Métodos em Biologia Molecular PDF

4. Métodos em Biologia Molecular Course Arquitetura Molecular Status completed Task Dogma central da biologia molecular: DNA pode dar origem a novo DNA por replicação...

4. Métodos em Biologia Molecular Course Arquitetura Molecular Status completed Task Dogma central da biologia molecular: DNA pode dar origem a novo DNA por replicação DNA pode dar origem a RNA num processo conhecido como transcrição RNA pode dar oridam a proteína por um processo denominado tradução níveis elevados de mRNA normalmente estão relacionados com elevados níveis de proteína Extração de DNA ou RNA Duas técnicas princiapis: clorofórmio e kits comerciais 4. Métodos em Biologia Molecular 1  Quantificação de ácidos nucleicos Por espetrofotometria Os anéis das bases (A, C, G, T, U) são formados por ligações simples e duplas alternadas. Essas estruturas em anel absorvem no U.V. (ultravioleta). Cada uma das quatro bases nucleotídicas tem um espectro de absorção ligeiramente diferente, e o espectro do DNA é a média delas. Pico de absorção das bases não varia muito dos 260nm mas é importante ter em conta se o analito é DNA de cadeia simples ou dupla As duas cadeias de DNA são mantidas por interações não covalentes pontes de hidrogénio e base stacking Como estas interações são relativamente fracas, é fácil quebrar a temperaturas fisiológicas Quando o DNA fica desnaturado (cadeia simples) a absorbência aumenta cerca de 30% Lei de Lambert-Beer 4. Métodos em Biologia Molecular 2  Permite quantificar DNA e RNA pois os valores de coeficiente de extinsão são bem conhecidos o mesmo não acontece com proteína (cada aminoácido tem o seu valor de coeficiente de extinsão, tornando impossível o uso desta fórmula) A um comprimento de onda de 260 nm, o coeficiente de extinção médio (uma característica que determina o quão fortemente uma espécie absorve ou reflete radiação ou luz num comprimento de onda específico) para DNA de dupla hélice é de 0,020 (μg/ml)−1 cm−1, para DNA de cadeia simples é de 0,027 (μg/ml)−1 cm−1, e para RNA de cadeia simples é de 0,025 (μg/ml)−1 cm−1. Com base nesses cálculos, um A260 de 1,0 (em cubetes comuns de 1 cm) indica: 50 μg/ml de DNA de dupla hélice ~ 37 μg/ml de DNA de cadeia simples ~ 40 μg/ml de RNA de cadeia simples Nanodrop instrumento de espetrofotometria cuja vantagem é a utilização de muito pouca solução de ácido nucleico (1 ou 2 uL) é muito rápido e tem um programa incorporado que realiza o cálculo dos rácios 260/280 e 260/230 Rácio A260/280: permite-nos ver se a amostra de DNA ou RNA é pura rácio de 1.8 significa que é “pura” para DNA rácio de 2.0 significa que é “pura” para RNA se analizamos RNA e nos dá um rácio de 1 (260/280) isto significa que há uma contaminação proteica (ou de outros componentes que absorbem a ~280nm) 4. Métodos em Biologia Molecular 3  Rácio A260/230: usado como medida de verificação da pureza do ácido nucleico valores esperados entre 2.0-2.2 valores abaixo indica contaminação que absorevem a 230nm como EDTA, fenol, Guanidina HCl e TRIzol Bioanalyzer (integridade do RNA): análise espetofotométrica não nos dá uma ideia da integridade do RNA (apenas tem a ver com o espetro de absorção) eletroforese em gel de agarose permite observar se o RNA está íntegro (se houver uma banda bem definida). Se não estiver aparece uma banda difusa muito grande que começa a aparecer a pesos moleculares muito baixos (imagem do meio) Eletroforese em gel de agarose Permite a análise de ácidos nucleicos Agarose - matriz usada na eletroforese funciona como uma gelatina que solidifica a temperatura ambiente 4. Métodos em Biologia Molecular 4  DNA/RNA naturalmente carregado negativamente Na forma linear migra de acordo com a sua massa molecular