egzonukleazių, susidaro viengrandžiai galai (b). · Susidaręs viengrandis galas įterpiamas į homologišką DNR ir susidaro D kilpa (c). · Vyksta DNR grandinės sintezė nuo 3' galo dviem kryptimis (d). · Vykstant šiai sintezei plyšys užpildomas informacija, esančia homologinėje grandinėje (e). · Susidaro dviguba Holidėjaus jungtis (e). RECBCD REKOMBINACIJOS KELIAS Homologinė rekombinacija vyksta baltymų pagalba. E. coli yra žinomi trys rekombinacijos keliai: RecBCD, RecE ir RecF. RecBCD kelias yra pagrindinis, jis įjungiamas, kai atsiranda dvigrandis trūkis. Ø RecB, RecC, RecD baltymų kompleksas atpažįsta dvigranžio trūkio galus ir keliauja išilgai DNR kol pasiekia artimiausią chi saitą. Ø RecB turi nukleazinį domeną. RecD suaktyvina RecB nukleazės domeną, kad jis suskaidytų vieną iš grandinių, tuomet RecD disocijuoja iš komplekso. Ø RecBC tęsia išvyniojo procesą už chi saito ir sukuria viengrandę DNR. EUKARIOTŲ HOMOLOGINÉ REKOMBINACIJA · Eukariotuose homologinė rekombinacija vyksta mejozės ir mitozės metu. · Mejozinis krosingoveris - tai genetiškai determinuotas reiškinys, būtinas taisyklingam chromosomų pasiskirstymui į gametas. · Jo metu susidarantys dvigrandžiai trūkiai yra genetiškai determinuoti. · Mitozinis krosingoveris reikalingas dvigrandžių trūkių, atsiradusių somatinių ląstelių genetinėje medžiagoje, ištaisymui. · Taigi abiem vyksmams reikalingas dvigrandžių trūkių susidarymas. · Mielių ląstelėse mejozinio krosingoverio dažnis daugiau kaip tūkstantį kartų yra didesnis nei mitozinio. · Homologinė rekombinacija vyksta mejozės profazėje. Ji prasideda leptotenoje ir pasibaigia diplotenoje. Mitozinis krosingoveris Mejozinis krosingoveris Panašumai · Somatinės ląstelės · Gametos (lytinės) Reikalingas dvigrandžių · Rekombinacija · Rekombinacija vyksta trūkių susidarymas dažnesnė tarp tarp homologinių seserinių chromosomų chromatidžių · Susijęs su interferencijos reiškiniu. Susidaro sudėtinga nukleoproteininė struktūra – SINEPTONEMINIS KOMPLEKSAS https://www.youtube.com/watch?v=M_pUFziT3W4 SAITSPECIFINĖ REKOMBINACIJA · Vykstant šiam procesui du mažai homologiški ar visiškai nehomologiški DNR segmentai gali rekombinuoti specifiniuose saituose. o Šie saitai yra palyginti trumpos DNR sekos, nurodančios specifinę rekombinacijos vietą.  o Chromosomų fragmentų karpymą ir susijungimą katalizuoja specializuoti fermentai. · Saitspecifinę rekombinaciją naudoja: kai kurie virusai - savo DNR įterpti į šeimininko DNR INTEGRACIJOS-EKSCIZIJOS SISTEMA · Bene geriausiai ištirti šio tipo reiškiniai – integracija ir iškirpimas. · Lizogeninės būsenos metu λ fagas yra integravęsis į bakterijos chromosomą. Integracijos metu vyksta saitspecifinė rekombinacija tarp fago attP ir bakterijos attB saitų. · INT baltymas sukuria du dvigrandžius trūkius, kurie sujungiami ir susidaro persikryžiavimas. · Profagas bakterijos chromosomoje atsiduria attL ir attR saitų apsuptyje. · Iškirpimui reikalingas dar vienas baltymas - XIS. Tuo metu, kai fagas išsikerpa iš bakterijos chromosomos, vyksta rekombinacija tarp šių sekų. Jos yra attP ir attB hibridai. TRANSPOZICIJOS BENDRIEJI BRUOŽAI · Transpozicija - tai specifinė genetinės rekombinacijos forma, kuri perneša tam tikrus genetinius segmentus iš vieno DNR saito į kitą. · Šie DNR segmentai yra vadinami transpozabiliais elementais arba transpozonais. · Transpozonai įsiterpia į nehomologiškas jiems sekas. · Fermentas, katalizuojantis transpozabilaus elemento iškirpimą iš genomo, pernešimą ir įterpimą į naują genomo vietą, vadinamas transpozaze (arba integraze). · Specifiškumas sekos-taikinio atžvilgiu labai skiriasi. · Kai kurie dažniausiai įsiterpia tik į tam tikrus saitus, kiti nėra tokie išrankūs. Įsijungimas nėra visiškai atsitiktinis. · Yra du pagrindiniai integracijos vietų pasirinkimo būdai. o Vienas iš jų priklauso nuo tiesioginės rekombinazės (transpozazės ar integrazės) sąveikos su seka-taikiniu. o Antras - nuo rekombinazės ir papildomų baltymų, kuriuos gali koduoti tiek transpozonas, tiek šeimininkas, sąveikos. TRANSPOZICIJOS BŪDAI · Paprastoji (konservatyvioji) transpozicija · Replikacinė transpozicija · Retrotranspozicija PAPRASTOJI (KONSERVATYVIOJI) TRANSPOZICIJA · Transpozonas perkeliamas iš vienos vietos į kitą. · Iškerpamas iš šeimininko DNR (lieka dvigrandžiai trūkiai, molekulė nepataisomai sunaikinama). · Įterpiamas į DNR taikinį kerpant dvigrandę DNR ir sujungiant (ligazė) grandines. · Mechanizmas:​ A) Transpozazė, kurią gamina traspozonas, atpažįsta ir perkerpa atvirkštines kartotines sekas, taip išlaisvindama transpozoną iš chromosomos. Lieka dvigrandžiai trūkiai, kurie turi būti ištaisyti.​ B) Traspozazė atpažįsta taikinio seką, kerpa ją ir įterpia traspozoną. Viengrandžiai s prijungiami prie traspozono atvirkštinių kartotinių sekų. Viengrandžiai regionai užpildomi šeimininko komplementariomis bazėmis, taip padvigubinama taikinio seka. REPLIKACINĖ TRANSPOZICIJA · Transpozonas pasidvigubina persikeldamas iš vienos DNR molekulės į kitą.​ Jis įsiterpia į recipiento DNR molekulės ir taip pat palieka trasnpozono kopiją originalioje šeimininko DNR molekulėje. · Mechanizmas: o Transpozazė kerpa traspozoną donoro molekulėje ir taikinio seką recipiento molekulėje. o Galai sujungiami, todėl traspozonas atsiskiria ir susidaro dvi viengrandės traspozono kopijos. o Viengrandė DNR duoda signalą, kad donoras pataisytų defektą, todėl abu transpozonai tampa dvigrandžiai. o Recipiento DNR prijungta prie donoro DNR, suformuoja kointegratą.  