Hemagglutination Assay (HA) PDF

Hemagglutination Assay (HA) o Purpose: ▪ ตรวจหาความเข้มข้นของไวรัสในตัวอย่าง ซึง่ แสดงค่าเป็ น HA unit ▪ ไวรัสบางชนิดสามารถทาให้เม็ดเลือดแดง (RBC) เกาะกลุ่มกันได้ o How it works:[p4,5] ▪ นาสารละลายไวรัสในความเข้มข้นที่แตกต่...

Hemagglutination Assay (HA) o Purpose: ▪ ตรวจหาความเข้มข้นของไวรัสในตัวอย่าง ซึง่ แสดงค่าเป็ น HA unit ▪ ไวรัสบางชนิดสามารถทาให้เม็ดเลือดแดง (RBC) เกาะกลุ่มกันได้ o How it works:[p4,5] ▪ นาสารละลายไวรัสในความเข้มข้นที่แตกต่างกันมาผสมกับเม็ดเลือดแดง 1% ใน 0.85% NSS (นา้ เกลือ) ▪ เมื่อไม่มีไวรัส: ▪ เม็ดเลือดแดงจะตกไปอยู่ท่กี น้ ของจาน (U- หรือ V-bottomed microtiter plate) ▪ เราจะเรียกว่า Button ▪ เป็ น HA negative ▪ เมื่อมีไวรัส: ▪ เม็ดเลือดแดงจะกระจายและเกิดการตกตะกอนสีชมพูในก้นของหลุม (Diffuse pink precipitate) (การจับตัวกัน) ▪ เกิดจากไวรัสมันไปจับกับ RBC และสานกันเป็ นร่างแห่ไม่ให้ RBC ตกตะกอน ▪ เราจะเรียกว่า lattice ▪ เป็ น HA positive  ▪ o Special Terms: ▪ RBC (เม็ดเลือดแดง): Red blood cells ▪ Agglutination (การจับตัวกัน): When cells stick together o RBC ▪ สามารถนาของคนหรือสัตว์ ก็ได้ แต่ตอ้ งเป็ นหมู่เลือด Group o เท่านัน้ [คน] ▪ ทาไมต้องใช้ Group o ? ▪ เนื่องจากไม่มี Antigen A , B ซึง่ จะไปรบกวนการจับของไวรัสกับ RBC o Button o ไวรัสที่สามารถใช้วิธี HA ได้มีดงั นี ้ ▪ Orthomyxoviridae ▪ Influenza A virus ▪ Paramyxoviridae ▪ ไวรัสที่ใช้วิธี HA แล้วตรวจสอบไม่แม่นยา ▪ Flaviviridae ▪ Coronaviridae o Human Influenza (ไข้หวัดใหญ่ในมนุษย์)  ▪ หน้าที:่ ▪ ไข้หวัดใหญ่ในมนุษย์ (Human Influenza) เป็ นไวรัสที่ทาให้เกิดโรคหวัดในคน ▪ การจับกับเซลล์: ▪ ไวรัสไข้หวัดใหญ่จะจับกับโมเลกุลพิเศษที่เรียกว่า α2,6-linked sialic acid (กรดไซ อาลิกที่เชื่อมต่อกันด้วย α2,6) ซึง่ อยู่บนพืน้ ผิวของเซลล์ ▪ โมเลกุลเหล่านีพ้ บใน: ▪ Amniotic Cavity (โพรงแอมเนียติก) ของไข่ไก่ ▪ Allantoic Cavity (โพรงอลานโตอิค) ของไข่ไก่ o การเพาะเชือ้ ▪ การเพาะเชือ้ ในไข่ ▪ เราจะฉีดเชือ้ เข้าไปในไข่ไก่ [ไก่ฟักเป็ นตัว] ▪ โดยต้องฉีดเข้าไป Allantoic cavity ▪ ทาไมไข่ไก่ถึงเพาะเชือ้ ได้ ▪ ไวรัสจะจับกับโมเลกุลพิเศษที่เรียกว่า α2,3-linked sialic acid (กรดไซ อาลิกที่เชื่อมต่อกันด้วย α2,3) ซึง่ อยู่บนพืน้ ผิวของเซลล์ ▪ โมเลกุลเหล่านีพ้ บใน Allantoic Cavity (โพรงอลานโตอิค) ของไข่ไก่ ▪ เราจะบ่มเชือ้ ไว้ในไข่ 2 วัน ▪ หลังจากเพาะเลีย้ งไวรัสในไข่ท่มี ตี วั อ่อนเป็ นเวลา 48 ชั่วโมงที่อณ ุ หภูมิ 37°C ▪ เก็บสารละลายจากโพรงอลานโตอิค (Allantoic Fluid) ออกมา 10 มิลลิลิตรต่อไข่ ▪ การทดลองนีจ้ ะต้องเจือจางสารละลาย allantoic ใน 10% (v/v) formaldehyde ▪ เนื่องจาก ห้องทดลองไม่เหมาะสมต่อเชือ้ o การทดลองนีใ้ ช้ ▪ Influenza A virus HK 68 [ปี ]  ▪ Subtype H3N2 o การทดลอง ▪ เจือจางไวรัสแบบ 2 เท่า (2-fold