Ácidos nucleicos têm de ser corados para ser visíveis - brometo de etídio já não é muito utilizado pois é carcinogénio Gel de poliacrilamida tem uma rede mais apertada, podendo ser possível observar os diferentes nucleotídeos (não é possível num gel de agarose) DNA ladder strand - Inclusion of a DNA ladder (DNAs of known sizes) on the gel makes it easy to determine the sizes of unknown DNAs. 4. Métodos em Biologia Molecular 5  Polymerase Chain Reaction 2 primers são necessários - sequência de interesse estará entre os dois primers (essa zona é flanqueada e amplificada) Técnica in vitro para a amplificação de uma região de DNA que se encontra entre duas regiões de sequência conhecida. A amplificação por PCR é realizada utilizando primers de oligonucleotídeos. Estes são tipicamente oligonucleotídeos curtos e de fita simples, que são complementares às regiões externas de sequência conhecida. Os oligonucleotídeos servem como primers para a DNA polimerase, e as fitas desnaturadas do grande fragmento de DNA servem como o molde. 1- Desnaturação 2- “Annealing” (ligação dos primers) 3- Elongação 3 passos: Requer: DNA molde 2 primers específicos que determinam o início e o fim da região a amplificar Taq DNA polimerase (termorresistente obtida a partir da bactéria Thermus aquaticus) 4. Métodos em Biologia Molecular 6  Nucleótidos Escolha da DNA polimerase deve ser feita consoante o fim a que se destina qPCR Ideia deste PCR é quantificar mRNA (transcritos) - para isso é necessário usar uma transcriptase reversa Um método que permite acompanhar em tempo real (por isso também é chamado de PCR em Tempo Real) a amplificação de um alvo. O alvo pode ser ácidos nucleicos (RNA ou DNA). A Taq polimerase só pode sintetizar DNA É possível analisar RNA pois o mRNA pode ser copiado a uma cadeia de DNA complementar (cDNA) DNA polimerase usa ssRNA como template 4. Métodos em Biologia Molecular 7  corante fluorescente → utilizado para visualizar o progresso da reação de PCR. Esse corante está presente como quencher num terceiro primer (a chamada sonda Taq- man), que se anela entre os dois primers de PCR e se torna visível apenas quando essa sonda é removida pela progressão da polimerase, ou está presente como um corante geral que se liga apenas ao DNA de fita dupla. Em ambos os casos, a quantidade de fluorescência é proporcional à quantidade de produto de PCR formado. 4. Métodos em Biologia Molecular 8  SYBR green é uma molécula que emite fluorescência apenas quando se intercala na cadeia dupla de DNA. 4. Métodos em Biologia Molecular 9  no início o termociclador não consegue detetar a fluorescência dos primeiros ciclos CT - ciclo em que o se atinge a fase exponencial Digital PCR Método pelo qual uma amostra é diluída e particionada de modo que moléculas de um único molde possam ser amplificadas individualmente, cada uma em uma partição separada, e os produtos detectados usando sondas fluorescentes. necessário realizar uma curva de calibração com DNA conhecido para poder fazer uma quantificação absoluta de uma amostra - utilizado muito na medicina sistema muda de marca para marca Pode-se realizar PCR digital em chips e discos microfluídicos, microarranjos e microgotículas ou cristais de gotículas baseados em 4. Métodos em Biologia Molecular 10  emulsões de óleo-água e, mais recentemente, em placas semelhantes ao qPCR 3 é o máximo de moléculas que pode entrar no droplet - primers só se ligam a droplets com target DNA - PCR só ocorre nas verdes e depois há uma deteção da fluorescência 4. Métodos em Biologia Molecular 11  Blotting Southern Blotting usado para quantificação de DNA Sondas: Complementar à cadeia de ácido nucleico de interesse Marcação de sondas: Radioactivamente (com radioisótopos) Com