ENSAIOS IMUNOLÓGICOS COM REAGENTES MARCADOS.pdf

17/08/2024 IMUNOLOGIA LABORATORIAL Profa. Dra. Thaisy Pacheco 1 1 Ensaios Imunológicos c...

17/08/2024 IMUNOLOGIA LABORATORIAL Profa. Dra. Thaisy Pacheco 1 1 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados 2 2 Imunoensaios É uma técnica de laboratório usada para detectar e quantificar substâncias específicas, como hormônios, drogas ou proteínas, em uma amostra. Baseia-se na reação entre um antígeno e um anticorpo. A formação do complexo antígeno-anticorpo pode ser medida por diversos métodos, fornecendo informações valiosas para diagnósticos médicos, pesquisa e aplicações industriais. É amplamente utilizada devido à sua sensibilidade e 3 especificidade. 3 1  17/08/2024 Imunoensaios A sensibilidade de um teste diagnóstico corresponde ao percentual de resultados positivos dentre as pessoas que tem uma determinada doença ou condição clínica. Imagine que o alvo representa todas as pessoas que realmente têm uma doença. Cada dardo que você acerta no alvo é um caso verdadeiramente detectado pela prova (verdadeiro positivo). Se você acertar todos os dardos no alvo, não deixando nenhum de fora, isso significa que o teste é muito sensível - ele é bom em identificar corretamente aqueles com a doença (não 4 deixa "doentes" de fora). 4 Imunoensaios A especificidade é a capacidade do mesmo teste ser negativo nos indivíduos que não apresentam a doença que está sendo investigada. Agora, imagine uma área ao redor do alvo, representando pessoas que não têm a doença. Cada dardo que você lança e fica fora do alvo (não atinge nem o alvo, nem a área ao redor) representa uma pessoa saudável corretamente identificada pelo teste (verdadeiro negativo). Se você conseguir lançar todos os seus dardos de forma que apenas acertem o alvo (doentes) e evite completamente a área ao redor (saudáveis), seu teste tem alta especificidade - ele é bom em identificar corretamente aqueles sem a doença (não marca "saudáveis" 5 como doentes). 5 Imunoensaios Qualitativo: Informam apenas se houve ou não uma reação. Semi-quantitativo: Informam no caso de diluições seriadas de amostra e qual delas houve reação. Quantitativos: Informam a quantidade absoluta do material NÃO-MARCADOS MARCADOS 6 6 2  17/08/2024 Imunoensaios Não marcados: detectam consequências da interação entre antígeno e anticorpo, mudanças no estado físico do antígeno: Aglutinação e Precipitação. 7 7 Imunoensaios Marcados: detectam a interação direta entre o antígeno e anticorpo: Imunofluorescência, ELISA, Citometria de Fluxo, Reação de WesternBlot, Radioimunoensaio. 8 8 Origens Inicialmente as reações dos imunoensaios ocorriam com reagentes não marcados, sendo necessário que se formasse grande quantidade de imunocomplexos para a visualização do fenômeno. Sensibilidade de detecção menor 9 9 3  17/08/2024 Origens Com a chegada da imunoquímica, implantaram-se métodos simples rápidos e sensíveis que utilizavam reagentes marcados. Normalmente não requerem equipamentos caros e preservam as características do material biológico. Sensibilidade de detecção maior 10 10 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados: Categorias Ensaios de Imunohistoquímica Ensaios com Marcadores Radioativos Ensaios Luminescentes Ensaios com Reagentes Fluorescentes Ensaios com Marcadores Enzimáticos 11 11 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados: Categorias Ensaios de Imunohistoquímica Ensaios com Marcadores Radioativos Ensaios Luminescentes Ensaios com Reagentes Fluorescentes Ensaios com Marcadores Enzimáticos 12 12 4  17/08/2024 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados ❖ Ensaios de Imuno-histoquímica: Junção da histologia e imunologia, com a finalidade de diagnóstico. ▪ É uma forma de avaliação de proteínas, identificando a sua presença ou quantidade, em uma amostra de algum órgão, obtida por biópsia ou retirada cirúrgica de alguma doença. É um exame que permite detecção de antígenos específicos em tecidos. 13 13 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados Ensaios de Imuno-histoquímica: “É um exame que permite detecção de antígenos específicos em tecidos.” As proteínas são responsáveis por exercer “tarefas” nas células; elas têm a função determinada pelo código existente nos genes. Por exemplo, as proteínas podem estimular uma célula a se diferenciar a fazer uma função específica, ou se multiplicar e formar mais células. 14 14 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados Ensaios de Imuno-histoquímica: Pode ser usada para: Rotina oncológica. Para a detecção de antígenos: ▪ Virais: Dengue, Febre amarela, etc. ▪ Bacterianos: Micobactérias, Leptospiras. ▪ Fungos: Histoplasma, Paracoccidioides. ▪ Protozoários: Toxoplasmose, Trypanossoma cruzi. 