Arquitetura Molecular e Quantificação de Ácidos Nucleicos
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Questions and Answers

Qual é o processo pelo qual o DNA se transforma em RNA?

  • Transcrição (correct)
  • Desnaturação
  • Tradução
  • Replicação

    • Qual é a relação entre os níveis de mRNA e os níveis de proteína?

  • Níveis baixos de mRNA estão relacionados com elevados níveis de proteína.
  • Níveis elevados de mRNA normalmente estão associados a elevados níveis de proteína. (correct)
  • Níveis de mRNA não influenciam os níveis de proteína.
  • Níveis elevados de mRNA estão relacionados com níveis baixos de proteína.

    • O que são as interações que mantêm as duas cadeias de DNA unidas?

  • Interações covalentes fortes
  • Ligações iônicas
  • Ligações peptídicas
  • Interações não covalentes (correct)

    • Qual técnica é utilizada para quantificar ácidos nucleicos?

    <p>Espectrofotometria</p> Signup and view all the answers

    Qual é a consequência do DNA ficar desnaturado?

    <p>A absorbência aumenta cerca de 30%.</p> Signup and view all the answers

    Qual é o propósito principal do qPCR?

    <p>Quantificar mRNA</p> Signup and view all the answers

    O que é necessário para que o mRNA seja analisado utilizando qPCR?

    <p>Transcrição reversa para cDNA</p> Signup and view all the answers

    Qual corante é utilizado para visualizar o progresso da reação de PCR?

    <p>SYBR green</p> Signup and view all the answers

    Como funciona a sonda Taq-man?

    <p>Ela se torna visível quando é cortada pela polimerase</p> Signup and view all the answers

    Qual é a função da Taq polimerase?

    <p>Sintetizar DNA</p> Signup and view all the answers

    O que indica o ciclo CT no processo de qPCR?

    <p>Ciclo em que o limite de detecção é atingido</p> Signup and view all the answers

    Como o Digital PCR difere do método tradicional?

    <p>Particiona a amostra para amplificação individual</p> Signup and view all the answers

    Qual é um dos desafios iniciais no uso de termocicladores durante o PCR?

    <p>Não detectar fluorescência nos primeiros ciclos</p> Signup and view all the answers

    Qual o coeficiente de extinção médio para o DNA de cadeia simples a 260 nm?

    <p>0,027 (μg/ml)−1 cm−1</p> Signup and view all the answers

    O que indica um valor A260 de 1,0 para DNA de dupla hélice?

    <p>50 μg/ml</p> Signup and view all the answers

    Qual valor de rácio A260/280 indica que uma amostra de DNA é considerada 'pura'?

    <p>1.8</p> Signup and view all the answers

    Qual é o valor esperado para o rácio A260/230 em amostras de ácido nucleico puras?

    <p>2.0 a 2.2</p> Signup and view all the answers

    Qual é a vantagem do uso do Nanodrop em relação a outros métodos de espectrofotometria?

    <p>Uso de muito pouca solução de ácido nucleico</p> Signup and view all the answers

    O que significa um rácio A260/280 de 1 quando se analisa RNA?

    <p>Contaminação proteica</p> Signup and view all the answers

    Qual método permite observar a integridade do RNA de forma direta?

    <p>Eletroforese em gel de agarose</p> Signup and view all the answers

    Quais contaminantes podem causar valores abaixo do esperado no rácio A260/230?

    <p>EDTA, fenol, Guanidina HCl e TRIzol</p> Signup and view all the answers

    Qual a função do beta-mercaptoetanol ou DTT-ditiotreitol em biologia molecular?

    <p>Quebrar pontes dissulfureto</p> Signup and view all the answers

    Qual é um dos principais objetivos do Western blot?

    <p>Detetar proteínas específicas</p> Signup and view all the answers

    Qual das opções é uma desvantagem do método de transferência wet em Western blot?

    <p>Elevados custos devido ao consumo de buffer</p> Signup and view all the answers

    Qual das seguintes opções descreve um tipo de corante utilizado para staining reversível?

    <p>Ponceau</p> Signup and view all the answers

    Durante a imunodeteção, qual passo é necessário após a remoção do Ponceau?

    <p>Realizar o blocking</p> Signup and view all the answers

    Ao realizar quantificação de sinal em Western blot, qual fator é importante considerar?

    <p>Rácio sinal-background</p> Signup and view all the answers

    Qual é a função do blocking durante o processo de imunodeteção?

    <p>Prevenir a ligação não específica do anticorpo</p> Signup and view all the answers

    Qual é a função principal do lysis buffer na preparação de amostras?

    <p>Garantir a estabilidade e solubilidade da proteína de interesse.</p> Signup and view all the answers

    Qual é uma das limitações do método semi-dry de transferência em Western blot?

    <p>Menor eficácia em comparação ao método wet</p> Signup and view all the answers

    O que deve ser considerado ao escolher um lysis buffer para aplicações downstream?

    <p>Compatibilidade com a amostra e as interações proteicas.</p> Signup and view all the answers

    Qual dos seguintes componentes é geralmente utilizado para manter o pH em um buffer?

    <p>Tris.</p> Signup and view all the answers

    Por que as proteínas geralmente têm baixa solubilidade em um pH igual ao seu pI?

    <p>Porque as interações eletrostáticas são minimizadas.</p> Signup and view all the answers

    Qual dos seguintes buffers é considerado com baixo rigor?

