Inmunoensayos y medicina nuclear actualizada PDF

Laboratorio de inmunología y medicina nuclear. Patología clínica Antígeno Es cualquier sustancia que pueda representar sitios antigénicos (epítopo) para producir anticuerpos correspondientes: Antígenos Hormonas Proteínas Glicoproteínas Glicolípidos Haptenos Otros productos naturales Anticuerpos Se p...

Laboratorio de inmunología y medicina nuclear. Patología clínica Antígeno Es cualquier sustancia que pueda representar sitios antigénicos (epítopo) para producir anticuerpos correspondientes: Antígenos Hormonas Proteínas Glicoproteínas Glicolípidos Haptenos Otros productos naturales Anticuerpos Se producen en respuesta de una estimulación antigénica Existen 5 clases (isotipos): IgG o IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 IgM IgA o IgA1 e IgA2 IgD IgE Anticuerpos Todos los anticuerpos tienen fracciones constantes y variables La fracción variable es el sitio de interacción con los epítopos Anticuerpos policlonales Se generan a través de la inmunización con un antígeno que posee varios epítopos Los anticuerpos son específicos para cada uno de los epítopos Presentan una mayor avidez que anticuerpos monoclonales Anticuerpos monoclonales Se definen como anticuerpos homogéneos dirigidos contra epítopes específicos Se desarrollan utilizando técnicas biotecnológicas (hibridoma) Son muy útiles en la fabricación de inmunoensayos Pueden diferenciar entre isoenzimas, subtipos e isotipos de proteínas Inmunoensayos Son métodos de laboratorio clínico que se utilizan para detectar antígenos o anticuerpos: Para detectar antígenos à se preparan reactivos con el anticuerpo específico Para detectar anticuerpos à se preparan reactivos con el antígeno específico Clases de inmunoensayos Inmunoensayos por precipitación Es el método más simple de inmunoensayo sin el involucro de un marcador (label) La precipitación de complejos grandes antígeno – anticuerpo forma un enrejado que se puede observar a simple vista en el gel o líquido de manera cualitativa Su mayor desventaja es su baja sensibilidad Hasta 0.1 – 0.5 mg/dL Inmunoensayos por precipitación La precipitación formada se ve afectada por: Proporción antígeno/anticuerpos (zona de equivalencia) Avidez y especificidad de la reacción Temperatura pH Fuerza iónica del medio Inmunoensayos de partículas (aglutinación) Usan partículas inertes como marcadores: Eritrocitos Latex Metal La reacción Ag – Ac genera una aglutinación apreciable a simple vista Hemaglutinación Aglutinación en látex o gel Radioinmunoensayo Se usa un isótopo que emite radiación como marcador Yodo – 125 Tritio – 3 Yodo – 131 Carbono – 14 Fósforo - 32 Se mide con un contador para el tipo de radiación emitida Mejoró dramáticamente la sensibilidad y precisión de pruebas en 1965 Desventajas: Vida media del reactivo corta Requiere uso de protección para radiación Isótopos Radio Allergo Sorbent Test (RAST) Radioinmunoensayo útil para cuantificar IgE contra alergenos: Las moléculas de alergeno están unidas a un disco de papel Se añade suero del paciente Se realizan pasos de lavado Se añaden anti - IgE marcados radioactivamente Se miden con un contador de radiación gamma Inmunoensayo enzimático Desarrollados como alternativa a los radioinmunoensayos Utilizan enzimas como marcador del inmunocomplejo Ampliamente usados para medir: Proteínas séricas Hormonas Drogas Antígenos y/o anticuerpos dirigidos contra patógenos Formatos de EIA Competitivos Heterogéneos (con pasos de lavado) Inmunoensayo colorimétrico Inmunoensayo enzimático fluorescente Inmunoensayo enzimático quimioluminiscente No competitivos Homogéneo (sin pasos de lavado) Ensayo inmunológico por multiplicación enzimática (EMIT) Inmunoensayo fluorescente marcado con sustrato Inmunoensayo de reactivación de apoenzimas Inmunoensayo homogéneo inhibidor de enzimas Inmunoensayo de donante enzimático clonado Formatos de EIA Inmunoensayos enzimáticos Ventajas Desventajas Efecto enzimático ofrece buena sensibilidad (1 pg/mL) Complejidad para medir actividad enzimática en algunos casos Reactivos baratos y estables Constituyentes del plasma pueden afectar la actividad enzimática Gran variedad de formatos disponibles Ensayos homogéneos tienen menor sensibilidad que RIA Equipamiento barato y disponible No produce radiación Inmunoensayos fluorescentes Se usan fluorocromos como marcadores Requiere el uso de una fuente de luz a una longitud de onda óptima para excitar el fluorocromo Desventaja: Fluorescencia de fondo no específica Inmunoensayos fluorescentes Formatos disponibles: Microscopia fluorescente (cualitativo o semicuantitativo) Método fluoroinmunométrico Ensayo inmunofluorométrico de partición