Histologie - Cytologie a obecná Histologie PDF

HISTOLOGIE Cytologie a obecná histologie 1. Zásady odběru a zpracování materiálu pro histologické vyšetření histologické vyšetření = metoda vědecké práce, součást klinických vyšetřovacích metod ◦ umožňuje stanovit, potvrdit/vyvrátit...

HISTOLOGIE Cytologie a obecná histologie 1. Zásady odběru a zpracování materiálu pro histologické vyšetření histologické vyšetření = metoda vědecké práce, součást klinických vyšetřovacích metod ◦ umožňuje stanovit, potvrdit/vyvrátit diagnózu histologická technika = soubor postupů, metod a přístupů, které vedou ke zhotovení preparátu preparát ◦ tenký řez tkáně ( pro světelnou mikroskopii 6-8 μm) ◦ zpracován histologickou metodou ◦ zamontován pod krycí sklo ◦ připraven ke studiu pod světelným mikroskopem zhotovení preparátu 1. Odběr materiálu zásady odběru materiálu: ◦ odebírat čerstvý materiál ◦ šetrným způsobem ◦ řádně označit ◦ okamžitě fixovat ( zabrání autolýze a hnilobě ) ◦ vyplnit průvodku způsoby odběru: ◦ nekropsie – z mrtvého organismu ( musíme provést co nejdříve – nastupuje autolýza; střeva, žaludek – co nejrychleji, štítná žláza – ještě něco uvidíme i po pár hodinách ) ◦ biopsie – z živého organismu ▪ musí být rychlý, šetrný a bezpečný pro pacienta způsoby odběru: ◦ excize ▪ vyříznutí skalpelem/žiletkou ( spíše u nekropsie, živočichů ) ▪ nesmí se příliš poškodit tkáň ▪ nemůžeme moc mačkat ( například přidržovat pinzetou ), aby nedošlo k poškození buněk ◦ punkce ▪ použije se širší jehla se stříkačkou ▪ například při odběru materiálu z štítné žlázy, ledviny, jater, kostní dřeně ▪ při odběru z orgánů se kontroluje ultrazvukem ◦ aspirační biopsie tenkou jehlou ▪ získáváme jednotlivé buňky ▪ zpracování jako krevní nátěr, například štítná žláza, pankreas, prs ◦ mikroabraze = kyretáž ▪ pomocí kyrety – například vyšetření endometria – seškrábnutím sliznice ◦ stěr, nátěr ▪ pomocí tambonu nebo štětečku se oloupou, setřou ze sliznice buňky a natřou se na sklíčko ▪ například poševní cytologie – při vyšetření děložního čípku ◦ endoskopický odběr, laparoskopie  dostaneme průvodní list – jméno pacienta, rodné číslo, info co máme se vzorkem dělat, info o předběžné diagnoze, byla nějaká léčba ( ozařování, chemoterapie, … ) buňky musíme okamžitě po odběru fixovat a označovat !!! ◦ smrt organismu či bioptický odběr materiálu – přerušení koordinační a obranné činnosti organismu, zásobení živinami a kyslíkem, odvodu metabolitů ◦ autolýza – začíná okamžitě; samovolný rozklad tkáně způsobený nekoordinovanou činností vlastních endogenních enzymatických systémů ◦ hniloba – začíná až po delší době; rozklad tkáně vnějšími činiteli ( exogenní enzymy například z bakterií, plísní ) 2. Fixace = rychlá a šetrná konzervace tkáně fixačními prostředky zabráníme tak autolytické činnosti organizmů, inaktivujeme je nebo alespoň inhibujeme 1. Fixace fyzikálními fixačními prostředky ovlivňují transportní funkci vody a tím naruší enzymaticky katalyzované reakce v buňkách, probíhající ve vodném prostředí v běžném životě například když dáme jídlo do mrazáku moc se nevyužívá na běžné odběry a) fixace působením nízké teploty rychlé zmrazení – amorfní led nepoškozuje buněčné struktury, „suchý led“ ( kys. Uhličitá, -75 ºC ) / zkapalněné plyny ( dusík, -180 ºC ) b) fixace vysušením tkáně za nízké teploty freeze-drying, lyofilizace mrazová sublimace ve vakuu, po opětovném zavodnění pokračuje aktivita enzymů využití v histochemii – průkaz aktivity enzymů, imunohistochemie c) fixace mikrovlnným zářením ohřev na 45-55 ºC; jemná denaturace 2. Chemickými fixačními prostředky založeny na působení par nebo roztoků účinných látek – fixačních tekutin ( výhodné, protože se dají připravit dopředu), které ve vhodné koncentraci vyvolávají jemnou a šetrnou denaturaci enzymových proteinů ( blokace činnosti enzymu ) 3. Fyzikálně chemickými metodami kombinace předchozích, například použijeme fixační tekutinu chlazenou na 0-4 ºC histochemie, elektronová mikroskopie požadavky na fixaci: ◦ musí rychle působit v celém vzorku ( tekutina musí rychle pronikat do tkání ) ▪ z toho důvodu musí být vzorky přiměřeně velké ( pro světelnou mikroskopii 1cm3, elektronová mikroskopie cca 1mm3 ) - spíše ploténky než krychličky ▪ vhodná nádobka – široké hrdlo, řádné uzavření ▪ fixační tekutiny musí být nadbytek ( 20-50x větší objem než vzorek, aby voda ze vzorku nesnížila koncentraci fixačního roztoku ) ◦ musí dobře uchovat strukturu buněk a tkání ▪ fixační tekutina nesmí nijak poškodit vzorek ◦ musí umožňovat další požadované zpracování, vyšetření ◦ vzorek se nesmí přilepit ke dnu ani plavat neponořený ( skleněné kuličky na dno, plíce přitlačit do tekutiny gázou, apod. ) ◦ správné označení materiálu – nesmí dojít k záměně ▪ nalepovací štítek + se na karton tužkou napíše označení a vhodí se ke vzorku ◦ + žádanka na histologické vyšetření fixační prostředky: a) formol ( formalín ) 100% formol = 40% vodný roztok formaldehydu používá se 10% ( 4% roztok formaldehydu ) nejpoužívanější, dostupný, relativně levný uchovává se v lahvi z hnědého skla, protože na světle se rozkládá na kyselinu mravenčí, proto se neutralizuje: i. neutrální formol pro neutralizaci od kyseliny mravenčí se používá uhličitan vápenatý ( asi ¼ lahve ) rychle proniká do tkáně, je šetrný, zachovává strukturu, dobře se po něm barví fixujeme asi 24h, menší kousky i méně, nemůžeme přefixovat ii. slaný formol upravená osmolarita 10% formol ředěný fyziologickým roztokem iii. purfovaný formol ředěný fosfátovým pufrem průkaz enzymů v histochemii iv. bromformol 15% formol+ bromid amonný využívá se u impregnačních metod, při průkazu gliových buněk v nervové tkáni b) Bakerova tekutina 10% formol s chloridem vápenatým a vodou CaCl2 snižuje rozpustnost lipidů – vhodné pro průkaz lipidů, enzymů vázaných na membrány c) Bouinova tekutina (buénova tekutina) 25% formol, kyselina pikrová, ledová (koncentrovaná) kyselina octová ( těsně před použitím – zvýší pronikání do tkáně ) tekutina žluté barvy po fixaci se dává do 80% ethanolu, nemůžeme přefixovat velmi dobře zachovává polysacharidy nevýhody – nehodí se pro fixaci krevnatých orgánů ( hemolyzuje a sráží krev ); není vhodná pro průkaz lipidů; nehodí se pro fixaci tkání určených k zalití do celoidinu d) fixační prostředky se sublimátem sublimát ( HgCl2 ) - tvoří nežádoucí amorfní černé sublimátové sraženiny, které se po fixaci musí odstranit jódováním ( Lugolův roztok, jódová tinktura ) i. SUSA ( Sublimát, Salz ) sublimát, chlorid sodný, formol, destilovaná voda, kyselina trichloroctová, před použitím ledová kyselina octová výborná pro cytologii, tvrdší tkáně – kosti, zuby, chrupavky ( obě organické kyseliny mají dekalcifikační efekt ) přenáší se rovnou do 90% ethanolu, v němž se provádí jódování ii. Zenkerova tekutina sublimát, dichroman draselný, síran sodný, destilovaná voda, ledová kyselina octová, NENÍ FORMOL fixace 24h – poté vypírání bločku v tekoucí vodě ( 24h ) aby se vyplavil dichroman ( snižuje barvitelnost tkáně ) - pak 70% ethanol a jódování e) etanol zejména v neurohistologiii – Nisslova metoda  ◦ tkán se značně dehydratuje extrahují s tuky ( ethanol nad 70% je tukové rozpouštědlo ) - dojde ke zvýraznění komplexů granulárního endoplazmatikého retikula ( Nisslova substance ), ta se pak barví například thioninem, toluidinovou modří f) aceton u enyzmů ( enzymová histochemie ), chlazený 0-4 ºC g) osmiumtetroxid základní prostředek fixace v technice elektronové mikroskopie, pro světelnou mikroskopii se nehodí – proniká pomalu do tkáně, ale v 5% koncentraci – průkaz GA další postup po fixaci: i. zmrazení tekutým dusíkem krájení na zmrazovacím mikrotomu (kryostatu) ii. zalití do zalévacího media nejběžnější postup iii. (peroperační biopsie) například při odstraňování rakoviny ◦ při operaci se část odebere – patolog se hned podívá a řekne – jo vzali jste všechno/ ne ještě kousek zbývá 3. Zalévání a krájení zalévání : pro běžné histologické vyšetření je potřeba odebraný a fixovaný materiál nakrájet na řezy 4-8 μm silné nutné prosytit tkáň tekutým zalévacím médiem – medium ztuhne a zvýší konzistenci ( tvrdost, pevnost ) vzorku, což umožní materiál krájet na tenké řezy media: (1) rozpustná ve vodě ◦ celodal, želatina, metakrylátové umělé pryskyřice ◦ výhodná – po fixaci a vyprání ve vodě můžeme přímo prosycovat, zalévat a tvrdit ◦ využití hlavně pro průkaz tuků (2) nerozpustná ve vodě ◦ parafín ( nejběžnější ), celoidin, umělé epoxidové pryskyřice ◦ zalévání do těchto médií vyžaduje nejprve důkladné odvodnění vzorku a prosycení intermediem ( látka, která se mísí s odvodňujícím i zalévacím médiem ) - teprve pak prosycujeme zalévacím médiem = trochu složitější než u (1) zalévání do parafínu ◦ etapy: I. Odvodnění tkáně – dehydratace vzestupná řada alkoholů ( ethanolu ) - 30-50-70-80-90-96-100% musí být šetrné,aby nedošlo ke smrštění tkáně první použitá koncentrace závisí na obsahu vody ve tkáni ( například embryonální tkáně 30%, šlacha či zub i 90%, po fixaci Bouinovou tekutinou 80%, SUSA 90% každá lázeň několik hodin, 2x se vyměňuje, celkem 1-2 dny II. Prosycení tkáně intermediem, projasnění benzen, xylen, toluen, metylsalicylát, metylbenzoát  intermedium musí rozpouštět parafín