o Rezolvazė gaminama transpozono, perskiria kointegratą. o Abiejuose DNR molekulėse dabar yra po trasnpozono kopiją. RETROTRANSPOZICIJA · Retrotranspozonas naudodamas šeimininko ląstelės transkripciją, sukuria viengrandę RNR. · Atvirkštinė transkriptazė naudoja RNR kaip šabloną sintetinti DNR. · DNR/RNR hibridas paverčiamas dvigrande DNR. · Dvigrandė DNR sudaryta iš retrotranspozono sekos gali būti įterpta į naują taikinio vietą šeimininko DNR. TRANSPOZABILŪS ELEMENTAI · Tai tokie elementai, kurie gali keisti savo vietą. · Transpozabilių elementų, greičiausiai, yra visų rūšių genomuose. · Kai kuriais atvejais eukariotų genomo kartotinės sekos yra susidariusios dėl transpozabilių elementų proliferacijos. · Žinduoliuose randamos kartotinės sekos: o LINES. Long interspersed elements; Dažniausiai nuo 1,000 iki 5,000 bp ilgio; Genome aptinkama nuo 20,000 iki 100,000 kopijų. o SINES. Short interspersed elements; Trumpesni nei 500 bp. Pavyzdys: Alu sekos (Žmogaus genome yra nuo 500,000 iki 1,000,000 kopijų. Tai sudaro apie 3-6 proc. viso žmogaus genomo). Ø Transpozabilūs elementai gali būti pilni (arba autonomiški), kai jie turi visą informaciją, būtiną transpozicijai vykti. Ø Transpozabilūs yra nepilni (arba neautonomiški), kai jiems trūksta geno(ų), reikalingų transpozicijai vykti. o Kukurūzų Ds elementas (Dissociation) yra nepilnas. Jam trūksta transpozazės geno. o Pilna šio TE versija yra Ac lokusas (Activator). Jis turi transpozazę.  o Todėl nepilno TE (tokio kaip Ds) transpozicija gali vykti tik tada, jei kitoje chromosomos srityje yra transpozazės genas (pvz., Ac lokuse). · Transpozabilūs elementai gali greitai patekti į organizmo genomą ir ten proliferuoti. o Vaisinės muselės (Drosophila melanogaster), transpozabilus elementas vadinamas P elementu, atsirado rūšies genome apie 1950 metus. o Per pastaruosius 50 metų P elementas išplito visose pasaulio D. melanogaster populiacijose. o Vieninteliai kamienai be P elemento yra D. melanogaster linijos, surinktos gamtoje iki 1950 m. · Transpozabilūs elementai gali veikti chromosomų struktūrą ir genų ekspresiją. JUDRIEJI GENOMO ELEMENTAI · Judrieji genomo elementai (JGE) – tai tam tikro tipo DNR, kuri geba judėti (keisti vietą) genome. · Šie elementai gali keisti savo vietą chromosomos viduje ir keliauti iš vienos chromosomos į kitą, taip įtakodami genų ekspresiją ir sukeldami chromosomų trūkius. · Gali būti autonominiai ir neautonominiai. Pastarieji gali keisti savo vietą tik tada, kai yra autonominis (aktyvus) elementas in trans. Autonominio elemento koduojama transpozazė atpažįsta neautonominio elemento galus ir inicijuoja transpoziciją. · Judrieji elementai genome gali būti ramybės būsenoje, juos aktyvuoja įvairūs biotiniai ir abiotiniai stresai. · Kukurūzai - tinkamas objektas JGE studijuoti. · Įvairios dėmės ant apyvaisio rodo sąveiką tarp judriųjų elementų ir genų, koduojančių fermentą, dalyvaujantį pigmento (antociano) biosintezėje. · Pažeistų sektorių skirtingas dydis priklauso nuo to, kada įvyko JGE iškirpimas - kokioje apyvaisio vystymosi fazėje. · Kukurūzuose buvo atrasti pirmieji JGE – disociatorius (Ds), kuris sąlygojo chromosomų lūžius ir aktyvatorius (Ac), reikalingas pirmajam veikti. Ac yra autonominis JGE, o Ds - neautonominis. · · JGE labai skiriasi savo struktūra, sudaryti iš DNR ir RNR. Dažnai transpozonai skirstomi į dvi klases: o pirmosios klasės transpozonai plinta dėl savo genomo RNR kopijų, kurios atvirkštinės transkripcijos metu paverčiamos cDNR. Šiuos elementus dar galima grupuoti į: 1.Retrovirusus; 2.Retrotranspozonus; 3.Retropozonus (LINES ir SINEs). o Antrosos klasės transpozonai neturi RNR stadijos. Jie vadinami paprasčiausiai - transpozonais. Pastarasis JGE skirstymas yra patogus, tačiau neatspindi egzistuojančios įvairovės. Dėl to dar naudinga susipažinti su N. Kleckner pasiūlyta klasifikacija, kuria remiantis prokariotų ir eukariotų elementai skirstomi į keturias grupes. PROKARIOTŲ JGE EUKARIOTŲ JGE Pirma klasė. Pirma klasė. Priklauso įterptinės sekos (IS) ir iš jų Priklauso transpozonai, pavyzdžiui, sudaryti sudėtiniai transpozonai. Įterptinės kukurūzų Ac ir jo defektyvus darinys Ds, sekos yra ~700-1500 bp. vaisinės muselės P elementas ir kt. Savo galuose turi invertuotas sekas ir bent Jų struktūra ir transpozicijos mechanizmas vieną geną, koduojantį transpozicijai panašus į prokariotų transpozonų. reikalingą baltymą transpozazę. Šiai klasei priklauso gausi Tc1/Mariner IS elementų žinoma daugiau nei 17 šeimų, šeima: Tc1 ir Tc3 yra nematodo C. elegans, kuriose yra per 500 JGE. o Mariner vaisinė muselės transpozonai. Sudėtiniai transpozonai sudaryti iš dviejų IS ir tarp jų esančių genų, todėl jie yra didesni - 5-10 kbp. Aktyvią transpozazę koduoja vienas iš IS. Antra klasė. Antra klasė. Jai priklauso Tn3 ir jam giminiški Priskiriami retrotranspozonai. transpozonai. Šie elementai savo genetine struktūra, Skirtingai nuo sudėtinių transpozonų jie transpozicijos mechanizmu labai panašūs į patys koduoja savo transpozazę. Savo galuose šie JGE turi invertuotas retrovirusus. pasikartojančias sekas. Gerai ištirti mielių Ty, vaisinės muselės Tn3 turi tris genus: transpozazės, rezolvazės Copia retrotranspozonai. ir ẞ-laktamazės. Retrovirusai nuo kitų retroelementų skiriasi tuo, kad savo genome turi env geną. Šio geno koduojamas baltymas leidžia užkrėsti retrovirusais šeimininko ląsteles. Trečia klasė. Trečia klasė. Priskiriami,,šokinėjantys“ bakteriofagai Priklauso LTR (ilgų galinių pasikartojančių (Mu, D108). sekų) neturintys retrotranspozonai, dar vadinami retropozonais. Mu yra didelis, DNR turintis virusas, sudarytas iš briaunainio pavidalo galvutės, Kaip ir retrotranspozonai jie turi RNR fazę, spiralinės struktūros uodegos ir šešių uodegos tačiau nepanašūs į retrovirusus. fibrilių. Šiai JGE grupei priklauso žinduolių LINE Lizogeninėje būsenoje fagas atsitiktinai ir SINE elementai, vaisinės muselės I įsiterpia į bakterijos genomą faktorius. konservatyviosios transpozicijos būdu. Lizės metu jis vykdo replikacinę transpoziciją.  