    <p>TBS-T.</p> Signup and view all the answers

    Qual é a característica principal do buffer RIPA?

    <p>Preserva apenas interações proteicas fortes.</p> Signup and view all the answers

    O que pode ser necessário utilizar em vez de detergentes para garantir a solubilidade das proteínas?

    <p>Agentes caotrópicos.</p> Signup and view all the answers

    Qual é a composição básica do buffer TBS-T?

    <p>50 mM Tris, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,1% Triton X-100.</p> Signup and view all the answers

    Study Notes

    Arquitetura Molecular

    • O dogma central da biologia molecular descreve o fluxo de informação genética: o DNA pode ser replicado, transcrito para RNA e traduzido para proteína.
    • Níveis elevados de mRNA geralmente estão relacionados com níveis elevados de proteína.
    • Existem duas técnicas principais para extração de DNA ou RNA: clorofórmio e kits comerciais.

    Quantificação de ácidos nucleicos

    • A absorção no ultravioleta (UV) por bases nucleotídicas é um método usado para quantificar DNA e RNA.
    • As bases nucleotídicas (A, C, G, T e U) absorvem a luz UV devido às suas estruturas cíclicas com ligações simples e duplas alternadas.
    • O pico de absorção do DNA e RNA é perto de 260 nm.
    • O espectro de absorção do DNA é a média dos espectros de absorção de cada base nucleotídica.
    • O DNA de cadeia simples absorve mais luz UV do que o DNA de cadeia dupla devido à desestabilização das interações não covalentes entre as duas cadeias.
    • A Lei de Lambert-Beer é um método para quantificar as concentrações de DNA e RNA.
    • O coeficiente de extinção médio a 260 nm para DNA de dupla hélice é 0,020 (μg/ml)−1 cm−1, para DNA de cadeia simples é 0,027 (μg/ml)−1 cm−1 e para RNA de cadeia simples é 0,025 (μg/ml)−1 cm−1.
    • Nanodrop é um instrumento que usa um volume muito pequeno de amostra para quantificar ácidos nucleicos.
    • O Rácio A260/280 indica a pureza da amostra de DNA ou RNA:
      • 1.8 para DNA puro
      • 2.0 para RNA puro
      • Um rácio de 1.0 para RNA indica contaminação proteica.
    • O Rácio A260/230 é usado para avaliar a pureza do ácido nucleico e valores entre 2.0-2.2 são esperados.
    • O Bioanalyzer analisa a integridade do RNA através da eletroforese em gel de agarose, revelando a presença de uma banda definida.
    • A qPCR (PCR em tempo real) é usada para quantificar mRNA (transcritos) através da amplificação de DNA usando uma transcriptase reversa.
    • A Digital PCR quantifica moléculas de DNA individuais em uma amostra por divisão em partições separadas para amplificação.

    Solubilização proteica

    • Lysis buffer é essencial para a extração proteica, pois protege a amostra da oxidação e hidrólise, estabiliza e solubiliza proteínas.
    • A escolha do lysis buffer depende da aplicação "downstream".
    • A solubilidade das proteínas é influenciada por fatores eletrostáticos, como a presença de cadeias laterais de aminoácidos ionizáveis e a exposição de resíduos carregados em soluções aquosas.
    • O pH e a concentração de sais influenciam a solubilidade proteica.
    • Detergentes (TX-100, SDS) e agentes caotrópicos (ureia 8M, guanidinahidrocloreto 6M) aumentam a solubilidade proteica.
    • Buffers com baixo rigor mantêm interações proteicas e atividade enzimática, mas têm baixa solubilidade para proteínas de membrana, sendo compatíveis com a maioria das aplicações subsequentes.
    • Buffers com elevado rigor preservam apenas interações proteicas fortes, mas podem afetar a conformação e atividade da proteína.

    Técnicas para análises proteicas

    • Beta-mercaptoetanol ou DTT são agentes redutores que quebram pontes dissulfureto em proteínas.
    • SDS-PAGE é um método que separa proteínas de acordo com o seu tamanho.
    • Western blot (ou immunoblot) é um método para detectar proteínas específicas por meio de anticorpos.
    • Eletroforese em gel de agarose é um método para analisar o tamanho e integridade do RNA.
    • Transferências podem ser wet ou semi-dry para transferir proteínas de um gel para uma membrana.
    • Staining da membrana é usado para analisar a transferência de proteínas, comparar o "loading" e cortar a membrana para poupar em solução com anticorpo.
    • Ponceau e corantes fluorescentes são corantes reversíveis compatíveis com a imunodeteção.
    • Coomassie e preto de amido são corantes irreversíveis que interferem com a imunodeteção.
    • Probing com anticorpo é um passo fundamental no Western blot que envolve a incubação da membrana com anticorpos específicos para a proteína alvorejada.
    • Em Imunodeteção os anticorpos são detectados por meio de métodos como quimioluminescência ou fluorescência.
    • A quantificação do sinal deve considerar a sensibilidade, gama dinâmica linear, estabilidade de sinal, normalização "in-lane" and o rácio sinal-background.

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    Description

    Explore os conceitos fundamentais da arquitetura molecular, incluindo o dogma central da biologia molecular e a relação entre mRNA e proteínas. Aprenda sobre técnicas de extração de DNA/RNA e métodos de quantificação através da absorção UV, incluindo a Lei de Lambert-Beer.

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