grupos químicos (como digoxigenina, biotina) Com grupos fluorescentes (como fluoresceína-FITC, rodamina) Hibridação Processo que permite que duas cadeias de DNA complementares possam voltar a formar uma dupla hélice. Reacções similares podem ocorrer com qualquer cadeia de ácidos nucléicos complementares (DNA/DNA; RNA/RNA; DNA/RNA) Northern Blotting usado para quantificação de RNA 4. Métodos em Biologia Molecular 12  Hibridização in situ: permite a deteção de uma sequência de ácidos nucleicos específica em células ou tecidos usa uma cadeia de DNA, RNA ou ácidos nucleicos modificados - probe - que se pode ligar a: cromossomas (após desnaturação com DNA) RNA Western Blot 4. Métodos em Biologia Molecular 13  Lysis buffer: essencial necessário garantir que a amostra não é oxidada proteção contro hidrólise e oxidação escolha tem de ter em consideração aplicações downstream deve estabilizar e solubilizar a proteína de interesse deve ser iso-osmótica (0.25M sucrose) para manter a integridade do organelo (se necessário) Solubilização proteica A solubilidade é governada principalmente por fatores eletrostáticos, como a presença de cadeias laterais de aminoácidos ionizáveis e pela exposição de resíduos carregados em soluções aquosas. A proteína é geralmente menos solúvel em um pH igual ao seu pI. Relativamente poucas proteínas têm seus valores de pI entre pH 7 e 8, que coincidem com a faixa de pH fisiológica. Durante a preparação da amostra, a concentração e o tipo de sal, o pH e o tipo e concentração de aditivos devem ser controlados. composição do buffer: 4. Métodos em Biologia Molecular 14  sais (NaCl) buffer (Tris, fosfato) - para manter o pH detergentes (TX-100, SDS) - preciso para garantir que a proteína continua solúvel - pode ser necessário usar agentes caotrópicos em vez de detergentes agentes caotrópicos (ureia - 8M - e guanidinahidrocloreto - 6M) Buffers com baixo rigor - TBS-T: Preserva a maioria das interações proteicas e a atividade enzimática Baixa solubilidade para proteínas de membrana Compatível com a maioria das aplicações subsequentes Receita: 50 mM Tris, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,1% Triton X100; Mistura de inibidores de protease e fosfatase Buffers com elevado rigor - RIPA: Preserva apenas interações proteicas fortes (por exemplo, anticorpo- antígeno) Compromete a conformação e a atividade da proteína Alta solubilidade para todos os tipos de proteínas Interfere com alguns métodos de quantificação de proteínas (por exemplo, Bradford) Receita: 50 mM Tris, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,1% SDS; 0,5% DOC; 1% Nonidet P40; Mistura de inibidores de protease e fosfatase DICA: Ao trabalhar com uma proteína hidrofóbica, sempre teste a solubilidade em buffers com diferentes misturas de detergentes. Clarificação: Usado para remover agregados de proteínas e detritos celulares Geralmente alcançado por centrifugação em alta velocidade (16.000 g) ou através de um filtro com um tamanho de poro de 0,45 μm 4. Métodos em Biologia Molecular 15  O DNA é altamente viscoso e deve ser fragmentado por sonicação ou tratamento com DNase DICAS: Certifique-se de que a proteína de interesse esteja solubilizada antes de clarificar as amostras. Quantificação proteica: lei de Lambert-Beer Incompatibilidade com detergente dá origem à impossibilitação do uso de SDS PAGE - Polyacrilamide gel electrophoresis pode ser nativo ou desnaturante (SDS-PAGE) num SDS-PAGE apenas o peso molecular tem influência na deteção proteica num nativo pretede-se detetar interações proteína-proteína e multímeros proteicos 4. Métodos em Biologia Molecular 16  SDS-PAGE método mais usado para análize quantitativa de misturas proteicas particularmente importante na