Ketvirta klasė. Ketvirta klasė. Priskiriami JGE, nepatenkantys į anksčiau Priskiriami FB (angl. foldback) elementai. išvardytas klases. Šiuose labai savitos struktūros dariniuose Jie labai skiriasi tarpusavyje, todėl jiems yra daug ilgų invertuotų pasikartojančių reikalinga atskira klasifikacija. sekų. Gerai ištirtas Tn7 transpozonas. Pirmiausia jie buvo atrasti vaisinėje muselėje. Jis koduoja penkis transpozicijai reikalingus baltymus: TnsA, TnsB, TnsC, TnsD, TnsE- Tai iš atskirų modulių sudarytų dėl šių baltymų transpozicija vyksta dvejopai, transpozonų grupė. skiriasi transpozono įsiterpimo vietos. FB elementai (FBE) linkę gausiai sudaryti antrines struktūras. Galinių invertuotų sekų ilgis labai įvairus: nuo kelių šimtų bazių porų iki kelių kilobazių. Kai kurie FBE sudaryti tik iš ilgų invertuotų sekų. Tačiau kituose FBE tarp šių sekų yra vidurinis rajonas. V(D)J REKOMBINACIJOS ESMÈ · Antikūnai arba imunoglobulinai grupė baltymų, kuriems būdinga panaši molekulinė organizacija ir gebėjimas sąveikauti su antigenu. · Jų funkcija atpažinti antigenus (įskaitant virusus, bakterijas) ir nukreipti juos sunaikinimui. · Antigeno-antikūno atpažinimas yra labai specifinis. · Antikūnai sudaryti iš dviejų sunkiųjų ir dviejų lengvųjų polipeptidinių grandinių, sujungtų disulfidiniais ryšiais. · Sunkiosios ir lengvosios grandinių amino grupės (NH2) galas yra variabilus. · Jiems būdinga unikali aminorūgščių seka. · Šis baltymo rajonas specifiškai sąveikauja su antigenu. · Funkcionuojantys lengvosios ir sunkiosios grandinės genai susiformuoja atsitiktine tvarka, persitvarkant kintančiosios srities genų segmentams. · Šis persitvarkymas vadinamas V(D)J rekombinacija, kurią reguliuoja rekombinacijos aktyvinimo genai (RAG-1 ir RAG-2). · Genų segmentų susijungimą kontroliuoja DNR rekombinacijos signalinės sekos (RSS), išsidėsčiusios kiekvieno V, D ir J geno segmento galuose. · Imunoglobulinų genų persitvarkymas vyksta nuoseklia tvarka, pirmiausia pertvarkomi sunkiąją grandinę koduojantys genai, o vėliau – lengvosios grandinės genai. · Pertvarkomi tik vienos tėvinės chromosomos imunoglobulino molekulę koduojantys genai. · Tokiu būdu užtikrinama, kad subrendusi B ląstelė savo membranoje turi tik vieno antigeninio specifiškumo imunoglobulino molekulę. Transkripcija TRANSKRIPCIJOS BENDRIEJI BRUOŽAI · Transkripcija - tai procesas, kurio metu naudojant DNR grandinę kaip matricą sintetinama jai komplementari RNR molekulė. · Transkripcijos metu sintetinama RNR yra identiška vienai iš DNR grandinių - koduojančiai DNR grandinei. · RNR skiriasi nuo koduojančios DNR nukleotidų sekos tuo, kad joje vietoj timino yra uracilas. · DNR struktūra nesikeičia, DNR po transkripcijos išsaugo tą pačią informaciją, kurią turėjo iki jos. · Transkripcija yra pirmoji genų ekspresijos (raiškos) pakopa, kur ekspresija gali būti reguliuojama. · TRANSKRIPCIJOS MECHANIZMAS · Kad norimas genas galėtų būti transkribuojamas, dviguba DNR grandinė išskiriama. · Naudojant nekoduojančią DNR grandinę kaip matricą RNR polimerazė komplementarumo principu sintetina viengrandę RNR 5'->3' kryptimi. · Susintetinta RNR grandinė yra identiška koduojančiai grandinei. Eukariotai Prokariotai Dauguma genų transkribuojami Grupelė susijusių genų, vadinamų taip, kad susidarytų viena RNR operonais, yra transkribuojami molekulė, koduojanti informaciją kartu, viena RNR molekulė gali tik apie vieną baltymą. koduoti keletą baltymų, atliekančių susijusias funkcijas. · RNR transkripcijos ir DNR replikacijos skirtumai. RNR polimerazei sintetinti naują grandinę nereikia pradmens, pakanka tik DNR. o RNR molekulė nesudaro ištisinio duplekso su DNR molekule. Nedidelis dupleksas tarp RNR ir DNR grandinių susiformuoja tik sintezės vietoje (transkripcijos burbule), o likusi susintetinta RNR molekulė yra išstumiama iš duplekso. Skirtingai nei naujai susintetinta dukterinė DNR grandinė. o Susintetintos RNR molekulės yra trumpesnės nei DNR molekulės, sintetinamos replikacijos metu. RNR POLIMERAZĖS · RNR polimerazės (RNAP) – tai nuo DNR priklausomos RNR polimerazės, konservatyvios struktūros specializuoti baltymai, atliekantys panašias funkcijas. · Skirstomos į: o Bakterijų o Archėjų o Eukariotų RNR pol I, RNR pol II, RNR pol III · Jos priklauso konservatyvių baltymų šeimai, kuri vadinama daugiasubvienetine RNAP šeima. · Bakterijų, archėjų ir eukarotų RNR polimezės turi homologiškų subvienetų. Tai yra polimerazių šerdiniai subvienetai, kurie sudaro fermento pagrindą ir aktyvųjį centrą. · · RNR polimerazę sudarantys subvienetai skirstomi į: o 1) subvienetai, reikalingi fermento susimontavimui; o 2) subvienetai, kurie sudaro aktyvųjį centrą ir prijungia bei išdėsto DNR bei RNR molekules; o 3) pagalbiniai subvienetai. · Bazinėms RNR polimerazės funkcijoms užtikrinti užtenka pirmųjų dviejų grupių. · Pagalbiniai subvienetai suteikia paviršius papildomoms sąveikoms su transkripcijos veiksniais. TRANSKRIPCIJOS STADIJOS Bendrąja prasme transkripcija apima tris stadijas: · Iniciaciją · Elongaciją · Terminaciją Visoms trims stadijoms būdingos baltymų (RNR polimerazių) ir