UE3 Biologie Cellulaire - Examen 2024-2025 - PDF

UE3 BIOLOGIE CELLULAIRE LIVRET N°2 METHODES D’ETUDE PARTIE 2 Année 2024-2025 🎥🎥 Spot exam Fiche 1  III. LA CULTURE CELLULAIRE Les outils biologiques : types d’échantillons Prélèvement de tissu - Biopsie....

UE3 BIOLOGIE CELLULAIRE LIVRET N°2 METHODES D’ETUDE PARTIE 2 Année 2024-2025 🎥🎥 Spot exam Fiche 1  III. LA CULTURE CELLULAIRE Les outils biologiques : types d’échantillons Prélèvement de tissu - Biopsie. Prélèvement de sang - Cellules sanguines (hématies, lymphocytes). - Cellules modifiées : Lignées cellulaires Pour être rendues immortelles. - Cellules commercialisées : Culture primaire Durée de vie limitée à un nombre de passage. - Cellules souches. A. Intérêts des lignées cellulaires But : - Maintenir les cellules vivantes en culture. - Obtenir une prolifération pour faire des analyses. Technique de maintien des lignées cellulaires in vitro : - Création d’un environnement artificiel qui se rapproche le plus possible de l’environnement physiologique (homéostasie) : Permet la croissance.  Sert à la recherche ou en laboratoire d’analyse. Intérêts des lignées cellulaires - Certaines analyses nécessitent des millions de cellules : La quantité Dans un prélèvement la quantité de cellules est limitée. La conservation des - Garde les caractéristiques physiologiques du tissu initial : caractéristiques du Les cellules de la lignée ont les mêmes caractéristiques que la tissu initial cellule du patient dont elles sont issues. - On part d’une seule cellule (=clone) et non pas d’une population Homogénéité cellulaire : Toutes les cellules sont identiques. - Les cellules poussent dans un milieu spécifique avec des Contrôle de caractéristiques données : l’environnement Par exemple : il est possible de mimer un environnement qui cause une pathologie. - Très utilisés. - Participent à la mise en place de nombreux vaccins. - Permettent l’élaboration de cibles thérapeutiques : Modèles d’études Chimiothérapie. - Permettent une meilleure compréhension des pathologies. - Constituent des outils thérapeutiques : Thérapie cellulaire. 2  B. Matériels et instruments En fonction des cellules utilisées : - Gestion des niveaux de sécurité. Eléments indispensables pour faire de la culture cellulaire - Salle réservée à la culture cellulaire. - A usage unique. - Stérilisation des instruments réutilisables grâce à un Matériel stérile autoclave : Par la chaleur et la pression. Nécessite une habilitation particulière. - Poste de sécurité microbiologique (PSM) = hotte à flux laminaire : Ne pas introduire trop d'objets. Enceinte pour manipuler les Seulement du matériel propre et stérile. cellules Procéder régulièrement à des désinfections (avant et après utilisation). Ne pas utiliser de sources de chaleur. - Dans un incubateur : Maintien des cellules dans un Température de 37°C. environnement particulier Hygrométrie adaptée = taux d‘humidité. Pourcentage de CO2 spécifique. Microscope - Permet l’observation quotidienne des cellules. - Se lave les mains avant et après. - Porte des gants (à usage unique) et une blouse (dédiée à cette salle). - Attache ses cheveux (+/- mettre une charlotte). Manipulateur - Nettoie son plan de travail avant et après manipulation : Avec des détergents ou de l’éthanol. - Utilise du matériel stérile. Fonctionnement du PSM : - L’air est filtré pour rendre l’environnement stérile, puis il est redistribué dans la pièce où se trouve le manipulateur : L’échantillon est protégé, mais pas le manipulateur ! Interdiction d’utiliser des solvants : o Les solvants s’utilisent sous des sorbonnes : extraction de l’air vers l’extérieur du bâtiment (protège le manipulateur ++). 