a mísit se se 100% alkoholem vysoký index lomu, optická homogenizace vzorku – tkáň se projasní a zprůhlední provádí se ve 3 lázních po cca 15 minutách III. Prosycení tekutým parafínem termostat 56ºC ( teplota nesmí přesáhnout 58ºC – jinak tkáň ztvrdne a smrští se ) 3 lázně parafínu k dokonalému odstranění intermedia 1. lázeň asi 2-4h, 2. asi 4-6 h, 3 cca 8-12 h = celkem cca 24 hodin IV. Vlastní zalití v zalévací komůrce, používá se výhradně zkvalitněný parafín ( získá se zahřátím parafínu na 80ºC, přidáním 3-5% včelího vosku a přefiltrováním ) bloček se přenese pinzetou, nahřátou preparační jehlou se zorientuje stále u vzorku musí zůstat značení V. Tvrzení média rovnoměrné tuhnutí při pokojové teplotě, případně rychlé a stejnoměrné ochlazení v nádobce se studenou vodou úprava bločku, přitmelení na podložku pro rutinní zpracování histologických preparátů se používají zalévací automaty napínání a lepení parafínových řezů: ◦ řezy se napínají na vodní hladině ( povrchové napětí ) a lepí se na podložní sklíčko: a) směsí bílku a glycerinu 1:1 nelze použít například pro imunohistochemii, impregnaci na sklíčko se rozetře bílek s glycerínem, přenese se řez a podlije destilovanou vodou; natažení na napínací ploténce; označení podložního skla; sušárna b) roztokem želatiny 0,5 – 1% řezy se podlévají želatinou, sušárna, koagulace želatiny formolovými parami  zalévání do celoidinu ◦ běžně se nedělá ◦ nitrát celulózy rozpustný v éteru a alkohol-éteru ◦ použití – tuhé tkáně, šlachy, chrupavky, zuby, odvápněné kosti ◦ výhoda – pokojová teplota ◦ nevýhody – trvá dlouho, nelze použít pro lipidy, nádobky musí být dobře uzavřené zalévání do želatiny ◦ mísitelná s vodou ◦ použití – řídké struktury – placenta, sliznice střeva, průkaz lipidů,… ◦ postup: ▪ vyprání ve vodě ▪ prosycení želatinou ve stoupajících koncentracích ( 10% a 15% vodný roztok ) při 38ºC ▪ vlastní zalití do 15% nebo 20% roztoku želatiny v zalévací komůrce ▪ tvrzení v 10-20% formolu ▪ zmrazení a krájení na kryostatu krájení: sáňkový mikrotom ◦ krájí parafín, celoidin, celodal ◦ nůž se pohybuje rotační mikrotom ◦ parafínové bloky – zhotovení sériových řezů – například embryologie ◦ pohybuje se preparát zmrazovací mikrotom ◦ krájení tkání nezalitých, zalitých do želatiny 4. Barvení viz další otázka SVĚTELNÝ MIKROSKOP: mechanická část – stativ, stolek, šrouby optická část – objektiv, okulár osvětlovací zařízení – světlo, kondenzátor, clony druhy objektivů – suché, imerzní rozlišovací schopnost mikroskopu – dána jeho stavbou a optickými vlastnostmi objektivu ◦ je vyjádřena numerickou aperturou - NA = n*sin α ◦ n je index lomu media, αje polovina otvorového úhlu objektivuRozlišovací schopnost je minimální vzdálenost 2 bodů, které můžemerozlišit, mezní hodnota u světelného mikroskopu při použití šikméhoosvětlení je asi 0,2 μm 2. Přehledné (základní) a speciální barvicí metody, principy a výsledek Barvení neobarvené řezy – nerozlišíme jednotlivé struktury – mají stejný index lomu ( prohlížení jen s použitím speciálních optických zařízení – mikroskop s fázovým kontrastem ) běžná světelná mikroskopie – založena na použití velké palety barvících metod barviva – látky, které absorbují světlo určitých vlnových délek ◦ to, co pak vnímáme jako barevný vjem, jsou neabsorbované vlnové délky různé části buněk a tkání váží různá barviva – po obarvení se proto dají od sebe dobře odlišit barvení nefixovaných tkání: ◦ vitální ▪ například tuš, trypanová modř, lithiumkarmín ▪ aplikace do krve či vaziva – vychytávání se sleduje na řezech ▪ fagocytární aktivita buněk ◦ supravitální ▪ například Janusova zeleň – mitochondrie; methylenová modř – nervové buňky histologická barviva 1. zásaditá ( bazická ) - také jádrová barví bazofilní struktury – tj. Kyselé – například chromatin, ribosomy například hematoxylin, methylenová modř, toluidinová modř, thionin 2. kyselá ( acidická ) - také plazmatická barví acidofilní struktury – tj. Zásadité – například cytoplazma, kolagenní vlákna například eosin, světlá zeleň, aniliová modř, oranž G, ponceau, kyselý fuchsin bazofílie je schopnost struktur se barvit bazickými barvivy; acidofílie ( eosinofilie, oxyfilie ) je schopnost barvit se kyselými barvivy barviva podle původu: ◦ přírodní – dnes špatně dostupné – proto se vyrábí synteticky; například šafrán, orcein, karmín, hematoxylin ◦ syntetická barvení podle způsobu aplikace: ◦ progresivní ▪ tkáň se barví pod kontrolou zraku do určité intenzity zbarvení – pak se proces přeruší ◦ regresivní ▪ tkáň se hodně přebarví – poté se odbarvuje – přebytečné barvivo se odstraní příslušným roztokem pod kontrolou zraku ( diferenciace ) ◦ sukcedánní ▪ barvení řezu postupně v několika barvicích roztocích za sebou ◦ simultánní ▪ barvení řezu roztokem různých barviv soušasně ◦ in toto ▪ barvení celého bloku tkáně barvení podle výsledků barvení: ◦ ortochromatické ▪ složky tkáně vykazují stejnou barvu jako užité barvivo ◦ metachromatické ▪ často u modří ▪ jednotlivé komponenty tkáně se obarví jedním barvivem v různě barevných tónech – nějaká část se obarví jiným odstínem než je odstín barviva  ▪ například při průkazu hlenu v buňkách produkujících hlen barvíme toluidinovou modří – hlen je ale červenofialový ▪ metachromatická barviva – toluidinová modř, thionin, methylenová modř ◦ difúzní ▪ barvící roztok znázorní všechny složky tkáně ve stejném barevném tónu a ve stejné intenzitě ◦ elektivní ▪ barvící roztok obarví pouze jednu ze složek buněk či tkání nebo ji výrazně vyzvedá přehledné barvící metody ◦ obarví jádra a cytoplazmu rozdílným barevným tónem a zároveň obarví i mezibuněčnou hmotu pojivové tkáně ◦ používá se jedno jádrové a jedno nebo více kyselých barviv ( použití více kyselých barviv umožní barevné rozlišení vaziva a svaloviny ) i. Hematoxylin-eosin hematoxylin – nažloutlý prášek – jeho roztok sám o sobě nebarví je proto nutná oxidace v hematein ( samovolně na vzduchu zraje měsíce – urychluje se proto přidáním oxidačních činidel, například jidičnan sodný ) hematein má ale slabou afinitu ke tkáním, musí se použít mořidlo ( soli Al, Fe ) = barví barevný lak hemateinu podle mořidla se rozeznávají různé druhy hematoxylinů: ◦ Kamencové hematoxyliny ▪ Harrisův, Mayerův ▪ například HE, žlutý trichrom, dobarvení jader u speciálních metod ▪ použ. kamence ◦ Železité hematoxyliny ▪ od FeCl3 ▪ Weigertův – zelený a modrý trichrom, Weigert van Gieson, Heidenhainův hematoxylin barvení: i. odparafínování, deparafinace pomocí xylenu – ve dvou lázních po 5 minutách alkohol v sestupné řadě ( 100%,96% ), voda ii. barvení hematoxylin – 3-10 minut, voda regresivní barvení diferencování v kyselém alkoholu ( 70% alkohol s HCl ), voda eosin – 0,1-0,5% roztok 1-3 minuty, voda diferencování v 80% alkoholu požadovaný odstín ◦ pouze jádra modře ◦ cytoplazma růžově iii. odvodnění dvě lázně alkoholu 96% fenolxylen 20-25%, 3 minuty iv. projasnění 2 lázně xylenu po 5 minutách v. zamontování zamontování do montovacího media + sušení pomocí montovacího média obarvený řez zamontujeme pod krycí sklo motovací média ◦ požadavky – bezbarvé, vysoký index lomu, nesmí odbarvovat, musí mít konzervační účinek  ◦ dělíme: ▪ rozpustná ve vodě – glyceriin, glycerinová želatina ▪ nerozpustná ve vodě – nejběžnější; kanadský balzám, epoxidová pryskyřice - Entelan ii. Massanovy trichromy podle zbarvení vaziva: ◦ žlutý ◦ zelený ◦ modrý iii. Weigert van Gieson iv. AZAN speciální barvící metody ◦ cílené metody, které znázorní pouze určitý typ buněk nebo buněčný či tkáňový detail ◦ cytologické metody – Heidenhainovo barvení ◦ barvení elastických vláken ( elastinu ) - orcein, aldehyd-fuchsin, resorcin-fuchsin ◦ průkaz retikulárních vláken – impregnace stříbrem, PAS reakce ◦ histochemické metody ◦ neurohistologické metody ▪ barevné průkaz Nissovy substance ( Nisslova metoda ) průkaz myelinu – Weigertova metoda, luxolová modř ▪ impregnační znázornění neurofibril znázornění gliových buněk Basická Kyselá Jádro Kolagenní Svalstvo Erytrocyty barviva barviva Cytoplasm vlákna a Hematoxyl Kamencov Eosin in Eosin ý (HE) hematoxyli n Massonův Kamencov Eosin, žlutý ý šafrán trichrom hematoxyli n M. zelený Weigertův Ponceau d ́xylidine, trichrom želetitý kyselý fuchsin, hematoxyli světlázeleň, n oranžG M. modrý Weigertův Ponceau d ́xylidine, trichrom želetitý kyselý fuchsin, hematoxyli anilinová n modř, oranžG AZAN Azokarmín Anilinová modř, oranžG Weigert Weigertův Pikrofuchsinči kyselina van Gieson želetitý pikrová  hematoxyli asaturnováčerv eň n 3. Histochemické metody, principy a použití Histochemická metoda ◦ prokazuje chemickou látku či enzymovou aktivitu vázanou na určitou strukturu na histologickém řezu prokazované látky nesmějí difundovat z místa, kde se nacházejí produkt musí být nerozpustný, barevný ( světělný m ) nebo elektrodenzní ( EM ) metoda by měla být specifická pro chemickou látku či skupinu procedura nesmí denaturovat nebo blokovat reaktivní skupiny histochemie: ◦ stavební: průkaz chemických látek v buňkách a tkáních ( průkaz lipidů, polysacharidů, glykosaminoglykánů, fosfolipidů, železa, vápníku, atd ▪ využití například u soudního lékařství ◦ katalytická ( enzymová ): prokazuje aktuální štěpení substrátu enzymem průkaz nukleových kyselin