Livret N°2 Microscopie Exam 2024-2025 PDF

UE3 BIOLOGIE CELLULAIRE LIVRET N°2 Microscopie Année 2024-2025 🎥🎥 Spot exam Fiche 1 SOMMAIRE I. GENERALITES................................................................................................................................... 3 II. LES TECHNIQUES D...

UE3 BIOLOGIE CELLULAIRE LIVRET N°2 Microscopie Année 2024-2025 🎥🎥 Spot exam Fiche 1 SOMMAIRE I. GENERALITES................................................................................................................................... 3 II. LES TECHNIQUES DE MICROSCOPIE............................................................................................. 4 A. Microscopie optique ou photonique............................................................................................. 4 1. La microscopie optique en lumière directe................................................................................... 6 2. La microscopie optique à contraste de phase.............................................................................. 6 3. La microscopie optique à fluorescence........................................................................................ 8 B. Microscopie confocale.................................................................................................................. 8 C. Microscopie électronique............................................................................................................. 9 1. Microscopie électronique à transmission (MET).......................................................................... 9 2. Microscopie électronique à balayage (MEB).............................................................................. 10 2 I. GENERALITES Quatre ordres de grandeur importants en biologie cellulaire Atome 0,2 nm = 2 Ångström(s) = 2 Å Ribosome 20 nm Bactérie ou mitochondrie 2 µm Cellule eucaryote 20 µm Les notions de taille sont importantes puisqu’en fonction de ce que l’on veut observer : - Utilisation de méthodes différentes. - Traitement des échantillons différent. Les conditions de qualité d’une analyse morphologique reposent sur : - La qualité de l’échantillon. - La qualité du microscope (résolution du microscope). Exemple : Observation du pouce à l’atome Echelle Structure à observer Caractéristiques de l’observation d’observation - Observation de la peau Pouce 20 mm Visible à l’œil nu. - Observation du relief de la peau Structure de la peau 2 mm Visible à l’œil nu. Différentes couches - Préparation de l’échantillon de peau 0,2 mm - Utilisation d’un microscope optique. - Préparation de l’échantillon Une couche de 20 µm - Utilisation d’un microscope optique cellules de peau Grossissement plus important. - Préparation de l’échantillon Mitochondrie 2 µm - Nécessite une grande résolution. - Préparation de l’échantillon Structure de la 0,2 µm à 0,2 nm - Utilisation d’un microscope électronique mitochondrie Permet de voir jusqu’à l’échelle de la molécule. 3 La théorie de la biologie cellulaire (1838 par Schleiden et Schwann) évolue : - Les cellules sont définies comme : Minuscules Incolores Transparentes o Difficiles à observer. II. LES TECHNIQUES DE MICROSCOPIE A. Microscopie optique ou photonique Principe : l’échantillon est éclairé par une source lumineuse constituée de photons. Trois grands types de microscopie optique selon la façon dont les photons interagissent avec l’échantillon Microscopie - Absorption de certaines longueurs d’onde de la lumière. en lumière directe Microscopie - Absorption de certaines longueurs d’onde de la lumière : à contraste de Avec un déphasage des différents rayons lumineux. phase - Emission de la lumière à une autre longueur d’onde que Microscopie celle d’origine. à fluorescence - Utilisation d’un fluorochrome : Rend fluorescent une structure de l’échantillon. Les limites de la microscopie optique sont : - La taille des structures observées : Permet l’observation de détails espacés de 0,2 µm. - La résolution : Définie par la longueur d’onde de la lumière visible : 0,4 à 0,7 µm. Le microscope optique permet par exemple l’observation de mitochondries ou bactéries : - Mais pas de leurs structures internes : Nécessite un microscope électronique. 4 Principe du microscope optique : - L’échantillon est éclairé par la source lumineuse. - La lumière passe à travers les cellules de l’échantillon qui sont transparentes. - L’objectif contient un grossissement. - L’oculaire permet d’observer l’échantillon : Contient un second grossissement. Les limites de l’observation en microscopie optique - L’espace entre les détails observés est inférieur à 0,2 µm : Les photorécepteurs de l’œil ne les distinguent pas. La résolution de l’œil Les deux points sont confondus. - L’espace entre les détails observés est supérieur à 0,2 µm : Les photorécepteurs de l’œil les distinguent. Les deux points sont distincts. - Deux ondes en phase : Le déphasage des Obtention d’une image brillante. ondes - Deux ondes en décalage de phase : (lié à la diffraction) Obtention d’une image pâle. La résolution - Plus la résolution est petite : Plus l’image aura de détails, de finesse. 5  1. La microscopie optique en lumière directe Principe : la lumière blanche émise par une lampe est concentrée sur la préparation et la traverse Technique la plus simple : - Utilisant pour l’observation : Des colorants spécifiques d’une molécule particulière : o Naturels ou non (chimiques/synthétiques). o Permettant le marquage. Une source lumineuse : o Les photons. 