15 15 5  17/08/2024 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados Ensaios de Imuno-histoquímica: Após a retirada de material de um tumor, ele é colocado em parafina para conservação e, após, são feitos cortes que são colocados em lâminas e, após corados, são visualizados ao microscópio. 16 16 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados Ensaios de Imuno-histoquímica: 17 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados Ensaios de Imuno-histoquímica: GOMES, A. É. I.; PACHECO, T.; SANTOS, C. D. S. D.; PEREIRA, J. A.; RIBEIRO, M. L.; DARRIEUX, M.; FERRAZ, L. F. C. Functional Insights From KpfR, a New Transcriptional Regulator of Fimbrial Expression That Is Crucial for Klebsiella pneumoniae Pathogenicity. Frontiers in Microbiology, v. 11, 2021. 18 6  17/08/2024 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados: Categorias Ensaios de Imunohistoquímica Ensaios com Marcadores Radioativos Ensaios Luminescentes Ensaios com Reagentes Fluorescentes Ensaios com Marcadores Enzimáticos 19 19 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados ❖ Ensaios com marcadores radioativos: ▪ Utilizam um reagente marcado, antígeno ou anticorpo, para quantificar o antígeno ou o anticorpo da amostra. ▪ O composto desconhecido pode ser determinado pela medida da radioatividade emitida. ▪ O termo radioimunoensaio (RIE) é utilizado usualmente quando o componente marcado é o antígeno e ensaio imunorradiométrico (IRMA) quando o componente marcado é o anticorpo. ▪ O radioisótopo mais utilizado é o iodo-125. 20 20 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados ❖ Ensaios com marcadores radioativos: É um teste laboratorial desenvolvido em 1967 para a dosagem de anticorpos específicos IgE pela técnica de radioimunoensaio utilizando disco de papel como fase sólida para a impregnação de antígenos (alérgenos) RAST Diagnóstico de Alergias Trata-se de uma técnica com alta especificidade e sensibilidade, porém com elevado custo e grande risco operacional por manipular material radioativo. 21 7  17/08/2024 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados ❖ Ensaios com marcadores radioativos: De competição com antígeno marcado Inicialmente, uma quantidade conhecida de anticorpos específicos é colocada na fase sólida Em seguida, adiciona-se o antígeno marcado com iodo-125. Uma amostra de soro de um paciente suspeito é então acrescentada. O antígeno, se presente no soro, compete com o antígeno radioativo pelos sítios de ligação nos anticorpos. A concentração das moléculas antigênicas presentes na amostra é inversamente proporcional à leitura de radioatividade. Quando um aumenta o outro diminui. 22 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados ❖ Ensaios com marcadores radioativos: Inicialmente, antígenos são fixados na De competição com anticorpo marcado fase sólida. Em seguida, adiciona-se a amostra do paciente. Os anticorpos específicos e marcados iodo-125 são então acrescentados. Se a amostra for positiva haverá a formação de Ag Ac com o Ag do soro. A quantificação é feita em aparelho específico para a leitura da radioatividade. Quanto maior a quantidade de antígeno na amostra, maior será a ligação destes aos anticorpos, formando imunocomplexos, que serão retirados por lavagem e assim reduzindo a leitura da radioatividade. 23 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados: Categorias Ensaios de Imunohistoquímica Ensaios com Marcadores Radioativos Ensaios Luminescentes Ensaios com Reagentes Fluorescentes Ensaios com Marcadores Enzimáticos 24 24 8  17/08/2024 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados ❖ Ensaios Luminescentes: Quimioluminescência Tipo de reação química, que ao se processar gera energia luminosa. ▪ Baseados na emissão de luz produzida em algumas reações químicas de oxidação, aqui incluídos agentes quimioluminescentes derivados biologicamente. ▪ O composto químico Luminol, é um dos representantes mais conhecidos da quimioluminescência. 25 25 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados ❖ Ensaios Luminescentes: Quimioluminescência Tipo de reação química, que ao se processar gera energia luminosa. ▪ Quando em contato com o sangue, por exemplo, utiliza o ferro da hemoglobina como catalisador para a reação de liberação de luz. ▪ Esse composto é muito usado em perícia criminal, quando se quer investigar a presença de vestígios de sangue em uma cena de crime. Mesmo que o local tenha sido limpo, o luminol evidencia a presença do sangue 26 26 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados ❖ Ensaios Luminescentes: Quimioluminescência Tipo de reação química, que ao se processar gera energia luminosa. Laboratorialmente, hormônios, drogas e microrganismos podem ser identificados por testes colorimétricos. Utilizam-se de anticorpos ligados a um marcador luminescente (cromógeno) que pode ser o próprio luminol ou mais modernamente derivados de acridina, sistema avidina-biotina, entre outros. 