i. DNA – Feulgenova reakce hydrolýza DNA Hcl odštěpení purinových bazí od monosacharidu odhalení aldehydových skupin na deoxyribóze jejich reakce se Schiffovým činidlem – vznik červenofialové substance jaderný chromatin s barví červenofialově ( pozitivní reakce na DNA ), jadérko zůstane neobarveno vyšetření sex- chromatinu ii. RNA barví se bazickými barvivy – toluidinovou modří, methylenovou modří nutnost kontrolního řezu inkubovaného v ribonukleáze struktura, která po inkubaci ztratí svoji bazofilii – obsahuje DNA průkaz lipidů ◦ nelze zalévat do parafínu + nesmí přijít do styku s organickými rozpouštědly ( benzen, xylen ) !!!!! ◦ fixace – Bakerova tekutina, zmrazení, eventuelně se zalévá do želatiny/celodalu ◦ krájí se v kryostatu ◦ barvení barvivy rozpustnými v tucích – Sudan III/IV, olejová červeň ( barví červeně ) sudanová čerň ( barví modročerně až černě ) ◦ jádra se dobarvují hematoxylinem nebo jádrovou červení ( kontrastně k tuku ) ◦ montujeme do media rozpustného ve vodě ( glycerin, glycerinová želatina ) ◦ základní orientační metoda průkaz fosfolipidů ◦ barvíme je luxolovou modří – používáme ke znázornění myelinové pochvy nervových vláken  průkaz polysacharidů – PAS reakce ◦ PAS = Periodic Acid a Schiffovo reagens ◦ princip – spočívá v oxidaci glykolových skupin cukru kyselinou jodistou na aldehydové skupiny – ty reagují se Schiffovým činidlem za vzniku červenofialové nerozpustné sraženiny ◦ PAS pozitivní – glykogen, retikulární vlákna, hlen, bazální membrány, mezibuněčná hmota, hyalinní chrupavky průkaz glykogenu ◦ PAS reakce s diastázovým ( amylázovým ) testem odliší glykogen od jiných polysacharidů (diastáza=enzym štěpící glykogen ) ◦ provedení: ▪ první řez se vzorkem je ponechán v destilované vodě ▪ druhý ( kontrola ) je inkubován s enzymem diastázou ( amylázou ) ▪ po vyprání je na obou řezech provedena PAS reakce: kontrolní řez PAS negativní, vzorek PAS pozitivní – je glykogen kontrolní řez PAS pozitivní, vzorek PAS pozitivní – jde o PAS pozitivní, ale diastázorezistentní polysacharid průkaz glykosaminoglykánů ( GAG ) ◦ barvení alciánovou modří ◦ metachromatická reakce ( barvení toluidinovou modří ) ◦ výskyt – hlen ( epithel žlučníku, pohárkové buňky epithelu střeva, mucinózní buňky ), mezibuněčná hmota pojiv, granula heparinocytů katalytická histochemie: enzymy – katalyzátory biochemických reakcí aktivita enzymů je závislá na řadě faktorů – teplota, pH možnost použití aktivátorů, například kationty hořčíku, manganu, atd. Zpracování tkáně co nejdříve po odběru – většina enzymů nesnese fixaci katalytická histochemie prokazuje aktivitu enzym ( štěpení substrátu enzymem ) princip – histochemická reakce:  další reakce vizualizuje reakční produkt – například azokopulace, tetrazollová metoda, peroxidázová reakce, precipitace s kationty kovů nutnost kontrolních řezů – doložení specifity průkazu i. azokopulační metoda – průkaz aktivity alkalické fosfatázy inkubační roztok: ◦ substrát ( alfa natylfosfát ), stabilizovaná diazoniová sůl (Fast Red TR), pufr pH 9 princip: ◦ enzym štěpí substrát a uvolněný naftylový zbytek se naváže na diazoniovou sůl za vzniku nerozpustné barevné sraženiny azobarviva výsledek: ◦ přítomnost alkalické f. - barevná hnědočervená sraženina ( zbarvení podle diazoniové soli ) ◦ množství azobarviva je přímo úměrné aktivitě enzymu a je lokalizováno v místě, kde byl enzym ii. průkaz kyselé fosfatázy ( marker lyzosomů ) Gomoriho metoda: ◦ 1. fáze ▪ inkubace řezů v tekutině s glycerofosfátem sodným a dusičnanem olovnatým, fosfatáza vede k uvolnění fosfátových iontů ▪ ty reagují s dusičnanem olovnatým za vzniku bezbarvého elektrondenzního precipitátu fosforečnanu olovnatého ◦ 2. fáze ▪ roztok síranu amonného – černá sraženina síranu olovnatého iii. průkaz dehydrogenáz inkubace nefixovaných řezů v roztoku substrátu – tetrazollová sůl substrát je akceptor uvolněných vodíkových iontů – jejich navázáním vzniká nerozpustná barevná sraženina formazanu například lokalizace sukcinát dehydrogenázy v mitochondriích iv. průkaz peroxidázy řezy se inkubují v roztoku obsahujícím peroxid vodíku a DAB ( diaminoazobeznzidin ) DAB je v přítomnosti peroxidázy oxidován na černý elektrodenzní precipitát využití: ◦ klinika – diagnostika leukémií ◦ značení v imunohistochemii imunohistochemie imunocytochemické metody jsou vysoce specifické a používají se k průkazu určitých bílkovin a některých dalších makromolekul založené na imunitní reakci organismu proti cizorodým látkám ( antigenům ), organismus reaguje tvorbou specifických protilátek, které se vážou na antigen: komplex antigen x protilátka protilátky: ◦ imunoglobuliny – tvořené plazmatickými buňkami ▪ IgA,IgD, IgE, IgG, IgM ◦ polyklonální ▪ z imunizovaného organismu – produkt několika klonů B lymfocytů – plazmocytů – vysoká senzitivita, nízká specificita ◦ monoklonální ▪ produkt jednoho klonu B lymfocytů – mimořádně specifické  metody značení protilátek: ◦ enzymy ▪ konvenční histochemie ( například peroxidáza – vizualizace DAB ) ◦ korpuskulární ▪ částice koloidního zlata, ferritin ( elektronová mikroskopie ) ◦ fluorochromy ▪ fluorescenční mikroskop ▪ akridinová oranž, rhodamin, FITC – fluorescein isothiocyanát, TRITC – tetramethyl rhodamine isothiokyanát, DAPI – diamidino fenylindol dihydrochlorid ◦ biotin ▪ avidin-biotin komplex – ABC imunohistochemické metody: ◦ přímá metoda ▪ je jednovrstevná – tj. Aplikuje se primární protilátka ( proti hledanému antigenu ) s navázanou značkou – primární protilátka značená přímo ▪ nutná dostatečná koncentrace antigenu ve tkáni ▪ pro světelno mikroskopii není dost citlivá – vyhovuje elektronové mikroskopii ◦ nepřímá metoda ▪ dvojstupňová ( sendvičová technika ) ▪ na antigen se naváže neznačená primární protilátka a na její Fc fragment se naváže sekundární protilátka – značená ◦ nepřímá trojstupňová metoda ▪ využívá avidin-biotin komplex (ABC) ▪ avidinová molekula váže 4 molekuly biotinu ▪ princip spočívá v označení sekundární protilátky biotinem a jeho následné vazbě se (strept)avidin-biotinovým komplexem označeným křenovou peroxidázou ▪ enzymatická aktivita peroxidázy nám pak indikuje ta místa, na nichž došlo k primární specifické reakci elektronová mikroskopie odběr – čerstvá tkáň, vzorek cca 1 mm3 fixace ◦ často tzv. dvojitá fixace ◦ aldehydové roztoky ( formaldehyd, glutaraldehyd ), kakodylátový pufr, například Karnovského roztok zalévání ◦ umělé pryskyřice – epoxidové, metakrylátové, polesterové ◦ želatinové kapsle krájení ◦ polotenké řezy, orientace, barvení toluidinovou modří ◦ ultratenké řezy – mikrotom 40-60nm  ◦ zachycení na síťky ( měděné, niklové, zlaté ) povlečené nosnou blánou ( formvar ), zpevněné nanesením uhlíkové vrstvy 4. Imunohistochemické metody, principy a použití - viz otázka 3 5. Stavba buňky, přehled buněčných součástí buňka – cellula ( poprvé Robert Hooke 1665 – rostlinná buňka ) ◦ = nejmenší stavební a funkční jednotka, která je schopna samostatného života ▪ buněčná teorie ( 1. polovina 19. století ) ▪ T. Schwann a M.J. Schleiden + J.E. Purkyně ◦ buňky vznikají z jiných buněk dělením ( proliferací ) - Rudolf Virchow membránové formace se podílejí na utváření ohraničených oblastí - kompartmentace buňky – je vybavena dvěma základními buněčnými kompartmenty – jádrem a cytoplasmou ◦ jednotlivé kompartmenty v buňce – aby mohly jednotlivé reakce probíhat nerušeně buňka má : ◦ buněčné tělo ( cytoplasma ) ◦ buněčné jádro ( lat. Nucleus, řec. Karyon ) cytoplasma obsahuje: ◦ cytosol – základní tekutou hmotu ◦ v cytosolu organely ( membránové a nemembránové ) ◦ buněčné inkluse organely: ◦ membránové ▪ jádro ▪ endoplasmatické retikulum ▪ Golgiho komplex ▪ lysosomy ▪ peroxosomy ▪ mitochondrie ▪ endosomy ◦ nemembránové ▪ centrioly ▪ volné ribosomy ▪ cytoskelet: mikrotubuly intermediární filamenta aktinová filamenta MEMBRÁNOVÉ ORGANELY: Mitochondrie z řec. Mitos – vlákno a chondros – zrnko obsahují enzymy účastnící se buněčné respirace a tvorby ATP průměr asi 0,5 – 1 μm, délka až desetinásobek jejich průměru rychle mění svůj tvar, splývají jedna s druhou , dělí se a přemisťují v cytoplazmě pomocí mikrotubulů celkový počet mitochondrií souvisí s metabolickou aktivitou buněk -  ◦ buňky vysoce metabolicky aktivní ( například kardiomyocyty, buňky proximálních tubulů v ledvině ) obsahují vždy početné mitochondrie ◦ buňky s nízkou metabolickou aktivitou obsahují mitochondrie sporadicky až ojediněle ◦ analogicky tomu je u diferencovaných buněk, u nichž bývají mitochondrie nakupeny v okrscích cytoplasmy vyznačujících se vyšší spotřebou energie a zvýšeným metabolismem syndrom MERRF ( myoklonická epilepsie s rozeklanými červenými vlákny – myoclonic epilepsy with ragged red fibers ) - nejčastější mitochondriální onemocnění u člověka ◦ buňky některých tkání, například kosterního svalstva, dědí mitochondriální DNA s mutovaným genem pro tRNA lysinu (tRNALys) ◦ to má za následek defektní syntézu proteinů dýchacího řetězce a strukturní abnormality svalových vláken, popř. I jiných buněk lze je pozorovat světelným mikroskopem původně – asi bakterie – endosymbiotická teorie má vlastní genom – kóduje jen část proteinů vlastní ribozomy – protheosynthesa omezená stavba: ◦ vnější a vnitřní membrána ▪ vnější – hladký průběh; podobá se jemnému sítu, obsahuje četné transmembránové proteiny – poriny ( mají fci kanálů umožňujících snadný a rychlý přestup malých molekul – pyruvát, další metabolity, z cytoplazmy do intermembránového prostoru ▪ vnitřní – výběžky – kristy kristy zvětšují povrch velmi specifická – její lipidová dvojvrstva tvořena fosfolipidy neobvyklé konstituce – pro ionty vysoce nepropustná + integrální proteiny, které obsahuje, se uplatňují jako transportní proteiny, díky kterým mohou malé molekuly selektivně přecházet přes membránu do mitochondriální matrix ◦ intermembránový prostor ◦ matrix ▪ obsahuje vysokou koncentraci enzymů a má charakter gelu funkce mitochondrií ◦ tvorba ATP, citrátový cyklus, oxidace mastných kyselin, skladování dvojmocných kationtů – Ca2+, Mg2+ - tam, kde se ionty hromadí – mitochondriální granula proteiny z cytoplasmy transportovány pomocí translokáz tvorba ATP: ◦ metabolity pro tvorbu ATP ( pyruvát, MK ) vstupují do mitochondrií porinovými kanály nebo pomocí transportních proteinů a jsou enzymy matrix konvertovány na acetyl-CoA ◦ z acetyl-coA v Krebsově cyklu vznikne malé množství ATP a NADH ( hlavním zdrojem elektronů pro elektronový transportní řetězec – dýchací řetězec ) ◦ dýchací řetězec lokalizovaný ve vnitřní mitochondriální membráně ◦ přenos elektronů je zprostředkovaný proteinovými komplexy a propojen s řízeným přenosem H+ z matrix do intermembránového prostoru mitochondrie ◦ protony se akumulují v intemembránovém prostoru – důsledkem je vytvoření elektrochemického gradientu napříč vnitřní mitchondriální membránou  ◦ z matrixové strany vystupují komplexy ATP syntázy ◦ díky kanálu v syntáze se protony vracejí z intermembránového prostoru zpět do matrix po koncentračním gradientu ◦ protékající protony roztočí specifické polypeptidy, které energii protonového proudu přemění v mechanickou energii, kterou podjednotka syntázy vloží do nové molekuly ATP ◦ každý z komplexů ATP synstázy je schopen vyprodukovat více než 100 molekul ATP za sekundu Endoplasmatické retikulum soustava plochých cisteren, která prostupuje celou buňkou jeho membrána se přikládá k jádru celkový povrch membrán tubulů a váčků je asi 30x větší než povrch plazmalemy rozlišujeme dva typy: ◦ drsné (granulární) ▪ přítomné v buňkách specializovaných na sekreci proteinů ( buňky pankreatických acinů – trávicí enzymy, fibroblasty – kolagen, … ) plazmatické buňky – imunoglobuliny ▪ skládá se z tubulů a rovnoběžně uspořádaných uskupení plochých cisteren ohraničených membránami - navzují na zevní membránu jaderného obalu ▪ k povrchu jsou připojeny četné polyribosomy ▪ základní funkcí – tvorba membránových proteinů, bílkovin pro některé membránové organely a sekrečních proteinů, které buňky vydávají exocytozou ▪ + zde probíhají různé posttranslační modifikace ▪ syntéza každého proteinu začíná na polyribosomech v cytosolu syntéza proteinu, který je určen pro začlenění do membrán nebo pro sekreci, začíná signální sekvencí ( = iniciálním signálním peptidem, který obsahuje specifickou sekvenci hydrofobních zbytků k signální sekvenci se připojí částice rozpoznávající signál ( SRP ) - pozná receptor na membráně ER a váže se s ním interakce SP velké podjednotky s receptorem ribosomu v membráně způsobí pevnější připojení ribosomu k ER a hydrofobní SP, po uvolnění SRP pro další použití, prostupuje membránou ER přes proteinový translokační komplex z rostoucího proteinu je pak signální peptid odštěpen signální peptidázou jeho translokace pokračuje až do kompletní segregace celé molekuly do cisternového prostoru ▪ osteogenesis imperfecta – některé jeho typy se vyznačují tím, že kostní buňky syntetizují a vylučují vadné molekuly prokolagenu, které velmi špatně polymerují – kostní tkáň se špatně vyvine ◦ hladké (agranulární) ▪ nemá na membrány připojeny žádné polysomy ▪ v cytoplasmě se oba typy ER vyskytují spolu a mohou v sebe plynule přecházet ▪ na rozdíl od granulárního nevykazuje žádnou bazofilii ▪ jeho cisterny bývají protáhlejší a podobají se kanálkům, váčkům různých tvarů a velikostí ▪ funkce  produkce steroidních hormonů detoxifikace – neutralizace toxických látek ( oxidace, konjugace, methylace ) syntéza fosfolipidů v příčně pruhované svalovině přejmenované – sarkoplasmatické retikulum – skladování vápenatých iontů ▪ žloutenka – nažloutlé zbarvení kůže – akumulace bilirubinu v tkáňovém moku – hladké ER nestačí v jaterních buňkách pigment vyloučit žlučí Golgiho komplex systém paralelně uspořádaných cisteren ◦ obsahují enzymy a upravované proteiny ve většině buněk uložen poblíž jádra celý útvar je polarizovaný – cis a trans oblast na cis přichází váčky z ER ◦ prochází cisternami – pokračují posttranslační modifikace ( glykosylace, fosfatace, … ) ◦ v trans oblasti dochází k zabalování ▪ vezikuly ▪ granula z cisteren drsného ER putuje materiál v jednotkách zvaných transportní váčky váčky putují k vstupní straně organely – cis a splynou s nejbližší cisterno u proteiny putují skrz cisterny na trans stranu a jsou shromážděny v transporních váčcích v různých cis a trans úrovních se vyskytují odlišné enzymy – enzymy pro glykosylaci, sulfataci, fosforylaci Sekreční granula pocházejí z kondenzačních vakuol GA vyskytují s v buňkách, které střádají své produkty až do okamžiku, kdy obdrží metabolický, hormonální nebo nervový signál k jejich výdeji exocytozou jsou obalena membránou Lysosomy z řeckého lysis, rozpuštění + soma, tělo oválného tvaru, 0,05-0,5 μm jsou místem nitrobuněčného trávení membránou ohraničené váčky obsahující asi 40 různých hydrolytických enzymů – hojný výskyt ve fagocytujících buňkách ( makrofágy, neutrofilní granulocyty, hepatocyty,… ) ◦ kyselé hydrolázy ( proteásy, lipázy, nukleázy, fosfatázy, sulfatázy,… ) ◦ mají určité optimum pro svou aktivitu – vytvoř. Aktivitou protonové pumpy ( 4,5-5 pH ) náhlé uvolnění lyzosomálních enzymů do cytosolu spojené s jeho okyselením může přivodit smrt buňky syntéza lyzosomálních hydroláz probíhá v granulozním ER – proteiny hydroláz jsou označeny připoejním manozou-6-fosfátem v krvinkách – azurofilní granula primární lysosom ( ten, který se ještě nezúčastnil digesce ), sekundární lysosom ( ten co už tráví ) - bývají o něco větší než primární během trávení prostupují živiny difuzí přes membránu lysosomu do cytosolu, nestrávený zbytek zůstává uvnitř – reziduální tělíska ( v některých dlouho žijících buňkách –  neuronech, kardiomyocytech, se ukládá velké množství RT v podobě zrnek pigmentu lipofuscinu ) také jsou zapojeny do odbourávání přebytečných nebo nefunkčních organel – autofagie ◦ organela je nejprve obalena membránou hladkého ER – vzniká autofagosom ◦ poté fagosom splyne s lyzosomy – enzymy rozštěpí a produkty se vracejí do cytoplasmy ◦ ke zvýšené autofagii dochází u sekrečních buněk v obdobích nutričního stresu ( hladovění ) rekapitulace, osud nestráveného materiálu v lysosomech: ◦ exocytosa ◦ reziduální tělíska ◦ lipofuscinová granula ◦ fagocytující buňky – prašné buňky – prachové částice – v plicích ◦ siderosomy – v makrofázích ledvin, jater, kostní dřeně – obsahují hemosiderin – produkt rozkladu ferritinu Proteasomy velmi malé proteinové komplexy jejich velikost – zhruba jako menší podjednotka ribozomu probíhá v nich odbourávání denaturovaných nebo nefunkčních proteinů – za účasti ATP molekuly, které mají být rozloženy jsou chaperony označeny pomocí ubikvitinu ( dokud není řetězec ubikvitinilován :D ) při poruše ubikvitin-proteázového systému se mohou v poškozených buňkách hromadit patologické proteiny – vede k poškození buněk a jejich smrti – typickým příkladem Alzheimerova nemoc, Huntingtonova nemoc Peroxosomy kulovité organely ( 0,5 – 1,2 μm ) – pojmenované po enzymech, které vytvářejí a odbourávají peroxid vodíku – oxidázy a kataláza oxidáza oxiduje substráty odnětím atomu vodíku, který přenese na molekulární kyslík za vzniku vody kataláza – rozkládá peroxid vodíku a tím chrání buňku tyto enzymy také inaktivují potenciálně toxické molekuly ( včetně některých léků ) - v hepatocytech a buňkách ledvinných kanálků jiné enzymy doplňují fci hladkého ER – podílí se na metabolismu lipidů Melanosomy pouze v melanocytech, pigmentových buňkách ( sítnice ) 0,2 – 1 μm ochrana před UV zářením ( obsahují barvivo melanin ) můžou distribuovat melanin do ostatních buněk Buněčné inkluse akumulace metabolitů nebo látek různé povahy glykogen ( hepatocyty, kardiomyocyty) ◦ PAS reakce s kontrolním testem, Bestův karmín lipidy ( adipocyty, buňky produkující steroidy, buňky mazových žláz ) ◦ olejová červeň, barviva sudanové řady proteiny – Reinkeho krystaly v Leydigových bb varlete ◦ pigmenty – barevné inkluse a) exogení  prach, uhlíkaté částice ( alveolární makrofágy ), lipochromy ( karotenoidy – žluté zbarvení tukové tkáně ) b) endogenní hematogenní ◦ hemosiderin ( hnědavý pigment obsahující železo ) ◦ ferritin ( 8-9 nm, proteinový komplex obsahující železo ) melanin ◦ melanosomy ( organely ) - tmavě hnědý pigment – výskyt v melanocytech, pigmentovém epithelu sítnice lipofuscin ◦ žlutohnědý pigment ( kardiomyocyty, neurony ), který obsahuje nestravitelné/ nenatrávené látky sekundráních lyzosomů – reziduální tělíska 6. Stavba a funkce biologické membrány