2. La microscopie optique à contraste de phase Principe : - Les structures biologiques ont un indice de réfraction différent : Ainsi, il est possible d’observer des cellules : o Sans préparation. o Sans coloration. o Dans leur milieu d’origine. - Le déphasage des rayons lumineux permet l’observation des cellules : Grâce à l’obtention d’une image avec différents niveaux de gris. Exemple : Cette technique est utilisée en culture cellulaire : - Afin d’observer les cellules vivantes dans leur milieu d’origine : Pour la surveillance quotidienne. 6  Préparation des échantillons pour l’observation en microscopie optique directe Différents fixateurs peuvent être utilisés : - Formol, formaldéhyde : Ils créent des ponts entre les protéines. - Alcools : Ils fixent les glucides. - Liquide de Bouin : Fixation Ensemble de différents fixateurs : formaldéhyde, acide picrique, acide acétique. Possibilité de cryofixation : fixation par le froid (azote/méthane) - Permet d’observer directement l’échantillon après coupe, sans passer par l’étape d’inclusion. - Dans un bloc de : Paraffine Résines : Inclusion o Acrylique o Époxy Celloïdine - Facilite la coupe. - Grâce à un microtome : Appareil contenant un couteau permettant de faire des lamelles très fines L’épaisseur varie en fonction du mode d’inclusion : Coupe o 5 µm dans la paraffine o Moins de 1 µm dans la résine. - Une fois coupées, les lamelles sont déposées sur une lame pour pouvoir être observées. - Adaptée en fonction de ce que l’on veut observer : Colorants naturels : o Eosine o Hématoxyline. Colorants synthétiques ou chimiques : Coloration o Giemsa. - Possibilité d’associer plusieurs colorants : Deux colorants : o Colorations bichromes Trois colorants : o Colorations trichromes. 7  3. La microscopie optique à fluorescence Principe : - Utilisation d’une source de lumière blanche filtrée : Permet l’isolement de la longueur d’onde qui excite la préparation. - Injection d’un fluorophore aux cellules par transfection : Pour rendre une structure de la cellule fluorescente. - L’image obtenue est inversée par rapport à celles obtenues en lumière directe : Les objets observés sont lumineux. Le fond est sombre. Les principaux fluorophores - Colore spécifiquement le noyau des cellules en bleu DAPI - Très utilisé - Ou FITC en fonction des lasers utilisés GFP - Spectre d’émission dans le vert - Ou mCherry ou Tomato Cyan 5 - Spectre d’émission dans le rouge Il est possible d’associer plusieurs fluorophores sur le même échantillon : - Jusqu’à 5-6. - Nécessite une reconstruction d’image : Les clichés de chaque fluorophore sont assemblés pour donner l’image finale. - Exemple : Noyau cellulaire en DAPI Cytoplasme des cellules en GFP B. Microscopie confocale Plus récent : microscopie apparue dans les années 1980. Caractéristiques : - Microscopie optique réalisée sur une très faible profondeur de champ (environ 400 nm). - En bougeant l’échantillon, obtention d’une série de photographies (acquisitions) : Permet une reconstruction de l’échantillon en 3D. - Fonctionne en lumière réfléchie ou fluorescente : La source de lumière est un laser : o Microscope confocal à balayage. - Très utilisée en biologie et en science des matériaux. 8  C. Microscopie électronique Utilisation d’une source différente de la microscopie optique : l’électron - Permet une meilleure résolution (jusqu’à x5 millions) : Car sa longueur d’onde est beaucoup plus petite que celle d’un photon. Grâce à des lentilles électrostatiques et électromagnétiques qui contrôlent le faisceau d’électrons. 1. Microscopie électronique à transmission (MET) C’est une technique : - Utilisant un matériel très onéreux : Coût d’un tel microscope : plusieurs millions d’euros. - Très sensible. - Nécessitant des échantillons de grande qualité. Exemples d’observations : - Mitochondrie : Visualisation des différentes crêtes. - Filaments d’actine. - Microtubules. Préparation des échantillons pour l’observation en microscopie électronique - Fixateurs : Glutaraldéhyde : o Il crée des ponts entre les protéines. Tétroxyde d’osmium : o Il fixe les lipides. - Cryofixation : cryomicroscopie Fixation Congélation brusque de l’échantillon : o Dans du propane ou de l’hélium liquide. Observation directe de la coupe. Pas d’utilisation de colorants ou de fixateurs chimiques o Préserve la morphologie et la structure des échantillons. Nécessite une reconstruction 3D. - Résines époxy : Inclusion Epon Araldite. - Au microtome : Grâce à un couteau de verre ou de diamant : Coupe Coupes ultrafines : o Environ 50 nm d’épaisseur o Déposées sur des grilles de cuivre de 3 mm de diamètre. 9 En microscopie électronique à transmission, il est possible de réaliser : - Un immunomarquage : Utilisant des anticorps couplés à des billes d’or : o Se fait avant la fixation. - De la tomographie : Consiste de reconstruire le volume d’un objet : Nécessite un travail informatique important : o Exemples : virus, structure d’une nouvelle protéine. Cryomicroscopie : Méthode d’étude utilisant la Microscopie Electronique à Transmission (MET). Avantages : - Pas d’utilisation de colorant ou de fixateur chimique. Inconvénients : - Utilisation de logiciels informatiques pour la reconstruction de l’image des structures observées. - L’échantillon doit être maintenu à une température très basse. 2. Microscopie électronique à balayage (MEB) Production d’images en haute résolution (x100 000). Repose sur le principe des interactions électrons-matière. - Utilisation d’une pellicule métallique permettant d’interagir avec la matière. Permet l’observation complète de la surface de l’échantillon : - Observation de spécimens dans leur globalité. Nécessite l’utilisation de logiciel informatique pour la reconstitution d’une structure. Exemple : observation d’un acarien. 10