27 27 9  17/08/2024 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados ❖ Ensaios Luminescentes: Quimioluminescência Uma microesfera de poliestireno é revestida com anticorpo monoclonal contra antígeno analisado. Adição do soro do paciente, que é incubado com agitação intermitente. Lavagem para retirada do antígeno não fixado. Adição de anticorpo monoclonal específico para o antígeno pesquisado conjugado com a enzima. Incubação do conjugado e mais uma lavagem para tirar o anticorpo não fixado. Adição do substrato da enzima, em seguida, incubação. A adição do substrato quimioluminescente sofre hidrólise na presença da Conjugado Y Anticorpo Monoclonal enzima produzindo substâncias instáveis. Quimioluminescência é um termo para produção de luz quando a energia de excitação é proveniente Antígeno do soro Substrato do paciente de uma reação química. 28 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados ❖ Ensaios Luminescentes: Quimioluminescência ▪ A emissão de luz pode ser detectada ou medida utilizando-se luminômetros com tubos fotomultiplicadores, diodo de silicone em estado sólido ou filme fotográfico como detector 29 Transformam a luz emitida em impulsos elétricos 29 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados 30 10  17/08/2024 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados: Categorias Ensaios de Imunohistoquímica Ensaios com Marcadores Radioativos Ensaios Luminescentes Ensaios com Reagentes Fluorescentes Ensaios com Marcadores Enzimáticos 31 31 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados ❖ Ensaios com marcadores fluorescentes Baseia-se na detecção de substâncias fluorescentes (fluorocromos), geralmente acoplados a anticorpos. Citometria de fluxo Imunofluorescência 32 32 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO CITOMETRIA DE FLUXO Definida como metodologia, tecnologia e/ou ferramenta direcionada ao estudo de células. ▪ Utilizada na: Identificação, avaliação e diferenciação de diversas características celulares como: ▪ Conteúdo de DNA e RNA ▪ Receptores de superfície ▪ Produção de citocinas ▪ Apoptose 33 33 11  17/08/2024 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Utilizada também para contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. Partículas Microscópicas – CÉLULAS Purificação de uma solução heterogênea – Cell sorting 34 34 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Princípio básico – emprego de uma radiação laser direcionada que excita os fluorocromos. Fluorocromos são essencialmente compostos fluorescentes, que absorvem uma energia luminosa em um determinado comprimento de onda e emitem luz em um comprimento de onda maior. Esses dois processos são chamados de excitação e emissão, respectivamente. Os fluorocromos ao serem excitados pelo laser, emitem luz, que dependendo do comprimento de onda, possuem uma cor característica. Assim, pode-se pesquisar informações biológicas, moleculares e/ou bioquímicas das células em suspensão. 35 35 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Citômetro de Fluxo de Dot plot 36 36 12  17/08/2024 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Citômetro de Fluxo 37 37 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Citômetro de Fluxo Flow cell Laser Detecção Tubo com células 38 38 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Citômetro de Fluxo Passagem de UMA célula por vez, logo, as células de uma amostra em suspensão são caracterizadas individualmente Dependendo do citômetro e da amostra, o fluxo pode ser de 10 a 10.000 células/segundo. 39 39 13  17/08/2024 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Como as células alteram o feixe de laser que incide sobre elas? Uma parte do feixe é desviada levemente pela célula A luz desviada atinge o detector Forward Scatter (FSC) Dispersão Frontal Uma parte do feixe é desviada fortemente pela célula A luz desviada atinge o detector Side Scatter (SSC) Dispersão Lateral 40 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Forward Scatter (FSC) O dado gerado a partir do detector FSC fornece informações sobre o TAMANHO da célula 41 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Forward Scatter (FSC) 42 14  17/08/2024 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Forward Scatter (FSC) Barra de obscuração Sem célula Desvio leve de luz = 0 Detector FSC 43 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Forward Scatter (FSC) Barra de obscuração Com célula Desvio leve de luz = 3 Detector FSC 44 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Forward Scatter (FSC) Barra de obscuração Com célula Desvio leve de luz = 7 Detector FSC 45 15  17/08/2024 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Forward Scatter (FSC) Tamanho da célula 1 2 3 4 5 6 7 8 46 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Side Scatter (SSC) O