DNR sąveikos. INICIACIJA: · Promotorius funkcionuoja kaip atpažinimo vieta transkripcijos veiksniams/polimerazei (1); · Transkripcijos veiksniai leidžia RNR polimerazei prisijungt prie promotoriaus ir suformuoti uždarą promotoriaus kompleksą (2); · Po prisijungimo DNR grandinės išskiriamos, susiformuoja atviras polimerazės kompleksas (3). · Inicijuojamas transkripcijos kompleksas (4). ELONGACIJA: RNR polimerazė slenka DNR grandine ir sintetina RNR transkriptą (5, 6). TERMINACIJA: pasiekiamas terminacijos signalas, kuris priverčia RNR polimerazę disocijuoti nuo DNR (7). TRANSKRIPCIJA PROKARIOTUOSE · Prieš kiekvieną geną yra DNR sritis, kuri nėra transkribuojama. · Šioje srityje yra promotorius, seka prie kurios jungiasi polimerazė, kartu su kitomis sekomis, susijusiomis su genų raiškos kontrole. · Ši sritis vadinama priešsrovine (angl. upstream), o sritis, esančios už pirmojo transkribuojamo nukleotido - pasrovinė (angl. downstream). · Transkripcijos pradžios nukeotidas (+1) tai nėra pirmasis baltymą koduojančios sekos nukleotidas- Tarp šių taškų yra trumpa netransliuojama · atkarpa, vadinama 5′UTR (angl. 5'-untranslated region). · Kitame mRNR gale pat pat yra netransliuoma atkarpa, vadinama 3'UTR. TRANSKRIPCIJOS CIKLAS PROKARIOTUOSE (INICIACIJA, ELONGACIJA, TERMINACIJA) PROMOTORIAUS ATPAŽINIMAS – surandamas promotorius · Bakterijų RNR polimerazės holofermentas, kurio sudėtyje yra šerdinė dalelė sigma veiksnys, atlieka promotoriaus atpažinimo funkciją. · Sigma veiksnys atpažįsta tiek -35, tiek -10 sritį. · RNR polimerazė jungiasi prie dvigrandės DNR promotoriuje. · Susidaro uždarasis RNR polimerazės ir promotoriaus DNR kompleksas. · Holofermentas uždengia promotoriaus sritį nuo -50 iki +6 nukleotido. Šioje srityje DNR apsaugota nuo I deoksiribonukleazės ir hidroksilo radikalų poveikio. · Komplekse DNR dvigrandė, transkripcijos burbulas dar nesusidaręs. · Sigma veiksnys išskiria DNR grandines promotoriaus -10 srityje. · Susidaro atviras RNR polimerazės ir promotoriaus komplesas, transkripcijos burbulas. · RNR polimerazėje vyksta erdvinės transformacijos. · DNR išdėstoma RNR polimerazės kanale, kur yra aktyvusis centras. INICIACIJA - prasideda RNR sintezė. · RNR polimerazė pradeda sintezę, jungia pirmuosius nukleotidus į RNR. · Transkripcijos burbulas juda, suardant DNR dupleksą, DNR laikinai sudaro dupleksą su naujai sintetinama RNR grandine. · DNR/RNR hibridas yra trumpas ir laikinas: RNR polimerazei judant į priekį, jis susiformuoja iš naujo, ir RNR transkriptas atsipalaiduoja kaip laisva molekulė. · RNR polimerazė sintetina RNR grandinę nuo 5' galo į 3' galą. · Iniciacijos etapas baigiasi, kai polimerazė susintetina ilgesnį nei 10 nukleotidų transkriptą. · Sigma veiksnys yra pašalinamas (atpalaiduojamas) iš komplekso. Baigiama iniciacijos stadija. · Gali ir nepasišalinti. ELONGACIJA - RNR polimerazė sintetina RNR molekulę. · RNR polimerazė slenka DNR grandine ir sintetina RNR molekulę. TERMINACIJA - pasiekusi terminacijos signalą, transkripcija sustoja. · Kai RNR polimerazė pasiekia savituosius terminacijos signalus, ji sustoja, transkripcijos kompleksas disocijuoja. · Suardomi vandeniliniai ryšiai, kuriais prie transkripcijos komplekso yra prijungtas DNR-RNR hibridas, o transkripcijos burbulo vietoje vėl susidaro DNR dupleksas. · Bakterijų nukleotidų sekos, reikalingos terminacijai įvykti, vadinamos transkripcijos terminatoriais. · Skirtingi terminatoriai skirtingu veiksmingumu stabdo transkripciją, kai kurių jų veikimas priklauso nuo papildomų baltyminių veiksnių. · Bakterijų genų transkripcijos terminatoriai skirstomi į dvi grupes: o 1. nuo veiksnių nepriklausomi, kurių veikimui nereikia jokių papildomų baltyminių veiksnių. Jie dar vadinami vidiniais terminatoriais.  o 2. nuo Rho baltymo priklausomi transkripcijos terminatoriai. BAKTERIJŲ RNR POLIMERAZĖ Bakterijų RNR polimerazė sudaryta iš dviejų struktūrinių vienetų: · Šerdinės dalelės, kurią sudaro: du vienodi a subvienetai a l ir a ll,; ẞ subvienetas,; B' subvienetas; w subvienetas · σ (sigma) subvieneto Šerdinė dalelė ir o subvienetas sudaro - holofermentą. Ø Šerdinė dalelė atsakinga už RNR sintezę. Ø σ subvienetas daugiausia atsakingas už promotoriaus atpažinimą. NUO RHO PRIKLAUSOMA/NEPRIKLAUSOMA TERMINACIJA Nepriklausoma terminacija: · Nuo Rho nepriklausomi transkripcijos terminacijos signalai yra koduojami DNR. · Jie sudaryti iš invertuotų G ir C gausių nukleotidų sekų ir už jų esančios T gausios nukleotidų sekos. · Susintetinus terminatoriaus RNR, G ir C gausus invertuotas pasikartojimas sudaro antrinę RNR plaukų segtuko struktūrą netoli RNR 3' galo; · Už plaukų segtuko susintetinamas U nukleotidų ruožas pačiame transkripto 3' gale. · RNR išėjimo kanale susidaro plaukų segtuko struktūra. · Plaukų segtuko struktūros susidarymas skatina beveik visiškai suirti DNR-RNR hibridą. · Tai atidaro RNR išėjimo kanalą. · RNR disocijuoja, transkripcija sustabdoma. Priklausoma terminacija: · RNR polimerazė sintetina RNR (1). · Rho baltymas prisijungia prie C-turtingos (G-neturtingos) specifinės srities RNR molekulėje (2). · Rho baltymas juda išilgai RNR, kol pasiveja transkripcijos kompleksą (3). · RNR polimerazė stabteli, ją pasiveja Rho baltymas (3). Rho baltymas "išsuka" RNR/DNR dupleksą (4). · Įvyksta transkripcijos terminacija: iš transkripcijos · komplekso disocijuoja RNR polimerazė, Rho baltymas, ir RNR bei DNR (5). · Rho baltymas yra heksamerinė helikazė, pasižymi sugebėjimu išsukti RNR/DNR hibridą. · http://booksite.academicpress.com/Clark/molecular2/anim11 