monitorização de purificação proteica usado para determinar a massa molecular relativa de proteínas SDS: As proteínas são desnaturadas e solubilizadas pelo SDS — ou seja, a proteína é rodeada por moléculas de SDS. A interação entre o SDS e a proteína é forte o suficiente para tornar a composição do complexo proteína-SDS essencialmente independente do pH. O forte efeito de solubilização do SDS torna praticamente todas as proteínas negativamente carregadas. Todos os complexos proteína-SDS adquirem a mesma conformação em forma de bastão e diferem apenas em tamanho. 4. Métodos em Biologia Molecular 17  beta-mercaptoetanol ou DTT-ditiotreitol: agente redutor quebra pontes dissulfureto Staining do gel - um n.º significativo de proteínas apresentam migração abnormal durante SDS-PAGE devido a interações com o SDS ou por modificações pós- traducionais Western blot (ou immunoblot) - deteta proteínas específicas num extrato ou homogenado tecidular após extração eletroforética → proteínas são depois transferidas para uma membrana de PVDF ou nitrocelulose, onde são coradas com anticorpos específicos à proteína-alvo transferências: wet - muito eficazes mas caras devido à elevada quantidade de buffer 4. Métodos em Biologia Molecular 18  semi-dry - menos eficazes mas mais rápidas e baratas (3-7mins no turbo-blot ou 15-45mins) Staining da membrana: reversível - Ponceau e corantes fluorescentes compatíveis com imunodeteção irreversíveis - Coomassie e preto de amido são mais sensíveis mas interferem com imunodeteção Este passo deve ser feito para: assegurar a transferência garantir que o loading feito foi igual em todos os poços cortar a membrana para poupar em solução com anticorpo Probing com anticorpo: cortar a membrana usando markers como referência remoção do Ponceau blocking (BSA; leite; detergente; solução comercial) incubação com anticorpo Imunodeteção: 4. Métodos em Biologia Molecular 19  Quantificação de sinal - fatores a considerar: sensivbilidade linear dynamic range - intensidade de sinal proporcional à quantidade proteica estabilidade de sinal normalização in-lane rácio sinal-background 4. Métodos em Biologia Molecular 20  Imunocitoquímica: anticorpo liga-se ao antigénio de um modo específico diretamente à célula ou ao tecido dá um localização espacial pode ser usado para localizar proteínas e células específicas pode ser usado para quantificar eventos celulares - apoptose Imunofluorescência - permite a co-localização proteica Blue native PAGE: técnica que permite a resolução de complexos proteicos pelo peso molecular mantendo a estrutura nativa por eletroforese de gel atua utilizando Coomassie-Blue-G250 para revestir proteínas com a carga negativa necessária à migração para o ânodo complexos proteicos migram pelo gel de acordo com o tamanho específico do poro no gel com um gradiente de acrilamida - migram até ao seu tamanho 4. Métodos em Biologia Molecular 21  específico Focagem isoelétrica: Baseia-se no facto di grupo variável dos aminoácidos poder ter cargas específicas de acordo com o pH Difference gel electrophoresis (DIGE) 4. Métodos em Biologia Molecular 22  Co-imunoprecipitação: 3 métodos: beads acopladas a anticorpos (por exemplo, anticorpos epítopos, HA, Flag, myc, V5) incubação do anticorpo com a amostra e recolha de complexos anticorpo- proteína com agarose ligação covalente de anticorpos com resinas ativadas Pull-down assay - permite medir ligações proteína-proteína sem uso de anticorpos 4. Métodos em Biologia Molecular 23  MALDI-MS Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Mass Spectroscopy Massa do aminoácido é essencial para a identificação proteica e da sequência peptídica 4. Métodos em Biologia Molecular 24 4. Métodos em Biologia Molecular 25