dado gerado a partir do detector SSC fornece informações sobre a GRANULOSIDADE da célula 47 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Side Scatter (SSC) Detectores SSC Sem célula Desvio forte de luz = 0 48 16  17/08/2024 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Side Scatter (SSC) Detectores SSC Sem célula Desvio forte de luz = 2 49 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Side Scatter (SSC) Detectores SSC Sem célula Desvio forte de luz = 5 50 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Forward Scatter (FSC) Granulosidade 1 2 3 4 5 6 7 8 51 17  17/08/2024 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Granulosidade 8 7 6 5 4 3 2 1 Tamanho 1 2 3 4 5 6 7 8 52 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Granulosidade 8 7 6 5 4 3 2 1 Tamanho 1 2 3 4 5 6 7 8 53 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Granulosidade 8 7 6 5 4 3 2 1 Tamanho 1 2 3 4 5 6 7 8 54 18  17/08/2024 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO 55 55 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Como diferenciar célular por parâmetros mais específicos do que tamanho e granulosidade? 56 56 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Como diferenciar célular por parâmetros mais específicos do que tamanho e granulosidade? (Fluorescence-Activated Cell Sorter) 57 57 19  17/08/2024 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO É comum a associação de fluorocromos à moléculas de anticorpos Anticorpo monoclonal conjugado com fluorescência União de especificidade do anticorpo com a utilidade do fluorocromo Fluorocromos Inicialmente em repouso Excitados por uma fonte luminosa (laser) Emitem uma luz de comprimento de onda (cor) característica 58 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO A maioria dos fluorocromos é excitada por um laser argônio Produz uma luz Azul DE 488 nm, presentes em todos os citômetros Outros fluorocromos são excitados por outros comprimentos de onda. Alguns citômetros têm mais de um laser Laser Violeta-Azul – 405 nm Laser Helio-Neônio – 633 nm Laser UV – 355 nm 59 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO 60 20  17/08/2024 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Imunofenotipagem por citometria de fluxo Anticorpos monoclonais Célula para identificação conjugado com fluorocromo + = Incubação Detecção 61 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO Célula A Célula B Célula C Célula D Anticorpo anti-Y Anticorpo anti-X Conjugado FITC Conjugado PE Célula A Célula B Célula C Célula D 62 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - CITOMETRIA DE FLUXO A principal aplicação da técnica na rotina clínica tem sido o estudo dos marcadores utilizados para o diagnóstico e o prognóstico Leucemias e linfomas Monitoramento da contagem de: Linfócitos T CD4+ sanguíneas de pacientes HIV positivos detecção da produção de moléculas em solução, como citocinas. 63 63 21  17/08/2024 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - IMUNOFLUORESCÊNCIA Imunofluorescência Direta 64 Ensaios com Reagentes Fluorescentes - IMUNOFLUORESCÊNCIA Imunofluorescência Indireta Utiliza células/antígenos fixados em áreas demarcadas de lâminas de vidro. Amostras do paciente para verificação de anticorpos específicos que se ligam aos antígenos. Utilização de anticorpo anti-anticorpo marcada com uma substância fluorescente 65 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados ❖ Ensaios com marcadores enzimáticos ▪ O teste de “ELISA” (do inglês “Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay) se baseia reações antígeno-anticorpo detectáveis através de reações enzimáticas. A enzima mais comumente utilizada nestas provas é a peroxidase, que catalisa a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2) em H2O mais O2. 66 66 22  17/08/2024 Ensaios Imunológicos com Reagentes Marcados: Categorias Ensaios de Imunohistoquímica Ensaios com Marcadores Radioativos Ensaios Luminescentes Ensaios com Reagentes Fluorescentes Ensaios com Marcadores Enzimáticos 67 67 Ensaios com Reagentes Enzimáticos – ELISA (INDIRETO) Antígeno conjugado com enzima Anticorpo na Amostra Antígeno Substrato Indireto porque localiza o anticorpo (e não o patógeno) na amostra 68 Ensaios com Reagentes Enzimáticos – ELISA (DIRETO-SANDUICHE) Antígeno conjugado com enzima Antígeno na Amostra Anticorpo Substrato Direto porque localiza diretamente o patógeno na amostra 69 23  17/08/2024 Ensaios com Reagentes Enzimáticos – ELISA (DE COMPETIÇÃO) Antígeno biotinizado (com biotina) Antígeno com afinidade na Amostra Anticorpo Enzima Adição de um Substrato (Se liga a biotina) Objetivo: confirmar que o paciente é ou não positivo (Reação cruzada) - Se a amostra emitir cor, significa que o paciente é negativo. (Leitura contrária) 70 DÚVIDAS? 71 Obrigada pela participação! 72 24  17/08/2024 73 74 25