Buněčná membrána ( cytoplasmatická membrána; plasmalemma ) obaluje každou eukaryotickou buňku ( cytoplasmatická membrána ) + membránové organely její tloušťka – 7,5 – 10 nm ◦ lze jí zjistit pouze pomocí elektronového mikroskopu funkce: ◦ ohraničení buňky vůči okolí ▪ extracelulární a intracelulární prostředí mají rozdílnou koncentraci iontů – membrána částečně propouští ionty ◦ regulace nitrobuněčného prostředí ▪ reguluje přenos látek do a ven z buňky ◦ selektivní propustnost ◦ je zapojena do specifických rozpoznávacích a signalizačních funkcí, které hrají klíčovou roli při interakcích buněk s okolním prostředím ◦ adhese buněk ◦ regulační funkce chemické složení: ◦ lipidy ◦ proteiny ◦ cukerné zbytky na glykoproteintech a glykolipidech i. lipidy fosfolipidy, cholesterol, glykolipidy fosfolipidy – základní kostrou ◦ amfipatické ( amfifilní ) molekuly ◦ skládají se ze dvou nepolárních ( hydrofobních ) dlouhých řetězců mastných kyseliny, které jsou spojeny s polární ( hydrofilní ) hlavou s nábojem a připojenou fosfátovou skupinou ◦ jsou nejstabilnější – pokud jsou uspořádány do dvojvrstvy ( bilayer ) - hydrofobní konce MK jsou orientovány ke středu a hydrofilní hlavičky k jejím povrchům ◦ do fosfolipidové dvojvrstvy jsou vsunuty různě početné molekuly cholesterolu ( lipid ze skupiny steroidů )  ◦ membrána – model tekuté mozaiky – lipidová dvojvrstva je dvourozměrno kapalinou, v níž jednotlivé složky nejsou rigidně vázány na jednom místě, ale mohou se zde různě ( i když ne zcela volně ) pohybovat ◦ pomocí metody mrazového lomu ( freeze fracturing; kryofrakce ) lze vnější a vnitřní vrstvu od sebe oddělit ◦ asymetrie buněčné membrány – různé složení lipidů ve vnitřním a zevním listu; velmi zřídka se lipidy dostanou na druhý list ( význam při diagnostice ) ▪ například u erytrocytů převládají na zevní straně fosfatidylcholin a sfingomyelin, zatímco na vnitřní straně fosfatidylserin a fosfatidyletanolamin glykolipidy ( lipidy vnější vrstvy ) - mají k sobě připojené oligosacharidové řetězce ( glykosaminoglykány ) ( mohou být připojeny i na proteiny ), které vyčnívají s buněčné membrány a vytvářejí na ní tenký povlak – glykokalyx ◦ určuje antigenní vlastnosti buněčného povrchu cholesterol kumuluje se s transmembránovými proteiny a glykolipidy ( čímž omezuje laterální difuzi - „proplouvání“ vrstvou membrány ) – spolu vytvářejí mikrodomény zvané lipidové rafty ii. proteiny v buněčné membráně tvoří cca 50% hmotnosti rozdělují se na ◦ periferní ▪ připojují se k jedné z obou membránových ploch,hlavně cytoplazmatické - navážou se na jiný, integrální protein ▪ lze je z membrány poměrně jednoduše extrahovat – pomocí solných roztoků ◦ integrální ▪ jsou začleněny přímo do lipidové dvojvrstvy ▪ lze extrahovat pouze pomocí detergentů ( rozruší lipidovou dvojvrstvu ) ▪ nejčastěji prostupují membránou pouze jednou, ale existují i takové, které membránou procházejí z jedné strany na druhou i několikrát ( multipass proteins ) o způsobu začlenění proteinů do lipidové dvojvrstvy rozhodují hydrofobní interakce mezi řetězci MK lipidů a nepolárními AMK proteinů molekuly některých integrálních proteinů vystupují na vnějším nebo vnitřním povrchu membrány  ◦ podobně jak oligosacharidové skupiny glykolipidů vyčnívají z vnějšího povrchu buněčné membrány také cukerné řetězce glykoproteinů – jsou součástí glykokalyxu ◦ uplatňují se jako receptory – prostředníci důležitých mezibuněčných interakcí ( adheze, rozpoznávání buněk, odpověď na působení proteinových hormonů ) v rozložení membránových proteinů, podobně jako lipidů, existují mezi oběma povrchy membrány rozdíly – proto jsou buněčné membrány asymetrické ve fluidní lipidové vrstvě vytváří tekutou mozaiku – proteiny nejsou v membráně volně vázané a mohou se pohybovat v rovině membrány, nicméně v porovnání s lipidy je laterální mobilita řady membránových proteinů často omezena jejich vazbou na cytoskelet iii. cukerné zbytky viz glykokalyx transmembránový transport buněčná membrána je místem, kde dochází k výměně látek mezi buňkou a prostředím druhy: I. pasivní transport po spádu koncentračního gradientu na účet vlastní kinetické energie ( buňka nevydá energii na přenos ) a) prostá difuze ◦ molekula projde z vnějšku skrz dvojvrstvu ◦ pouze pro velmi malé molekuly + bez náboje ( kyslík, oxid uhličitý, … ) b) usnadněná difuze ▪ přenos iontů a malých polárních molekul po koncentračním gradientu přenašečovým proteinem přes selektivně permeabilní membránu ( pasivní transport ) a) zprostředkovaná kanály ▪ kanály – velmi malé póry ohraničené proteiny několikrát prostupujícími buněčnou membránou ( multipass proteins ) ▪ kanály umožňují selektivní přestup iontů nebo malých molekul ▪ otevřením nebo uzavřením konkrétních kanálů ( například pro Na+, K+, Ca2+ ) reagují buňky na nejrůznější fyziologické podněty ▪ některé buňky mají vytvořeny zvláštní kanály pro přestup molekul vody, které sestávají z proteinů zvaných aquaporiny b) zprostředkovaná přenašeči = transportery jsou to transmembránové proteiny, které vážou malé molekuly a přenášejí je přes membránu konformační změnou transporteru c) osmoza difuze molekul vody přes selektivně propustnou membránu  směr pohybu molekul určuje koncentrace rozpuštěných látek – probíhá do dosažení rovnovážného stavu například – krev ve vlásečnicích v důsledku vyšší koncentrace rozpuštěných látek „nasává“ tekutinu z intersticiálních prostorů zpět do plazmy II. aktivní transport látky jsou přepravovány přes membránu proti koncentračnímu gradientu - pomocí zařízení zvaných membránové pumpy membránové pumpy – jsou tvořeny proteiny enzymové povah, které energii potřebnou pro uskutečnění transportu získávají hydrolýzou ATP – proto se nazývají APTázy nejčastěji transport iontů – mají rozdílnou koncentraci na obou stranách membrány ( například N+ - K+ ATPása ) ABC transportéry ◦ MDR ( multidrug resistence proteins ) - význam pro rezistenci rakovinných buněk k cytostatické léčbě membránové receptory ◦ schopné vázat ligand ( například hormon )- cílem vyvolat signál – změna v buňce ▪ vyvolána kaskáda – nakonec signál přenesen na cílové proteiny vezikulární transport makromolekulární látky vstupují do bb vchlípením buněčné membrány ( často po předchozí vazbě na specifické membránové receptory ) a poté se oddělují jako cytoplazmatické vezikuly ( vakuoly ) během procesu endocytózy existují 3 druhy: 1. fagocytóza „buněčné pojídání“ buňky pohlcují velké částice – bakterie, odumřelé bb a jejich fragmenty schopnost fagocytozy mají pouze specializované bb krevního původu ( makrofágy, neutrofilní granulocyty ) po vazbě bakterie na membránu neutrofilního granulocytu jsou v přilehlé oblasti jeho cytoplasmy spuštěny změny polymeračního stavu aktinového cytoskeletu a bb pomocí pseudopodií postupně obklopí bakterii konce výběžků se poté spojí a splynou – bakterie je uzavřena v nitrobuněčné vakuole – fagosom – posléze splyne s lyzosomy 2. pinocytóza „buněčné pití“ bb přijímají extracelulární tekutinu a v ní rozpuštěné látky tekutina je zachycena v malých invaginacích buněčné membrány, z nichž oddělením od membrány vzniknou pinocytotické váčky ( cca 80 nm v průměru ) ◦ obsahují inkorporovanou tekutinu váčky potom migrují ◦ do nitra buňky, kde splynou s lyzosomy ◦ nebo putují až k opačnému pólu buňky, kde po splynutí s plazmalemou uvolní svůj obsah do extracelulárního prostoru transport tekutin a rozpuštěných látek v pinocytotických váčcích z jednoho pólu buňky na druhý = transcytoza 3. endocytóza zprostředkovaná receptory  integrální proteiny se uplatňují i jako receptory pro řadu látek – nízkohustotní lipoproteiny, bílkovinné hormony navázání takových látek – ligandů, na příslušné receptorové proteiny vede ke shlukování receptorů do určitých oblastí bb membrány – ty se potom vchlipují dovnitř bb a oddělí se jako váčky často se uplatňují specifické proteiny v cytoplazmě buňky ( rozhodují i o jejich dalším osudu ) ◦ oblasti buněčného povrchu se shluky obsazených receptorů se vážou s těmito specifickými proteiny a začnou se vchlipovat jako povlečené jamky ◦ povlak na cytoplazmatické straně jamek je v elektronovém mikroskopu středně denzní – způsobeno navázanými polypeptidy a proteinem klatrinem ( má ze všech největší molekulovou hmotnost ) ◦ v souvislosti s molekulárními silami se klatrinové molekuly povlaku seskupují na způsob vzpěr geodetické kopule, které snad napomáhají tvarování a prohlubování jamky – až se odškrtí jako povlečený váček, který obsahuje receptory s navázaným ligandem jiným typem jsou kaveoly ( lat caveolae, malé jeskyně ) s membránovým proteinem kaveolinem ◦ vyskytují se v hojném počtu u endothelových bb u všech popsaných způsobů endocytozy přecházejí z plazmalemy oddělené váčky a vakuoly rychle do periferní cytoplazmy bb a stávají se součástí endosomálního kompartmentu ◦ tvořen dynamickou kolekcí membránou ohraničených tubulů a vakuol ◦ z povlečených váčků se hned po jejich odškrcení oddělí molekuly klatrinu a putují k buněčné membráně – jsou zde použity pro nové povlečené jamky ◦ pohyb váčků v endosomálním kompartmentu je řízen prostřednictvím periferních membránových G-proteinů = Rab proteiny ▪ jsou to malé GTPázy, které vážou nukleotidy guaninu s asociovanými