3 Malgré ces précautions, il existe différents types de contaminations possibles : - Chimiques : Par des endotoxines présentes sur les plastiques, dans les milieux de culture, dans les détergents, … - Biologiques : Par des bactéries, levures/moisissures, virus : o Lors d’une erreur de manipulation. o Problème sur le PSM. o Acquise sur le patient. Par des mycoplasmes : o Contamination très silencieuse : demande du temps au manipulateur pour se rendre compte que la lignée est contaminée (se voit sur les résultats qui sont complétements faussés). - Croisées : Par le mélange de deux lignées cellulaires. Pour les éviter, on travaille une seule lignée cellulaire à la fois sous le PSM. C. Caractéristiques des lignées cellulaires Une lignée cellulaire peut être à durée de vie : - Limitée : Dégénérescence à n passages. Mais plus longue que les cellules primaires. - Illimitée = cellules immortelles : Les cellules cancéreuses. Les cellules rendues immortelles par un virus (SV40). Les cellules modifiées génétiquement. Deux types de cellules : - Cellules circulantes, non adhérentes : Exemple : les cellules sanguines (lymphocytes). - Cellules adhérentes : Exemples : les cellules d’organes (poumons, intestins). Les cellules sont décrites selon : - Leurs morphologies (forme, apparence …). - Leurs caractéristiques fonctionnelles particulières.  La plupart des lignées cellulaires sont caractérisées et commercialisées. 4  Les morphologies cellulaires - Attachées au substrat : adhérentes. Epithéliales - Forme plate et polygonale. - Ne se fixent pas au support : non-adhérentes. - Forme sphérique : Lymphoblastiques Moins de surface de contact avec le support de culture donc peu d’adhésion possible. - Attachées au support : adhérentes. Fibroblastiques - Forme allongée et bipolaire (capacité de bouger sur le support en se déformant). D. Conditions de culture L’environnement de culture doit se rapprocher le plus possible des conditions physiologiques (= conditions in vivo) : - Contenants stériles adaptés : En verre. En plastique majoritairement. - Milieu de culture : Contient des nutriments. Contient des facteurs de croissance. Paramètres physico-chimiques adaptés : o Température o pH o Oxygène o Osmolarité o Humidité (85%). Les deux types de milieux de culture - Contient les éléments chimiques nécessaires à la croissance des cellules : De l’eau. Une source de carbone et d’énergie (le glucose). Du sérum qui contient des facteurs de croissance, des hormones : Milieu de culture o Exemple : sérum de veau fœtal ou sérum de cheval. minimum Une source d’azote. Des sels minéraux. Des sources d’oligo-éléments. Un pH constant : o Son contrôle s’effectue grâce à un indicateur coloré (voir si les cellules vont bien). 5  - Enrichi. - Spécifique de la lignée cellulaire. - Contient des composants indéfinis : Des extraits de viande, de levures. Milieu de culture Des peptones. empirique Des liquides biologiques. Des facteurs de croissance, d’adhésion. Des hormones spécifiques. - Très riche en substances organiques. Le choix du milieu de culture se fait en fonction des besoins des cellules : - De la localisation anatomique. - De l’état de différenciation. Le choix du contenant dépend : - Du nombre de cellules disponibles : Les cellules n’apprécient pas avoir trop ou pas assez d’espace. E. Etablissement des lignées cellulaires - Fragmenté grâce à un cocktail enzymatique : obtention d’une A partir suspension cellulaire. d’une biopsie Placée dans un milieu de culture enrichi pendant plusieurs jours. d’organe - Prolifération des cellules du tissu (plusieurs populations cellulaires). ou de tissu - Sélection d’un clone d’intérêt. - Mis en contact avec du Ficoll (réactif) et centrifugation. Séparation des constituants en fonction de la densité. = fractionnement cellulaire. - Séparation des populations cellulaires obtenues : A partir Grâce à des anticorps spécifiques des cellules à isoler, couplés à d’un des billes magnétiques. prélèvement o Anticorps spécifiques des lymphocytes par exemple. sanguin Ou par cytométrie en flux : o Sélection en fonction des critères morphologiques des cellules (grâce à un laser). o Tri efficace ++ - Inconvénient : peu de matériel. 6  F. Conservation des lignées cellulaires Etapes de la congélation - En utilisant une lame de comptage : 1. Comptage des Permet d’obtenir la concentration cellulaire par millilitre. cellules - En utilisant un compteur de cellule : Donne le nombre de cellules vivantes et mortes. - Un million de cellules par ampoule de congélation. - Doit être rapide. - Dans un milieu contenant : 2. Congélation Du sérum ou du milieu de culture. 10 % de DMSO : o Cryo-protecteur qui protège les membranes cellulaires des cristaux lors de la congélation. 