initiation transcription bacteria.php EUKARIOTŲ RNR POLIMERAZÈS · Tipiška eukariotinė ląstelė turi 10 kart daugiau genų nei prokariotinė. · Transkripcijos procesas eukariotuose daug sudėtingesnis. · Eukariotų ląstelėse RNR sintetina kelios RNR polimerazės. · Didžiąją dalį RNR sintetina trys RNR polimerazės: o RNR polimerazė I sintetina rRNR; o RNR polimerazė II sintetina iRNR; o RNR polimerazė III sintetina tRNR, 5S rRNR, bei kitas mažas RNR. · Visų trijų polimerazių struktūra yra panaši. · Jas sudaro daug subvienetų. Paprastai sudarytos iš 12-14 subvienetų. · Taip pat reikalingi įvairūs baltymai – transkripcijos veiksnius. · Žydinčiuose augaluose nustatytos dar dvi branduolio RNR polimerazės – RNR IV ir RNR V. · RNR polimerazė IV sintetina mažas RNR – endogenines siRNR, kurios yra svarbios genų raiškos slopinimui. · RNR polimerazė V dalyvauja nuo transkripcijos priklausomo DNR metilinimo procese. · Eukariotuose taip pat yra mitochodrijų ir chloroplastų RNR polimerazių. · RNR polimerazių I ir II transkribuojamų genų promotoriai išsidėstę prieš transkripcijos pradžios nukleotidą. · Tačiau tam tikrų RNR polimerazės III transkribuojamų genų promotoriai yra genų viduje, t.y. už transkripcijos pradžios nukleotido. · Kiekvienas promotorius turi įvairių nukleotidų sričių, kurias atpažįsta savitieji transkripcijos veiksniai. · Eukariotų organizmuose genų promotorius atpažįsta ne RNR polimerazės, o transkripcijos veiksniai. · Prisijungę ties promotoriais, transkripcijos veiksniai sukuria struktūrą, prie kurios po to jungiama RNR polimerazė. · Eukariotų RNR polimerazės lokalizuotos skirtingose eukariotų ląstelės branduolio vietose. · RNR polimerazė I sutelkta branduolėlyje, kur sintetina rRNR pirmtaką. · RNR polimerazės I sintetinamos RNR kiekis yra didžiausias. · RNR polimerazė II yra sutelkta nukleoplazmoje. Ji sintetina iRNR molekulių pirmtakus. · RNR polimerazės I ir II susintetina didžiąją dalį ląstelės RNR. · RNR polimerazė III yra sutelkta nukleoplazmoje. - Ji sintetina tRNR, 5S rRNR bei kitas mažas RNR. I Promotorius prieš transkripcijos pradžios tašką Branduolėlyje rRNR Didžiausias RNR kiekis  II Promotorius prieš transkripcijos pradžios tašką Nukleoplazmoje iRNR III Promotorius už transkripcijos pradžios taško. Nukleoplazmoje tRNR, 5S rRNR, mažos RNR IV Žydinčiuose augaluose siRNR (raiškos slopinimui) V Žydinčiuose augaluose DNR metilinime RNR POLIMERAZĖS I TRANSKRIPCIJOS KOMPLEKSAS · Transkripcijos veiksniai, dalyvaujantys RNR pol I transkripcijoje, atpažįsta vieno tipo promotorių. · Ląstelėms reikia didžiulio kiekio ribosomų, todėl rRNR pirmtako genome yra šimtai geno kopijų. · Ribosominės RNR pirmtaką koduojantys genai susitelkę tam tikrose kelių chromosomų vietose - branduolėlio organizavimo srityse, NOR (angl. nucleolar organizer regions). Jų skaičius organizmuose skiriasi. · Skirtingų eukariotinių organizmų rRNR genų promotorių nukleotidų sekos skirtingos, tačiau reguliacinės sritys - konservatyvios visuose organizmuose nuo mielių iki žmogaus. · rRNR pirmtako transkripcijos vienete rRNR išsidėsčiusios tokia tvarka: 18S, 5,8S ir 28S. · Pirmtakus koduojantys genai sudaro dideles sankaupas. · Genus skiria tarpgeniniai tarpai, ITS (angl. intergenic spacer). Jie netranskribuojami. · Tarpgeniniuose tarpuose yra rRNR pirmtako genų promotoriai.  · Ribosominės DNR promotorius. Promotorių sudaro dvi pagrindinės reguliacinės sritys: šerdinis promotorius ir UCE elementas (angl. upstream control element). · Šerdinį promotorių sudaro ~ 50 nukleotidų sritis (-45-+20). · Jis yra būtinas daugelyje organizmų inicijuoti rRNR transkripciją. · Šerdiniame promotoriuje yra transkripcijos pradžios nukleotidas. · Transkripcijos iniciacija ties rRNR genų promotoriais žymiai veiksmingesnė, kai prieš šerdinį promotorių yra UCE elementas. · Jis labai veiksmingai stimuliuoja transkripciją, tačiau daugeliu atveju nėra būtinas. · RNR pol I vykdomai transkripcijai reikia dviejų transkripcijos veiksnių: SL1 (angl. selectivity factor 1) ir UBF (angl. upstream binding factor), bei daugelio pagalbinių baltymų. · Bazinei transkripcijai vykti užtenka SL1 veiksnio, o veiksmingai transkripcijai reikia abiejų. · RNR pol I transkripciją stabdo specifinės terminatorių sekos. · Šiose sekose paprastai gausu AT porų, kurios padeda destabilizuoti DNR ir RNR hibridą. RNR POLIMERAZĖS III TRANSKRIPCIJOS KOMPLEKSAS · Labiausiai išsiskirianti RNR pol III transkribuojamų genų promotorių savybė: konservatyvieji promotorių elementai yra išsidėstę už transkripcijos pradžios nukleotido - genų viduje. Šie promotoriai vadinami vidinės kontrolės sritimis, ICR (angl. internal control regions). · RNR pol Ill transkribuojamų genų promotorius galima suskirstyti į tris tipus: I ir II tipo promotorių reguliacinės sritys yra išsidėsčiusios genų viduje; III tipo promotoriai tokių elementų neturi. I tipo promotoriai II tipo promotoriai III tipo promotoriai Reguliacinės sritys – geno Reguliacinės sritys – geno Reguliacinių sričių neturi. viduje. viduje. 