proteiny fagosomy a pinocytotické váčky po vstupu do endosomálního kompartmentu obvykle fúzují s lyzosomy – v nich je jejich obsah odbourán naopak molekuly internalizované endocytozou zprostředkovanou receptory mají v buňce složitější osudy a cesty v endosomech, zejména pozdních, s membránami vybavenými protonovými ATPázami, které podmiňují kyselé pH jejich obsahu, jsou buď aktivovanými hydrolytickými enzymy rozloženy, anebo jsou po odpojení specifických ligandů od receptorů obě složky přemístěny do oddělených endosomů uvnitř endosomu jsou receptory recyklovány a vracejí se k buněčnému povrchu pro nové použití ◦ některé receptory – pro nízkohustotní lipoproteiny; mohou být recyklovány i několikrát po sobě u řady epithelových bb jsou mnohé endosomy zapojeny do transcytozy – uvolňují svůj obsah na různých doménách buněčné membrány vezikulární transport se uplatňuje i při výdeji velkých makromolekul z buňky do jejího okolí = exocytoza exocytoza cytoplasmatické vezikuly s obsahem určeným k vyloučení putují k povrchu buňky a po splynutí s plazmalemou vyprázdní svůj obsah do extracelulárního prostoru bez toho, že by došlo k narušení její integrity u řady buněk spouští exocytozu přechodný vzestup koncentrace vápenatých iontů v cytosolu splývání membrán při exocytoze je řízeno selektivními interakcemi mezi několika specifickými membránovými proteiny může probíhat dvojím způsobem:  1. konstitutivní sekrece buňky vydávají své produkty neustále – bezprostředně po dokončení jejich syntézy například podjednotky kolagenu pro ECM 2. regulovaná sekrece produkty jsou z buněk vylučovány po obdržení signálu například – uvolňování uskladněných trávicích enzymů z buněk exokrinního pankreatu, které je indukováno specifickými stimuly v epithelových bb s regulovanou sekrecí jsou produkty střádány v apikálních doménách buněk, jež hrají důležitou úlohu v sekrečním procesu v průběhu endocytozy se úseky buněčné membrány přeměňují na endocytotické váčky nebo vakuoly ◦ během exocytozy se membrána vrací zpět na buněčný povrch proces oddělování a zpětného začleňování membránových úseků vede k recirkulaci membrán u většiny buněk probíhá obrat membrán permanentně, neboť je důležitý nejen pro udržení strukturní integrity samotné buňky, ale také pro řádný průběh různých fyziologických procesů, mimo jiné k udržování koncentrace lipidů v krevní plazmě v některých buňkách se v části vakuol nebo tubulů endosomálního kompartmentu hromadí uvnitř lumina malé vezikuly vznikající invaginacemi ohraničující membrány, čímž se zmíněné vakuoly či tubuly přemění na multivezikulární tělíska ◦ osud takových tělísek je různý, část fúzuje s lyzosomy, kde je jejich obsah odbourán; část po splynutí s buněčnou membránou vypouští svůj obsah mimo buňku – takto uvolněné malé váčky ( menší než 120 nm ) - exosomy ▪ váčky mohou perzistovat po určitou dobu v intercelulárním prostoru anebo fúzují s jinými buňkami příjem a transdukce signálu buňky mnohobuněčných organismů mezi sebou komunikují – důležité pro vývoj tkání a orgánů, pro růst a dělení bb a pro koordinaci jejich fcí u řady bb uložených těsně vedle sebe jsou pro tyto účely vytvořena komunikační spojení – nexy velmi důležité místo zaujímají i receptory ◦ tvoří v současné době asi 25 rodin ◦ jejich prostřednictvím buňky rozpoznávají různé extracelulární molekuly včetně fyzikálních stimulů a odpovídají na jejich účinek ◦ každý typ bb v lidském těle obsahuje v buněčné membráně a cytoplasmě odlišný soubor receptorových proteinů, který jim umožňuje specifickým a předem naprogramovaným způsobem reagovat s komplementární sadou signálních molekul ◦ bb vybavené receptory vázajícími tyto komplementární signální molekuly ( či ligandy ) se označují jako cílové bb ◦ podle způsobu, jakým jsou signální molekuly ze zdroje dopravovány k cílovým bb se rozlišuje: i. endokrinní signalizace zdrojové signální molekuly – hormony, jsou přinášeny k cílovým bb v orgánech krví ii. parakrinní signalizace ligand chemické povahy difunduje do tkáňové tekutiny – je ale rychle metabolizován a tak účinkuje pouze na cílové bb okolo zdroje iii. synaptická signalizace speciální typ parakrinní inerakce neurotransmitery působí na přilehlé neurony nebo efektorové bb prostřednictvím specializovaných kontaktních oblastí zvaných synapse iv. autokrinní signalizace stejné bb ligandy vyrábějí a zároveň vážou svými vlastními receptory v. juxtakrinní signalizace způsob komunikace zejména mezi buňkami časných embryonálních tkání je odlišný v tom, že signální molekuly tvořené proteiny asociovanými s buněčnou membránou se vážou s receptory cílové buňky až při přímém fyzickém kontaktu obou bb ◦ pro malé signální molekuly hydrofilní povahy, polypeptidové hormony a neurotransmitery – slouží jako receptory integrální proteiny v buněčné membráně cílových bb ◦ existují 3 typy těchto receptorů: i. receptory spojené s iontovými kanály na receptory navázaný ligand způsobí otevření kanálů, kterými malé molekuly nebo ionty procházejí přes buněčnou membránu ii. receptory spojené s enzymy interakce receptorů s ligandem se projeví zahájením katalytické činnosti periferních proteinů plazmalemy iii. receptory spojené s G-proteiny fungují s určitým zjednodušením tak, že po navázání specifického ligandu k receptoru je příslušný G-protein aktivován spojením s GTP potom se oddělí od receptoru a připojí se k jinému cytoplazmatickému proteinu, který aktivuje ◦ ligandy vázající se s membránovými receptory jsou označovány jako – první poslové ▪ aktivací série enzymů zahajují proces signální transdukce biologická odpověď na signál se u cílové buňky projeví změnami v cytoplazmě či jádře, popřípadě v obou součástech buňky současně influx iontů skrz kanály nebo aktivace kináz může aktivovat některé cytoplazmatické proteiny, které signál zesílí  aktivované G-proteiny působí na iontové kanály nebo jiné efektorové proteiny v membráně, které také přenášejí signál dále do buňky jedním z takových efektorových proteinů je enzym adenylátcykláza generující velké množství molekul druhého posla transdukční dráhy, cyklického adenosin fosfátu ( cAMP ) stejnou fci plní také molekuly 1,2-diacylglycerolu ( DAG ) a inositol 1,4,5- trifosfátu ( IP3 ) molekuly druhých poslů výrazně zesílí první signál – tím je aktivována celá kaskáda enzymů včetně kináz, což se následně projeví změnou genové exprese nebo chování cílové buňky malé molekuly druhých poslů snadno difundují a mohou být v cytoplasmě rozptýleny, anebo jsou vazbou s proteiny cytoskeletu místně koncentrovány, což umožňuje cílenou amplifikaci transdukčního procesu v daném okrsku nízkomolekulární hydrofobní signální molekuly – steroidní hormony, hormony štítné žlázy; jsou dopravovány k buňkám krví reverzibilně navázané na transportní bílkoviny plasmy tyto hormony jsou lipofilní a po oddělení od transportní bílkoviny difundují plazmalemou cílové buňky a vážou se na specifické receptorové proteiny v cytoplasmě navázáním hormonu je receptor aktivován a komplex hormon-receptor vstupuje do jádra, kde se s vysokou afinitou naváže na specifickou sekvenci DNA umožňující zesílit transkripci těchto genů každý steroidní hormon je rozpoznáván jiným členem rodiny homologických receptorových proteinů 7. Specializace buněčného povrchu I. apikální i. mikroklky výběžky cytoplazmatické membrány tvar je dán uspořádáním aktinových vláken – přip. Ke kortikální síti u epithelů specializovaných na resorpci vybíhají z apikálního povrchu početné, pravidelně uspořádané, obvykle i stejně dlouhé mikroklky ( villus – klk lat. ) na povrchu tenkého střeva jsou hustě uspořádané a viditelné jako kartáčový/žíhaný lem směřující do lumina orgánu jejich délka je cca 1 mikrometr, šířka 0,1 mikrometru zvětšují povrch až 20-30násobně mikrokly střevního žíhaného lemu – pokryté tlustým glykokalyxem – obsahuje na membránu vázané proteiny a enzymy uplatňující se při natrávení některých makromolekul každý mikroklk obsahuje svazek aktinových filament – jsou příčně propojena mezi sebou i s okolní cytoplazmatickou membránou jsou relativně stabilní – uspořádání mikrofilament je dynamické a mění se na základě interakcí s myosinem - to přispívá k udržení optimálních podmínek pro resorpci, která je realizována prostřednictvím různých kanálů, receptorů a jiných proteinů v plazmalemě AF se pod bázemi mikroklků upínají do terminální sítě kortikálních filament ii. stereocilie jsou nejlépe viditelné na resorpčních buňkách vystýlajících mužský pohlavní systém dlouhé nepohyblivé výběžky zvětšují povrchovou plochu – usnadňují resorpci velmi specializované, známe v lidském těle pouze 2 typy: ◦ specializované stereocilie s funkcí detekce pohybu jsou důležitými součástmi smyslových buněk vnitřního ucha ◦ připomínají mikroklky – obsahují svazky mikrofilament i proteiny vázající aktin; mají podobný průměr a jsou také napojeny na terminální síť buňky jsou ale podstatně delší a méně pohyblivé + jejich konce se mohou větvit iii. řasinky – kinocilie dlouhé, vysoce pohyblivé útvary  jsou delší než mikroklky, namísto mikrofilament obsahují soustavu mikrotubulů kromě pohyblivých řasinek epithelových buněk je u většiny typů buněk vytvořen nejméně jeden kratší nepohyblivý výběžek – primární