dilution) โดยเริ่มจากเติม NSS ปริมาณ 50 µL ลงในหลุม A1- A12 ▪ ใช้ autopipette ดูดไวรัสทดสอบปริมาณ 50 µL ใส่ลงในหลุม A1 ▪ ผสมให้เข้ากันโดยดูดส่วนผสมขึน้ ลง 7-15 ครัง้ (ระวังไม่ให้มีฟองอากาศ) ▪ ใช้ Tip เดิม ดูดส่วนผสม 50 µL จากหลุม A1 ใส่ลงในหลุม A2 ▪ ผสมในหลุม A2 ให้เข้ากันดี โดยดูดส่วนผสมขึน้ ลง 7-15 ครัง้ ▪ ดูดส่วนผสม 50 µL จากหลุม A2 ไปใส่ลงในหลุม A3 ▪ ทาขัน้ ตอนนีซ้ า้ จากหลุม A3, A4, A5 จนถึงหลุม A11 ▪ หลังจากผสมในหลุม A11 เสร็จแล้ว ดูดส่วนผสม 50 µL ทิง้ ไป (ทิง้ ใน Beaker ที่มีนา้ ยาฆ่าเชือ้ ) ▪ ปล่อยหลุม A12 ว่างไว้ เป็ นหลุม negative control ที่ไม่มีเชือ้ ไวรัส ▪ เขย่าหลอดที่มี 1% human red blood cell เบา ๆ เพื่อกระจายตัวเม็ดเลือดแดง ▪ ใช้ Autopipette P200 ดูดเม็ดเลือดแดง 50 µL ใส่ลงในหลุม A1-A12 (เปลี่ยน Tip ทุกครัง้ ) ▪ เคาะ microwell plate เบา ๆ เพื่อผสมส่วนผสมในทุกหลุม ▪ ตัง้ microwell plate ทิง้ ไว้ท่อี ณ ุ หภูมิหอ้ งนาน 1 ชั่วโมงขึน้ ไป ▪ ตรวจดูการเกาะกลุ่มของเม็ดเลือดแดงที่กน้ หลุม o Serial Dilution ▪ หรือการเจือจางต่อเนื่อง เป็ นเทคนิคที่ใช้ในการลดความเข้มข้นของสารละลายอย่างต่อเนื่องโดย การนาสารละลายจากหลอดหนึง่ ไปเจือจางในหลอดถัดไปเป็ นลาดับ ซึ่งมีขนั้ ตอนและหลักการ ดังนี:้ ▪ เริ่มต้นด้วยสารละลายต้นแบบ (Stock Solution):  ▪ นาสารละลายต้นแบบที่มีความเข้มข้นที่ทราบมาทาการเจือจางโดยใส่ใน หลอดทดลองแรก โดยมักจะเจือจางด้วยสารละลายเจือจาง (เช่น นา้ เกลือ หรือสารละลายบัฟเฟอร์) เพื่อทาให้ความเข้มข้นของสารลดลง ▪ การถ่ายสารละลาย (Aliquot): ▪ นาปริมาณที่กาหนดจากหลอดแรก เช่น 1 มิลลิลิตร (mL) หรือ 50 ไมโครลิตร (µL) ไปใส่ในหลอดถัดไปที่มีสารละลายเจือจาง เช่น สารละลายเกลือ หรือ สารละลายบัฟเฟอร์ท่มี ีปริมาตรเท่ากัน (เช่น 1 มิลลิลิตร) ▪ การผสมสาร: ▪ ทาการผสมสารละลายในแต่ละหลอดให้เข้ากันอย่างดี เพื่อให้เกิดการกระจาย ตัวอย่างสม่าเสมอในหลอดที่มกี ารเจือจางใหม่ ▪ การทาซา้ (Serial Step): ▪ นาสารละลายจากหลอดถัดมาไปเจือจางในหลอดถัดไปในอัตราส่วนเดียวกัน เช่น ดูด 1 มิลลิลิตรจากหลอดที่ 1 ไปเจือจางในหลอดที่ 2 จากนัน้ ดูด 1 มิลลิลิตรจากหลอดที่ 2 ไปเจือจางในหลอดที่ 3 ทาเช่นนีไ้ ปเรื่อย ๆ ▪ การคานวณการเจือจาง: ▪ แต่ละหลอดจะมีการเจือจางในอัตราส่วนคงที่ เช่น 1:2, 1:10 หรือ 1:100 ขึน้ อยู่กบั วัตถุประสงค์ ตัวอย่างเช่น: ▪ ถ้าเป็ นการเจือจาง 2 เท่า (2-fold dilution) แต่ละหลอดจะมีความ เข้มข้นครึง่ หนึ่งของหลอดก่อนหน้า เช่น 1:2→1:4 ↔ 1:8 ↔ 1:16 เป็ นต้น ▪ ตัวอย่างการใช้งาน: o สรุ ปผลการทดสอบ HA (Hemagglutination Assay): ▪ ▪ 1 HA Unit คือการเจือจางที่ต่าที่สด ุ ซึ่งยังสามารถสังเกตเห็นการเกาะกลุ่มของเม็ดเลือดแดง (agglutination) ได้ ▪ ในภาพ การเจือจางที่ 1:8 คือจุดที่ยงั มีการเกาะกลุ่มของเม็ดเลือดแดงเป็ นอันสุดท้าย ดังนัน้ หน่วย HA เท่ากับ 1:8 ▪ Titer คือค่าผกผัน (reciprocal) ของ 1 HA Unit ดังนัน ้ ค่า Titer ในภาพนีจ้ ะเท่ากับ 8