5s rRNR tRNR genai A elementas Konservatyvūs Neturi jokių tipiškų elementų IE vidurinysis elementas A ir B elementai C elementas · Prie šių elementų jungiasi TFIIIB veiksnys TFIIIA prisijungia prie A ir TFIIIA veiksnio nereikia prijungia TFIIIC prie C RNR POLIMERAZĖS II TRANSKRIPCIJOS KOMPLEKSAS · RNR pol II yra pagrindinis eukariotų genų veiklą valdantis fermentas, kuris sintetina visas iRNR molekules. · Eukariotinėse ląstelėse RNR pol II yra didžiulis baltymas. · RNR pol Il nors ir pasižymi polimeraziniu aktyvumu, negali inicijuoti transkripcijos nuo genų promotorių. · Tam būtini papildomi baltymai, kurie, kartu su RNR pol II: o sudaro transkripcijos iniciacijos bei elongacijos kompleksus, o gali atpažinti promotorius ir o reaguoti į transkripcijos signalus. · Transkripcijos preiniciacijos kompleksą sudaro: o RNR polimerazė II; o pagrindiniai transkripcijos veiksniai, GTF (angl. general transcription factors): TFIID, TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH; o mediatoriaus kompleksas. · ŠERDINIS PROMOTORIUS: · Eukariotų RNR pol II šerdinės dalies struktūra panaši į bakterijų polimerazės. Du didžiausi RNR pol II subvienetai - Rpb1 ir Rpb2 - sudaro fermento šerdį. Mažesnieji RNR pol II subvienetai yra daugiausiai didžiųjų subvienetų išorėje. · Netoli +1 nukleotido yra konservatyvios sritys (TATA), jos sudaro šerdinį promotorių. RNR Pol II transkribuojamų genų promotoriams būdingos ir kitos reguliacinės sritys. · Jos skirstomos į šias grupes: o artimieji promotoriaus elementai; o tolimieji reguliaciniai elementai: stiprikliai (angl. enhancers); slopikliai (angl. silencers); izoliatoriai (angl. insulators); srities kontrolės elementai, LCR (angl. locus control regions); užpildo prisijungimo sritys, MAR (angl. matrix attachment regions).S · RNR II polimerazės šerdinį promotorių sudaro ~ 60 bp DNR sritis, kurioje yra transkripcijos pradžios nukleotidas. · Su šia sritimi sąveikauja pagrindiniai transkripcijos veiksniai ir RNR II polimerazė. · Daugelio RNR II Pol šerdiniai promotoriai turi konservatyvią sritį TATA dėžutę. TATA dėžutę sudaro nukleotidai ATATAAA. · TATA dėžutę turi stiprūs promotoriai. · TATA dėžutė yra gana dažnas žinduolių genų šerdinio promotoriaus elementas. o Tačiau, pvz., žmogaus genome šio elemento neturi didesnė pusė genų promotorių (vadinamieji TATA neturintys promotoriai). · TATA dėžutė užtikrina tikslų transkripcijos pradžios nukleotido nustatymą per transkripcijos iniciaciją. · Greta TATA dėžutės dažnai yra šerdiniui promotoriui būdinga sritis – BRE (angl. TFIIB recognition element). · Prie BRE atrankiai jungiasi pagrindinis transkripcijos veiksnys TFIIB. · RNR POLIMERAZĖS II TRANSKRIPCIJA: · Eukariotų RNR II polimerazės bazinis transkripcijos aparatas, prisijungęs prie šerdinio promotoriaus, užtikrina bazinę transkripciją. · Bazinė transkripcija nėra veiksminga. · Veiksmingai transkripcijai vykti reikia kitų baltymų – reguliacinių transkripcijos veiksnių, dažniausiai transkripcijos aktyviklių. · Transkripcijos aktyvikliai skatina prie promotoriaus kooperatyviai jungtis transkripcijos aparato komponentus.  · Transkripcijos veiksniai + RNR Pol II = preiniciacijos kompleksas o (1) TFIID (pagr.) baltymas TBP + TATA sritis = nustatoma transkripcijos pradžios nukleotido padėtis. (2) Paskui +TFIIA, TFIIB. (3) galiausiai RNR polimerazė + TFIIF (padeda ją prijungti). INICIJUOJAMA RNR SINTEZĖ o (4) +TFIIE, TFIIH (fosforilina RNR pol uodegą), TFIIJ. TFIIH + polimerazė pereina į elongacijos etapą ir kartu juda. TRANSKRIPCIJOS CIKLAS EUKARIOTUOSE. Skaidrėse nėra? http://booksite.academicpress.com/Clark/molecular2/anim11 initiation transcription eukaryotes.php MEDIATORIAUS KOMPLEKSAS · RNR Pol II ir pagrindiniai transkripcijos veiksniai eukariotuose yra labai konservatyvūs. · Be jų transkripcijoje dalyvauja ir kiti komponentai, kurie veikia kaip tarpininkai tarp RNR II Pol bei transkripcijos veiksnių ir savitų genams transkripcijos reguliatorių. · Dideli baltyminiai kompleksai, kurie skatina susimontuoti transkripcijos veiksnius ties promotoriais, vadinami mediatoriais. · Mediatoriaus kompleksas yra vienas esminių transkripcijos valdymo komponentų.  Transkripcijos valdymas TRANKSRIPCIJOS VALDYMO BENDRIEJI BRUOŽAI · Transkripcijos valdymas – tai genų raiškos reguliavimas, mechanizmas kurio metu didinama arba mažinama tam tikro geno raiška, nes keičiasi jo produkto poreikis. · Kai kurie genai ekspresuojami visada, tačiau dauguma genų ekspresuojami tik tada, kai jų reikia. · Genų raiška yra griežtai valdoma. TRANSKRIPCIJOS VALDYMAS PROKARIOTUOSE · Bakterijose, tokiose kaip E. coli iš 4200 genų apie 1000 yra ekspresuojami tam tikru metu. · Pasikeitus tam tikroms sąlygoms kai kurie genai gali būti išjungiami, kiti jjungiami. Pvz. temperatūros pasikeitimas gali turėti įtakos 50-100 genų ekspresijai. Ø Vienaląsčiai organizmai savo genus reguliuoja, reaguodami į aplinkos pokyčius (pvz., temperatūros, osmosinio slėgio ar maisto medžiagų prieinamumas) ir į vidinę ląstelės būklę (pvz., pasirengimą dalytis). Ø Daugialąsčiuose organizmuose įtakos turi ir ląstelių tarpusavio ryšys bei organizmo vystymo raida. · PROKARIOTUOSE genų raiška gali būti valdoma šiuose etapuose: o transkripcijos o transkriptų brendimo o transliacijos · Transkripcijos metu genų raiškos valdymas dažniausiai vyksta iniciacijos etape, elongacijos etape jis retas. Gali pasireikšti ir terminacijos metu. · Apibūdinant genų veiklos valdymo · mechanizmus yra vartojami terminai struktūrinis genas ir reguliatoriaus genas. · Struktūrinis genas koduoja produktą - baltymą arba RNR. · Reguliatoriaus genas koduoja produktą – baltymą ar RNR, - kuris dalyvauja valdant kitų genų transkripciją. · Genų transkripciją reguliuoja daug įvairių veiksnių, ji priklauso ir nuo geno sandaros. · Pagal vietą chromosomose reguliacinės DNR sekos skiriamos į cis · sekas/veiksnius ir trans sekas/veiksnius. · Cis veiksniai, yra šalia geno arba genų grupės, jie dažniausiai nulemia genų veiklos reguliacijos pobūdį, ar genas veiks nepertraukiamai ar bus įjungtas tik