3. Conservation à - Dans un cryo-conservateur rempli d'azote liquide. -195°C - Ou dans un congélateur (-150°C). Les avantages / inconvénients d’utiliser les lignées cellulaires : - Isolation d’un clone rapide, amplification de manière exponentielle. - La régulation change puisque la communication entres les cellules n’est plus la même qu’a l’état physiologique. - Le changement d’environnement peut affecter les propriétés cellulaires (pas les conditions physiologiques exactes). G. Utilisation des lignées cellulaires Pour l’étude de certains mécanismes physiologiques : Cycle cellulaire. Métabolisme. Régulation génique, … En médecine : Pour les greffes, autogreffes. Dans le dépistage de maladies génétiques. Dans la thérapie génique. En industrie pharmaceutique : - Pour l’élaboration et le test de nouvelles cibles thérapeutiques. Différentes analyses peuvent être réalisées sur des cellules issues de lignées cellulaires : - Tests de cytotoxicité : Pour déterminer la toxicité de molécules : o Par le calcul de la concentration inhibitrice à 50% = CI50. - Tests de migration cellulaire : Détermine la capacité des cellules à migrer dans certaines conditions. 7 Exemple : - Les cellules sont déposées sur une membrane avec des pores. - Puis, ajout d’une molécule qui a pour objectif de ralentir la migration des cellules cancéreuses. - Le lendemain, ajout du colorant (giemsa), qui permet de suivre la migration des cellules et ainsi voir l‘efficacité de la molécule étudiée. - Tests sur des organites ou des protéines : Libération du cytoplasme par rupture des membranes cellulaires : o Par choc osmotique, ultra-sons ou un broyage. Fractionnement cellulaire (= séparation contrôlée) sépare les organites du reste du cytoplasme o Les organites d’intérêts doivent rester intacts. IV. LES TECHNIQUES D’ANALYSE DES PROTEINES Les protéines sont très présentes dans le cytoplasme et les membranes : - Pour leur étude, la culture cellulaire ainsi que plusieurs autres techniques peuvent être utilisées : Le choix de la technique dépend de la question scientifique posée. A. La cytométrie Dans le cytomètre, les cellules passent une à une devant un laser : - Le cytomètre compte le nombre d’événements : un événement = une cellule. - Plusieurs types d’analyses possibles : Reconnaissance de protéines (marqueurs) : o Par reconnaissance d’une fluorescence. Tri cellulaire : o Par reconnaissance de la morphologie cellulaire. Etude du cycle cellulaire : o Permet de déterminer la phase du cycle dans laquelle se trouve la cellule à un moment donné. o Molécule cytostatique = molécule qui bloque la cellule dans une phase du cycle cellulaire.  On peut utiliser plusieurs lasers et des fluorophores différents. B. L’immunomarquage - Immuno-histochimie : utilisation d’un anticorps couplé à une enzyme. Utilisation d’un microscope optique en lumière directe. - Immuno-fluorescence : utilisation d’un anticorps couplé à un fluorophore. Utilisation d’un microscope optique à fluorescence. 8  C. Dosage ELISA C’est un dosage spectrophotométrique. C’est un test : - Facile à réaliser, rapide et colorimétrique. Il existe deux types de dosage : - ELISA indirect : dosage d’un anticorps - ELISA sandwich : dosage d’un antigène. Mise en évidence de la présence de l’anticorps/antigène recherché grâce à l’utilisation d’un anticorps secondaire couplé à une molécule capable de réagir avec un substrat : - L’ajout du substrat dans le milieu donne une coloration : L’intensité de la coloration permet de définir la concentration de la protéine cible : o Utilisation d’un spectrophotomètre, qui mesure la densité optique à une certaine longueur d’onde. o Pour quantifier, une gamme étalon est nécessaire, puits dont les concentrations en échantillon sont connues. D. Le fractionnement cellulaire 1. Fractionnement cellulaire par centrifugation Séparation des constituants d’un échantillon en fonction de taille et de la densité : Plus les éléments sont denses ou de taille importante, plus ils sédimentent rapidement : o Présence dans le culot. Plus les composants sont petits et de faible densité, plus il faut centrifuger rapidement et longtemps pour les faire sédimenter. 