řasinka ◦ obsahuje receptory a komplexy pro detekci světla, pachů, pohybu nebo průtoku tekutiny kolem buňky jsou hojné na povrchu kubických nebo cylindrických buněk mnoha epithelů typicky jsou 5-10 mikrometrů dlouhé, průměr 0,2 mikrometrů ( mají dvojnásobnou šířku oproti mikroklkům ) každá řasinka obsahuje vnitřní strukturu skládající se z 9 periferních dvojic ( dubletů ) mikrotubulů ( sdílejí několik tubulinových protofilament ) uspořádaných kolem dvou centrálních mikrotubulů ◦ toto usp. 9+2 se nazývá axonema ▪ jsou pomocí bazálních tělísek upevněny v cytoplazmě ▪ bazální tělíska mají strukturu podobnou centriolům – jsou tvořena triplety mikrotubulů a protofilamenty tubulinu vytvářejícími nožky, které ukotvují celou strukturu k cytoskeletu podél periferních mikrotubulů se pohybují kineziny a cytoplazmatické dyneinové motory uplatňující se při transportu molekulárních komponent do těchto struktur a z nich provádějí rychlé pohyby – posouvají proud tekutiny se zachycenými částicemi jedním směrem podél epithelu jejich pohyb se uskutečňuje postupnými změnami konformace axonemy – její přídatné proteiny činí řasinku relativně tuhou, ale i ohebnou na jeden z mikrotubulů každého dubletu jsou vázány komplexy axonemálního dyneinu – vystupují jako raménka směrem k mikrotubulu sousedního dubletu ◦ za přispění ATP se tato raménka na mikrotubulus sousedního dubletu krátce navážou dublety se tak navzájem mírně posouvají – tím dojde k ohnutí axonemy rychlé série těchto posuvných pohybů vytvářejí úderný pohyb řasinky dlouhý bičík, který vybíhá z každé plně diferencované spermie, má stejnou strukturu axonemy jako řasinka + pohyb je zajištěn podobným mechanismem II. bazolaterální i. interdigitace početné výběžky jedné buňky přesně zapadají do prohlubní buňky sousední vyskytují se u buněk, které transportují vodu ii. bazální labyrint = bazální žíhání buněčná membrána vbíhá do nitra buňky a tvoří četné záhyby ( invaginace ) mezi záhyby jsou poté lokalizovány mitochondrie – poskytují E pro transport iontů proti koncentračnímu gradientu v membráně jsou umístěny i integrální membránové proteiny – tvoří iontové pumpy například proximální kanálky ledvin 8. Membránové buněčné organely (buněčné kompartmenty), stavba a funkce - viz ot. 6 9. Buněčné jádro a nemembránové buněčné organely, stavba a funkce NEMEMBRÁNOVÉ BUNĚČNÉ ORGANELY Centrosom u většiny buněk zastává roli hlavního MTOC právě centrosom malá organela uložena blízko jádra obsahuje dva centrioly ( válcovitého tvaru; průměr cca 0,2 mikrometru, délka 0,3-0,5 mikrometrů ) každý centriol se skládá z 9 tripletů mikrotubulů u buněk v interfázi – přítomny v blízkosti centriolů komplexy tubulinu a další proteiny + centrioly jsou na sebe kolmé ( jejich delší osy jsou na sebe kolmé ) během replikace DNA se centrosom zdvojí – každá část obsahuje pár centriolů na začátku profáze se části zdvoj. Centrosomu oddělují a putují k opačným pólům buňky Ribosomy rozměry přibližně 20x30 nm; skládají se z velké a malé podjednotky – z proteinů a rRNA podjednotky: ◦ velká (80S – S rychlost sedimentace ) ▪ 3rRNA + 49 proteinů ▪ slouží jako pepitdyltransferáza – pomáhá tvořit peptidové vazby ◦ malá ( 70S ) ▪ 1rRNA + 33 proteinů ▪ slouží ke shromažďování všech složek pro translaci – mRNA, tRNA ( spolu s molekulami AMK ), včetně elongačních faktorů rRNA zodpovědná za výkon funkce ribosomů ( tj. Translaci mRNA do proteinů ) podmiňují bazofilii cytoplazmy syntetizují polypeptidy z AMK navázaných na tRNA v pořadí určeném mRNA jsou složeny z 4 typů rRNA a několika desítek proteinů rRNA jsou strukturním jádrem podjednotky obklopeným zvnějšku proteiny + rRNA zajišťuje správné začlenění molekul tRNA nesoucí AMK do čtecího rámce + katalyzují tvorbu peptidových vazeb během syntézy bílkovin se na stejné vlákno mRNA váže více ribosomů – vznikají větší komplexy = polyribosomy/polysomy ( na obarvených preparátech jsou silně bazofilní – způsobeno četnými konstitutivními fosfátovými skupinami RNA molekul, které se chovají jako polyanionty ) protheosyntéza: ◦ = genová exprese ◦ gen – informace pro syntézu proteinů, která je kódována strukturou DNA ◦ transkripce – přepis genetické info do nukleotidové sekvence RNA ◦ tranclace – proteiny se tvoří z 20 různých AMK; mRNA – 4 různé nukleotidy ◦ sekvence 3 nukleotidů ( kodon ) určuje jednu AMK ◦ mRNA je dekódována na ribosomech správnou konformaci nově syntetizovaných proteinů řídí proteinové chaperony denaturované bílkoviny jsou označeny ubikvitinem a jsou degradovány v proteasomech volné polyribosomy syntetizují bílkoviny cytosolu, včetně cytoskeletálních proteinů a proteinů, které jsou importovány do buněčného jádra, mitochondrií a peroxisomů ( hemoglobin, aktin a myosin, většina mitochondriálních enzymů ) proteiny určené pro začlenění do membrán a uskladnění v lyzosomech nebo k vyloučení z buňky jsou syntetizovány na polyribozomech membrán ER a jsou během translace transportovány do cisteren ER , 10. Cytoskelet – stavba, funkce a diagnostický význam Cytoskelet uplatňuje se při transportu organel a cytoplazmatických vezikul, zajišťuje mobilitu celých buněk patří sem: a) intermediární filamenta tvoří pevnou síť,která je ukotvená do desmosomů a hemidesmosomů zasahují do kortikální sítě a tvoří lamina fibrosa jaderného obalu vlákla středního kalibru o průměru 10 nm ( tlustší než aktinová filamenta, ale tenčí než mikrotubuly ) vlákna jsou na rozdíl od mikrotubulů a mikrofilament velmi stabilní zvyšují odolnost buněk vůči mechanickému stresu vyskytují se zejména u buněk vystavených mechanické zátěži lze je v buňce detekovat pomocí imunocytochemických metod struktura: ◦ dva fibrilární proteiny jsou spirálovitě obtočeny jeden kolem druhého – tvoří stabilní tyčovité dimery ◦ dimery se antiparalelrně spojují v tetramery – ty se spontánně řadí za sebou a vedle sebe ◦ tetramery – vytváří silnější, lanu podobné svazečky = protofibrily ( protofilamenta ) - jsou stabilizovány postranními vazbami v současné době 6 tříd IF ( mají tkáňovou specifitu ): Třída Protein Velikost ( kDa ) Buněčný typ Onemocnění I Kyselý cytokeratin 40-65 Epithelové b. Některá kožní puchýřnatá onemocnění II Bazický cytokeratin 51-68 Epithelové b. Keratozy ( keratoderma ), dystrofie rohovky III Desmin 53 Svalové b. myopatiee Synemin 190 Svalové b. GFAP 50 Astrocyty (v gliových Alexandrova nemoc buňkách) periferin 57 neurony vimentin 54 Mezenchym. b. IV NF-L 68 neurony  NF-M 110 neurony NF-H 130 neurony alfa-internexin 55 Embryon. neurony V laminy 62-72 Jádra všech bňek Kardiomyopatie, svalová dystrofie, progerie VI nestin 230 Některé kmenové a embryonální buňky intermediární vláknité proteiny – používané jako markery původu buněk: ◦ Keratiny ▪ = cytokeratiny ( cytos – tělo + keras – roh ) ▪ kyselé a bazické izoformy keratinu – tvoří heterodimerní podjednotky – jeden kyselý + jeden zásaditý protein, u všech epithelových buněk ▪ cytokeratiny kódované více než 30 příbuznými geny se liší chemickými a imunologickými vlastnostmi ▪ v epithelových buňkách tvoří IF svazky ( ve světelném mikroskopu zvané tonofibrily ) - vážou se k cytoplazmatickým ploténkám desmosomů, které spojují buňky mezi sebou ▪ během keratinizace epidermis dochází v keratinocytech k akumulaci cytokeratinových filament ( zejména při jejím povrchu ) to snižuje dehydrataci a zvyšuje odolnost epidermis vůči drobným oděrkám ▪ během evoluce keratinizace umožnla živočichům přechod z vody k suchozemskému způsobu života ▪ keratinizací vznikají také zrohovatělé kožní deriváty s ochrannou, okrasnou nebo kamuflážní funkcí – nehty, chlupy, vlasy, rohy, kopyta, peří, zobáky či šupiny u plazů ◦ Vimentin ▪ nejběžnějším proteinem III. Třídy iF ▪ nachází se ve většině buněk mezenchymového původu ▪ do této třídy patří i další 2 proteiny – desmin ( vyskytuje se téměř ve všech svalových buňkách ) a gliový fibrilární kyselý protein – GFAP ( přítomný v astrocytech v CNS ) ◦ Neurofilamenta ▪ jsou to heterodimery podle velikosti tří různých typů – jsou hlavním IF nervových buněk ▪ vyskytují se v těle a výběžcích neuronů ◦ Laminy ▪ = laminová filamenta ▪ tvoří 7 izoforem proteinů obsažených v buněčném jádře – tvoří strukturní podklad jaderné laminy , která přiléhá k vnitřní membráně jaderného obalu IF jsou tkáňově specifické – v patologii slouží jejich imunocytochemická detekce v nádorových buňkách ke zjištění původu nádoru průkaz proteinů IF se provádí rutinními imunocytochemickými postupy vyznačujícími se vysokou spolehlivostí – například GFAP používaný k průkazu astrocytomů ( nejčastější mozkové nádory b) mikrotubuly vystupují z MTOC ( mikrotobuly organizujících center ) průměr okolo 25 nm  silná stěna délka velmi variabilní ( dlouhé až několik mikrometrů ) jsou to přímé tubuly duté válce – 13 protofilament uspořádaných do kruhu tvořeny polymerací tubulinových dimerů – alfa a beta tubulin asociací mikrotubulů vznikají komplexy – axonemy ( součástí řasinek, bičíků ) jsou polarizované - + a – konec ( na + konci dochází k připojování podjednotek – polymeraci, a k jejich prodlužování ) kvůli dynamické nestabilitě je jejich životnost velmi rozdílná ◦ nestabilita se projevuje průběžným střídáním cyklů polymerace a depolymerace ( závisejí na koncentraci