radial Fluoroinmunoensayo de resolución temporal Ensayo de polarización fluorescencia Inmunoensayo de transferencia de excitación de fluorescencia Citometría de flujo Se basa en la medición de la fluorescencia asociada a las células que han sido marcadas con anticuerpos monoclonales ligados a fluorocromos Las células pasan de una en una a través de un laser que detectan la fluorescencia y las propiedades de dispersión de luz Útil para la identificación de poblaciónes celulares diferenciadas por antígenos de superficie o intracelulares Fluorocromos utilizados en citometría de flujo Ejemplo de citometría de flujo Inmunoensayos quimioluminiscentes Usan moléculas quimioluminiscentes como marcadores Para emitir luz se lleva a cabo una reacción de oxido - reducción Quimioluminiscencia con esteres de acridinio Se utiliza peróxido de hidrógeno (H₂O₂) para oxidar el acridinio Metodología rápida y más sensible que radioinmunoensayo Electroquimioluminiscencia Requiere de compuestos electroquímicos para activar un ciclo continuo de oxido – reducción Las moléculas utilizadas son rutenio Ru(bpy)₃² y tetrapentilamonio (TPA) Cuando Ru(bpy)₃³ pasa a Ru(bpy)₃² se genera luz en la superficie de un electrodo Inmunocromatografía Inmunoensayos simple y rápido utilizados como POCT El analito fluye por un material poroso (nitrocelulosa) desde un puerto proximal hacia un puerto distal donde se encuentra una almohadilla absorbente que mantiene el flujo capilar Durante la dispensación de la muestra y el reactivo se lleva a cabo la formación de inmunocomplejos que son atrapados por antígenos/anticuerpos inmovilizados en la zona de detección para formar una línea de color La detección se lleva a cabo a simple vista Inmunocromatografía Medicina nuclear Medicina nuclear Implica la administración de radiofármacos a pacientes con fines diagnósticos y terapéuticos. Para la medicina nuclear terapéutica, parte de la radiación emitida debe ser absorbida por los tejidos objetivo para lograr el efecto deseado. Gammagrafía La gammagrafía representa imágenes fisiológicas a través de la administración al paciente una sustancia radiactiva en un órgano o tejido Utiliza detectores en forma de cámaras para determinar la distribución de radionúclidos Gammagrafía Los agentes comúnmente usados varían desde los: Glóbulos rojos marcados para evaluar el flujo sanguíneo Agentes que reflejan el metabolismo óseo (tecnecio-99m metileno difosfato [Tc-MDP]) Agentes que reflejan el metabolismo de la glucosa (18-flúor deoxi-glucosa [18-FDG]), en el caso del PET Agentes que se concentran en sitios de inflamación, como glóbulos blancos autólogos marcados con 111In (Indio) y 67Ga-citrato (galio) Gammagrafía Las aplicaciones clínicas incluyen la detección de: Tumores malignos Metástasis, Osteomielitis Infección de injerto vascular Enfermedad infecciosa multifocal Artriris reumatoide Vasculitis Enfermedad inflamatoria del intestino Sarcoidosis Fiebre de origen desconocido Infección de prótesis articulares. Radiofármacos La mayoría de los radiofármacos son una combinación de una molécula radioactiva, un radionúclido Permiten la detección externa y una molécula o fármaco biológicamente activo que actúa como portador y determina la localización y la biodistribución. Para unos pocos radiotrazadores (p. Ej., Yodo radioactivo, galio y talio), los átomos radiactivos en sí mismos confieren las propiedades de localización deseadas. Comprender el mecanismo y la justificación del uso de cada agente es fundamental para comprender los hallazgos normales y patológicos demostrados gammagráficamente. Radiofármacos Atributos deseados de radiofármacos La desintegración debería dar como resultado emisiones gamma de energía adecuada y en suficiente cantidad para la detección externa Vida media efectiva lo suficientemente larga solo para la aplicación prevista (horas) Libre, es decir, no estar contaminado ni por radionucleidos Alta actividad específica, es decir, radiactividad por unidad de peso (mCi / mg) El componente farmacéutico debe estar libre de toxicidad o efectos fisiológicos No debe disociarse in vitro o in vivo y debe estar fácilmente disponible o combinarse fácilmente Debe localizarse rápida y específicamente de acuerdo con la aplicación prevista Radionúclidos Radionúclidos El Tc-99m es el radionúclido más comúnmente usado debido a: Su fácil disponibilidad La energía favorable de su fotón gamma Su dosimetría favorable Su semivida casi ideal (6 horas) Otros radiofármacos Bibliografía McPherson, R. (2022). Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. Philadelphia: Elsevier. Basic Principles, Chapter 1, Radiopharmaceuticals. Nuclear Medicine: The Requisites.