tam tikru metu. · Trans veiksniai dažniausiai yra reguliaciniai genai, kurie koduoja transkripcijos veiksnius, atpažįstančius geno reguliacinėje dalyje specifines nukleotidų sekas. AKTYVIKLIAI IR REPRESORIAI · Kai kurie promotoriai funkcionuoja blogai arba visai nefunkcionuoja, jei neturi baltymų aktyviklių. · Kiti promotoriai gali būti aktyvūs ir be aktyviklių, juos valdo baltymai reguliatoriai – represoriai. · Transkripcijos reguliavimo pobūdis gali būti dvejopas: teigiamasis arba neigiamasis. · Teigiamosios kontrolės metu reaguojant į signalą, genui įjungti reikalingas aktyviklis. · Neigiamosios kontrolės atveju geną išjungia represorius ir ekspresuojamas tik tuomet, kai veikia signalas, kuris pašalina represorių iš geno. · Tiek teigiamos, tiek neigiamos kontrolės metu maža signalinė molekulė, induktorius, paprastai jungiasi prie reguliuojančio baltymo ir indukuoja genų raišką. · Standartiniame teigiamojo reguliavimo atveju neaktyvus aktyviklis prisijungia signalinę molekulę ir virsta aktyviu ir prisijungia prie reguliacinių sekų. · Standartiniame neigiamojo reguliavimo atveju represorius blokuoja promotorių tol kol, prisijungusi signalinė molekulė pakeičia represoriuas konformaciją, atlaisvina jį nuo geno ir leidžia prisijungti RNR polimerazei. OPERONAS · Prokariotuose genų sankaupos, kurios transkribuojamos kartu, vadinamos operonais. · Gaunama viena iRNR, kuri koduoja kelis baltymus. · Operonas yra reguliacinis vienetas, kurį sudaro struktūriniai genai ir elementai, valdantys jų transkripciją. LAKTOZĖS OPERONAS · Operono molekulinį valdymo modelį 1966 m. pasiūlė F. Žakobas ir Ž. Mono, ištyrę E. coli laktozės geną. · Bakterijų laktozės operonas ir jo transkripcijos valdymas yra tipiškas prokariotų genų transkripcijos valdymo pavyzdys. · Vadinamas lac arba latozės operonu. · Operoną sudaro lacZ, lacY, lacA genai ir reguliacinis regionas LAKTOZĖS OPERONO STRUKTŪRINIAI GENAI Operono struktūrinių genų funkcijos: · lacz genas koduoja fermentą ẞ galaktozidazę, kuri skaldo ẞ galaktozidus į monosacharidus. Pvz., laktozė suskaldoma iki galaktozės ir gliukozės, kurios ląstelėje toliau metabolizuojamos. · lacY genas koduoja laktozės permeazę, kuri įneša ẞ galaktozidus į ląstelę. Laktozės permeazė - transportinis baltymas. · lacA genas koduoja laktozės transacetilazę, perneša acetilo grupę. Jis nereikalingas E. coli augti, kai terpėje yra laktozės. · Laktozės operono genų transkripciją valdo Lacl baltymas represorius, kurį koduoja lacl genas. OPERATORIUS. LacO operatorius – Lacl atpažinimui. Yra seka ir CRP baltymo atpažinimui. OPERONO REGULIACIJA. · Jei nėra induktoriaus (pvz. laktozės) Lacl baltymas represorius prisijungia prie operatoriaus. Tai blokuoja RNR polimerazės judėjimą ties promotoriumi. · Kai laktozės yra – ji indukuoja laktozės operoną. Tikrasis induktorius ne pati laktozė, o alolaktozė – laktozės izomeras. Alolaktozė prisijungia prie Lacl represoriaus, kuris pakeičia savo konformaciją, todėl jis negali prisijungti prie DNR, todėl RNR polimerazė gali judėti ir transkribuoti lac operoną. · Transkripcijos valdymo pobūdis - neigiamasis. AKTYVIKLIAI IR REPRESORIAI. · Aktyvikliai paprastai jungiasi priešsroviniame regione prieš promotorių ir padeda RNR polimerazei prisijungti. · Represoriai, atvirkščiai, jungiasi pasroviniame regione už promotoriaus ir blokuoja RNR polimerazės prisijungimą arba neleidžia jai judėti ir transkribuoti geno. · Tačiau tas pats baltymas gali veikti kaip aktyviklis vienam genui, o kitam genui kaip represorius, jei jis jungiasi skirtingose dviejų genų vietose. o Baltymas prisijungęs operatoriaus srityje, neleidžia jungtis RNR polimerazei - transkripcija nevyksta. o Tas pats baltymas prisijungęs prie kito geno aktyvacijos vietos, palengvina RNR polimerazės prisijungimą ir skatina genų transkripciją. · Šio baltymo atpažinimo sekos yra vienodos, tik jų išsidėstymas skirtingas polimerazės atžvilgiu. KOREPRESOSIUS · Kai kurie represoriai yra aktyvūs tik tada, kai prisijungia mažą signalinę molekulę, vadinamą korepresoriumi. · Jei terpėje yra aminorūgšties, ląstelei nereikia jos gaminti. · Kita vertus, jei aminorūgšties yra nepakankamai, reikia įjungti biosintezės kelią. · Pvz., trūkstant arginino E. coli arginino represorius Arg R negali prisijungti prie DNR, todėl RNR polimerazė transkribuoja genus arginino sintezei. · Kai arginino yra pakankamai, argininas veikia kaip korepresorius ir prisijungia prie represoriaus Arg R. · Tada kompleksas jungiasi prie operatorių ir slopina arginino sintezės genus. GLIUKOZĖS EFEKTAS · Bakterijoms augant terpėje, kurioje greta kitų anglies šaltinių, pvz., laktozės, yra gliukozės, pirmiausiai yra metabolizuojama gliukozė. · Gliukozė tiesiogiai skaidoma glikolizės cikle, ją metabolizuoti bakterijoms paprasčiau negu kitus sacharidus, kurių metabolizmui reikia susintetinti papildomų fermentų. · Kol augimo terpėje yra gliukozės, laktozės metabolizme dalyvaujančių fermentų sintezė slopinama. · Kai gliukozė sunaudojama, indukuojama genų, koduojančių kitų terpėje esančių sacharidų metabolizmo fermentus, transkripcija. CRP BALTYMAS · Kai gliukozės koncentracija terpėje yra maža aktyvinama laktozės operono transkripcija. Laktozės operono trankspripcijos akyviklis baltymas CRP (angl., Cyclic AMP Receptor Protein). · Šis baltymas įjungia genus, kad būtų naudojama laktozė, maltozė ar kitos maisto medžiagos. · Kad šis baltymas galėtų prisijungti prie DNR ir aktyvuoti genus, pirmiausia jis turi prisijungti signalinę molekulę - ciklinį adenozino monofosfatą, cAMP. · Kai