tubulinu, Ca2+ a Mg2+ a na přítomnosti MAP – proteiny asociované s mikrotubuly ) doprovodné proteiny mikrotubulů – stabilizují nebo destabilizují mikrotubuly,proteinové motory( kinesin, dynein ) E potřebná pro připojování dimerů k mikrotubulu je získávána hydrolýzu GTP ( jednu její molekulu obsahuje každý tubulinový dimer ) ◦ pokud je GTP na volném konci hydrolyzován dříve než jsou připojeny další dimery – přestane mikrotubulus růst – začíná se zkracovat depolarizací fce mikrotubulů: ◦ nitrobuněčný transport ( včetně axonemálního a axonálního ) ◦ buněčné dělení – zejména dělení jádra a distribuce chromozomů ◦ tvorba bičíků (axonema) a konocilií ◦ udržuje tvar krevních destiček c) aktinová filamenta ( mikrofilamenta ) tvoří kortikální síť pod cytoplasmatickou membránou tvoří vnitřní kostru mikroklků složena z monomerů G-aktinu ( glomulární ) - polymeruje ( za přítoomnosti K+ a Mg2+ ) a vzniká F-aktin ( dvouřetězcová šroubovice ) důležitá pro pohyb buněk měří v průměru 5-7 nm polymerizované polymery, které jsou kratší a podstatně pružnější než mikrotubuly velmi dynamické - + a – konec na kladném konci jsou připojovány monomery aktinu za hydrolýzy ATP, na záporném konci jsou naopak odpojovány permanentní migrace aktinových podjednotek – filamenta jsou neustále přestavována kontrola nad seskupováním podjednotek – buněčné proteiny jako například profilin a kofilin živočišné bňky – hojné zastoupení aktinu ( cca 5% ze všech proteinů buňky ) - vyskytuje se v aktin. Filamentech ale i jako volný – zejména ve vrstvě cytoplazmy pod buněčnou membránou = buněčný kortex ◦ kortikální síť je bohatě větvená, podílí se na zajištění všech buněčných funkcí, na kterých se podílí plazmalema ( endocytoza, exocytoza, migrace a přesuny složek endosomálního kompartmentu ) ◦ také součástí lamelipodií ( tenké membránové výběžky, pomocí nichž se buňky pohybují po pevných substrátech ) ◦ akt. Skelet lamelipodií navazuje na hlouběji uložené paralelní svazky F-aktinu = stresová vlákna aktin-vázající proteiny ( formin atd. ) - zajišťují polymeraci, vytváření svazků, větvení, krácení, zesítění, motorové proteiny proteinové motory AF - myosinové motory ( podobně jako kinesin a dynein přepravují materiál podél mikrofilamen pomocí hydrolýzy ATP )  ◦ pohyb probíhá obvykle od – konce k + konci ( pouze myosin VI putuje v opačném směru ) ◦ myosiny ( připojí se k AF ú ▪ zejména myosin III. ▪ m.V – váže se na sekreční váčky funkce aktinového cytoskeletu: ◦ ukotvení a pohyb membránových proteinů ( včetně buněčných spojení ) ◦ tvorba terminální sítě ◦ vnitřní kostra specializací buněčného povrchu ( mikroklky, stereocilie ) ◦ tvorba buněčných výběžků a výchlipek ( filopodie, pseudopodie, lamellipodie ) - změny tvaru buňky, pohyb, fagocytoza, endo/exocytosa ◦ kontrakce svalových buněk 11. Stavba buněčných spojení buněčná spojení – nejpočetnější v epitelových buňkách ◦ typy: i. těsná spojení ( tight junctions ) utěsňují štěrbinu mezi sousedními buňkami – vždy spojení mezi buňkami = zonula occludens ze všech spojů je uloženo nejblíže apexu buňky spojení tvoří souvislý pás ( = zonula ), který kompletně obkružuje obvod každé buňky v transmisním EM se zdá, jako by membrány sousedních buněk v místě tohoto spoje splývaly nebo byly k sobě velmi těsně přiloženy dochází k utěsnění štěrbiny mezi dvěma buněčnými membránami – založeno na interakcích mezi transmembránovými proteiny klaudinem a okludinem lze je dobře zobrazit metodou mrazového lomu ◦ místo spojení se jeví jako pás složený z jedotlivých větvících se lišt vystupujících z membrány poblíž apikálního konce každé buňky utěsněním mezibuněčné štěrbiny je zajištěno, že molekuly, které prostupují epithelem, musí nezbytně projít buňkami = transcelulární cesta; a nemohou procházet mezi nimi = paracelulární cesta epithely s jednou nebo velmi malým počtem splynulých utěsňujících lišt ( například proximální tubuly ledviny ) jsou více propustné pro vodu a v ní rozpuštěné látky než epithely s početnými liniemi splynutí ( například výstelka močového měchýře ) další fce: ◦ slouží jako překážky omezující přemísťování membránových lipidů a proteinů z apikálního povrchu na laterální a bazální povrchy a naopak ◦ udržují tak dvě rozdílné membránové domény – apikální a bazolaterální; s odlišnými sadami molekul ▪ tyto dvě oblasti buněčné membrány epit. Buněk obsahují pak různé receptory i jiné proteiny – umožňuje odlišné fce: apikální – jsou součástí luminálního kompartmentu tkáně nebo orgánu bazolaterální – jsou součástí bazálního kompartmentu ( zahrnuje i přilehlé vazivo ii. spojení adhezní mezibuněčná spojení - desmosomy, zonulae adhaerentes spojení buňky s mezibuněčnou hmotou – hemidesmosomy, fokální kontakty jsou místem silné soudržnosti buněk a) zonulae adhaerens  pásovité adhezní spojení – spojuje laterální povrchy sousedních buněk- stobvykle se nachází bezprostředně pod těsným spojem je zprostředkována kadheriny ( transmembránové glykoproteiny, které v přítomnosti Ca2+ poutají buňky k sobě ) k cytoplazmatickému konci kadherinů se připojují kateniny ( zprostředkovávají jejich vazbu s AF ) AF připojená k adhezním spojům tvoří část terminální sítě – součást cytoskeletu v apikální části buněk b) desmosom – macula adhaerens desmos – pouto + soma – tělo macula – skvrna tvarem připomíná terčík/knoflík – netvoří pás kolem buňky je to diskovitá struktura – vytvořena na povrchu buňky , která je přiřazena k obdobné struktuře na povrchu buňky sousední obsahuje větší typy kadherinů – desmogleiny a desmokoliny ◦ na jejich cytoplasmatické konce jsou navázány plakoglobiny ( proteiny podobné kateninu ) ◦ plakoglobiny spojují desmoplakiny ( větší proteiny ) do podoby elektrondenzní ploténky ◦ na desmoplaiky jsou pak místo aktinu navázány proteiny IF ◦ k desmosomům epithelu jsou připojeny svazky cytokeratinových filament = tonofilamenta ▪ jsou velmi silná – proto desmosomy zajišťují pevnou soudržnost buněk v rámci celého epithelu c) hemidesmosom není půlka desmosomu :) viditelné v transmisním elektronovém mikroskopu od desmosomů se liší typem transmembránových proteinů – integriny místo kadherinů transmembránové proteiny jsou nepřímo propojeny s intermediárními cytokeratinovými filamenty integriny se vážou primárně na molekuly lamininu v bazální lamině d) fokální kontakty/adhese  připomínají hemidesmosomy, ale jsou drobnější, početnější a zahrnují integriny, na které se něpřímo napojují svazky AF ( k hemidesmosomům jsou připojena IF ) integriny jsou propojeny prostřednictvím paxilinu s kinázou fokálních adhezí KFA je signální protein, který při vazbě integrinu s laminem nebo jinými specifickými proteiny ECM zahajuje fosforylaci intracelulárních proteinů ovlivňující buněčnou adhezi, mobilitu a expresi genu FK jsou důležité u migrujících neepithelových buněk – například fibroblasty iii. spojení komunikační ( gap junction ) = nexus tvoří kanálky umožňující komunikaci mezi sousedními buňkami zprostředkovává komunikaci spíše mezi buňkami než okluzi/adhesi ◦ umožňují přestup nízkomolekulárních látek z cytoplazmy jedné buňky do druhé buňky ( zejména ionty – signální fce ) jsou hojné nejen v epithelové tkáni, ale funkčně se uplatňují téměř ve všech typech tkání savců obsahují shluky komplexů transmembránových proteinů – na buněčné membráně vytvářejí okrouhlé struktury ( lze vidět na preparátech zhotovených metodou mrazového lomu ) transmembránové proteiny = konexiny ◦ vytvářejí hexamerní komplexy - konexony ▪ každý obsahuje uprostřed hydrofilní pór o průměru cca 1,5 nm při spojení dvou buněk se konexiny sousedních buněčných membrán vyrovnají do společné osy – mezi oběma buňkami vytvoří konexony každý nexus je složen z desítek až stovek párů konexonů dovolují výměnu malých molekul některé signální molekuly ( cyklické nukleotidy, ionty ) nexem rychle prostupují – buňky v tkáni vyvíjejí koordinovanou aktivitu a nechovají se jako nezávislé jednotky ◦ například v srdci a hladké svalovině dutých orgánů nexy pomáhají vytvářet rytmické kontrakce 12. Dělení buněk – mitóza a meióza JÁDRO membránou ohraničený kompartment eukaryotických bb obsahuje genetickou informaci, která zajišťuje jejich autoreprodukci, diferenciaci, maturaci a fci stavební složky ( komponenty ) jádra bb v interfázi: ◦ chromatin ( komplex DNA a proteinů ) ◦ jadérko( nucleolus ) ◦ jaderný obal ( tvořený dvěma membránami ) ◦ jaderná matrix ( nukleoplasma ) molekula DNA se skládá ze dvou polynukleotidových řetězců uspořádaných do dvoušroubovice stavební jednotkou chromatinu je nukleosom ◦ skládá se z oktamerového jádra, složeného z 8 histonů ( H2A,H2B,H3 a H4 – z každého typu dvě molekuly ) okolo kterého je dvakrát ovinutá molekula DNA ◦ další segment DNA, s připojeným histonem H1, tvoří spojnici s následujícím nukleosomem šňůra nukleosomů se dále stáčí a vytváří chromatinovou fibrilu o průměru 30-nm, která se skládá v kličky ◦ kličky chromatinové fibrily zakotvené do chromosomové kostry / matrice ( složené z nehistonových proteinů ) tvoří chromatinové vlákno interfázového jádra ◦ podle stupně kondenzace se jeví jako heterochromatin nebo euchromatin ◦ v profázi buněčného dělení dochází k vystupňované kondenzaci chromatinových vláken do formy chromosomů  ◦ a – metafázov