9  Il se fait à l’aide d’une centrifugeuse : - Cuve avec un axe central sur lequel est fixé un rotor : A godets fixes : o Le culot sera excentré de l’axe du tube. Ou à godets mobiles : o Le culot sera dans l’axe au fond du tube. La vitesse de centrifugation est exprimée en G (unité de mesure internationale) ou en tours par minute. Exemple : Centrifugation d’un homogénat cellulaire - Conservation du surnageant pour l’étape suivante. - Les éléments de densité importante sont dans le culot : À 1000 G Les cellules (Faible vitesse) Les noyaux Le cytosquelette - Conservation du surnageant pour l’étape suivante. - Les éléments de densité moyenne sont dans le culot : À 20 000 G Les mitochondries (Vitesse moyenne) Les lysosomes Les peroxysomes - Nécessite une ultracentrifugeuse. - Conservation du surnageant pour l’étape suivante. À 80 000 G - Les éléments de faible densité sont dans le culot : (Vitesse élevée) Les microsomes Les petites vésicules - Nécessite une ultracentrifugeuse : - On conserve le surnageant de l’étape précédente. À 150 000 G - Les plus petits éléments sont dans le culot : (Vitesse très élevée) Les macromolécules Les virus Les ribosomes Il est indispensable d’équilibrer les tubes dans la centrifugeuse : - 2 tubes en face à face doivent avoir le même poids pour éviter de casser le rotor. Le fractionnement cellulaire peut être réalisé en gradient : - Dépôt de l’échantillon (ici un mélange d’organites) dans une solution permettant de faire un gradient, par exemple une solution de saccharose : Séparation continue : selon la vitesse de sédimentation : o Donc en fonction de la densité, de la taille et de la forme de la structure. o Les composants à sédimentation rapide sont plus proches du fond du tube que les composants à sédimentation lente. 10  Séparation discontinue : selon le point d’équilibre de la structure (sédimentation à l’équilibre). 2. Fractionnement cellulaire par chromatographie sur colonne L’échantillon passe dans une colonne, au travers de billes, et se sépare en fonction du critère de séparation de la colonne : - La taille : chromatographie par filtration sur gel. - La charge : chromatographie par échange d’ions. - L’affinité : chromatographie par affinité. E. Western blot Il permet l’étude de l’expression des protéines avant ou après fractionnement des protéines de l’échantillon. Protocole : - Libération des protéines des cellules : Utilisation d’un détergent qui casse les membranes sans endommager la structure des protéines. - Electrophorèse : Dépôt des protéines sur un gel d’acrylamide : o Soumis à un courant par l’intermédiaire d’un tampon contenant des électrolytes. Séparation des protéines en fonction de : o Leur taille o Leur charge Coloration du gel au bleu de Coomassie : o Pour contrôler les quantités de protéines déposées dans les puits : elles doivent être équivalentes pour pouvoir interpréter les résultats. - Dépôt du gel sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF : Cette membrane est soumise à courant par l’intermédiaire d’un tampon contenant des électrolytes. o Les protéines migrent vers la charge positive. Transfert des protéines du gel sur la membrane (du - vers le +). Ajout d’un anticorps primaire qui reconnait spécifiquement la protéine cible. Ajout d’un anticorps secondaire couplé à un substrat qui reconnait spécifiquement l’anticorps primaire. Transfert de la membrane dans un lecteur : o Révélation des bandes grâce à la chimiluminescence. 11 Il existe les mêmes techniques pour détecter : - L’ADN : Le Southern blot - L’ARN : Le Northern blot F. Expérimentation animale Elle est très réglementée : - Nécessite un accord du ministère et une habilitation. - Soumis à des comités d’éthiques. Elle est utilisée pour tester des molécules et comprendre les pathologies. Exemple de l’utilisation de souris transgéniques : - Par greffe de cellules en culture, modifiées ou non. - On peut forcer les cellules à exprimer un gène, pour induire ou réduire une pathologie ou supprimer l’expression d’une protéine. - On peut greffer des cellules cancéreuses aux souris : Pour mimer la progression d’une tumeur. Pour mieux comprendre un mécanisme ou pour tester l’effet d’une cible thérapeutique. Pour suivre au quotidien la taille de la tumeur : o Grâce à un pied à coulisse. o Ou grâce à l’utilisation de cellules modifiée pour être luminescentes ou fluorescentes : mesure de l’intensité lumineuse grâce à un appareil. Alternative : - Reproduction d‘organes sur des micro-puces. 12