CRP baltymas prisijungia cAMP jie sudaro dimerus, kurie gali prisijungti prie DNR greta laktozės promotoriaus. · Taigi laktozės operono indukcija priklauso nuo dviejų baltymų: represoriaus Lacl ir aktyviklio CRP. LAKTOZĖS OPERONO REGULIACIJA. (i) Nėra gliukozės, todėl aktyviklis CRP su CAMP prisijungęs, yra laktozės, todėl Lacl represorius yra pašalintas nuo DNR. (ii) Yra gliukozės, todėl aktyviklis CRP neprisijungęs, nėra laktozės, todėl represorius Lacl vis dar prisijungęs, ekspresija blokuojama. (iii) Nėra nei gliukozės, nei laktozės, todėl CRP su cAMP prisijungęs, Lacl represorius vis dar blokuoja transkripciją. (iv) Nėra laktozės, todėl Lacl represorius yra pašalintas, nepaisant to kad yra gliukozės, todėl aktyviklis CRP neprisijungęs, ekspresija nevyksta. · Taigi tik pirmuoju atveju indukuojama lac operono ekspresija. TRIPTOFANO OPERONAS · Kol aminorūgščių ląstelėje pakanka, jų biosintezės genų transkripcija slopinama. · Kai aminorūgščių ima stigti, transkripcijos slopinimas nevyksta. · Tokio transkripcijos valdymo pavyzdys yra bakterijų triptofano (trp) operonas. · Triptofano operoną sudaro 5 struktūriniai genai ir reguliacinė sritis. · Struktūriniai genai koduoja fermentus, sintetinančius triptofaną iš chorizminės rūgšties. · Operono transkripciją slopina baltymas Trp represorius, kurį koduoja trpR genas, išsidėstęs kitoje chromosomos srityje. · Triptofano operono represoriaus dimeras prisijungia prie savitos operatoriaus srities trp operone, tik prisijugęs triptofaną, ir stabdo transkripciją. · Triptofanas yra trp operono korepresorius. · Kai triptofano koncentracija ląstelėje sumažėja, triptofanas disocijuoja iš komplekso, o baltymas represorius - nuo operatoriaus DNR srities. · RNR polimerazė jungiasi prie promotoriaus, vyksta triptofano biosintezės genų transkripcija. GRIEŽTASIS ATSAKAS · Kai trūksta medžiagų apsirūpinti ląstelei aminorūgštimis, ląstelėje slopinami tam tikri gyvybiškai svarbūs procesai. Toks valdymo būdas vadinamas griežtuoju atsaku. · Griežtojo atsako metu ląstelės metabolizmas yra minimalus, o kai maisto medžiagų aplinkoje padaugėja, metaboliniai procesai suaktyvėja. · Griežtojo atsako metu rRNR ir tRNR sintezė sumažėja 10–20 kartų, o visų RNR sintezė - 5-10%. · Griežtąjį atsaką sukelia arba kurios nors aminorūgšties trūkumas, arba mutacija aminorūgštis prie tRNR jungiančiose amino-acil-tRNR sintetazėse. TEMPERATŪRINIO ŠOKO ATSAKAS · Opimali E. coli augimo temperatūra 37 °C, ji gali augti ir esant 43 °C, tačiau temperatūrai pakilus iki 46 °C ji nustoja augti. · Esant 46 °C temperatūrai apie 30 % visų E. coli gaminamų baltymų yra temperatūrinio šoko baltymai. · Šie baltymai priskiriami dviem grupėms: šaperoninams – padeda kitiems baltymams teisingai susilankstyti ir išvengti agregacijos ir proteazėms - ardo karščio paveiktus baltymus, kurie nebuvo sutvarkyti. TRANSKRIPCIJOS VALDYMAS EUKARIOTUOSE · Eukariotinėse ląstelėse egzistuoja gerokai daugiau genų ekspresijos kontrolės lygių nei prokariotinėse ląstelėse. · Eukariotų genų transkripcijos valdymas nevienodai vyksta skirtinguose audiniuose, skirtinguose vystymosi etapuose. · Genų ekspresija gali būti reguliuojama įvairiuose genetinės informacijos perdavimo etapuose. · Eukariotų genų ekspresijai reikalingi keli baltymai aktyvikliai. · Eukariotų organizmai gauna daug naudos iš genų veiklos reguliavimo. · Jie gali reaguoti: į maisto prieinamumo pokyčius, į aplinkos stresus, sąveiką su kitais organizmais. · Augalų ir gyvūnų daugialąstiškumas ir sudėtingesnė ląstelės struktūra reikalauja ir žymiai sudėtingesnės ir įvairesnės genų ekspresijos kontrolės. · Eukariotų genai saugomi branduolyje. Transkripcijos veiksniai yra baltymai, juos gamina citoplazmoje esančios ribosomos, kad galėtų veikti, jie turi patekti į branduolį. · Be to DNR branduolyje stipriai kondensuota į nukleosomas ir apsaugota histonais, todėl RNR polimerazei ir transkripcijos veiksniams sunkiai pasiekiama. · Todėl eukariotams reikalingi specialūs baltymų, kurie pertvarko ar chemiškai modifikuoja histonus ir nuleosomas. VEIKSNIAI DALYVAUJANTYS EUKARIOTŲ TRANSKRIPCIJOS VALDYME Veiksnius, dalyvaujančius transkripcijoje ir jos valdyme, galima skirstyti į kelias grupes: · Pagrindiniai transkripcijos veiksniai: o kartu su RNR II polimeraze sudaro bazinį transkripcijos aparatą ir prisijungia ties geno promotoriumi o Transkripcijos aktyvikliai o Transkripcijos represoriai · Aktyvikliai ir represoriai eukariotuose atpažįsta savitas trumpas sekas promotoriuose ir stiprikliuose. · Transkripcijos veiksniai pasižymi šiomis savybėmis: · Reaguoja į dirgiklius, kurie signalizuoja, kad vienas ar daugiau genų turi būti jjungti. · Skirtingai nei dauguma baltymų, gali patekti į branduolį. · Atpažįsta ir prisijungia prie tam tikros DNR sekos. · Tiesiogiai ar netiesiogiai kontaktuoja su transkripcijos aparatu. TRANSKRIPCIJOS REPRESORIAI. · Nors transkripcijos receptoriai eukariotuose reti, neigiamoji reguliacija vis tiek vyksta. · Paprastai neigiami signalai veikia stabdydami aktyviklius arba RNR polimerazę. · Eukariotų transkripcijos represoriai veikia įvairiais būdais: o Gali prisijungti prie transkripcijos veiksnių, uždengdami jų įnašos į branduolį sekas, kad transkripcijos veiksniai nepakliūtų į branduolį. o Gali prisijungti prie transkripcijos aktyviklių ir uždengti jo funkcinius domenus. · Vienas iš būdų neleisti aktyvikliui prisijungti - užimti jo atpažinimo vietą DNR. Tokio valdymo pavyzdys galėtų būti CAAT dėžutė, dažnai aptinkami eukariotų promotoriuose. Paprastai CAAT