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Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos FUNDAMENTOS DE LA REACCION EN CADENA DE POLIMERASA `PCR `PCR´´ Y SU APLICACIÓN EN ALIMENTOS Mónica Patr...

Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos FUNDAMENTOS DE LA REACCION EN CADENA DE POLIMERASA `PCR `PCR´´ Y SU APLICACIÓN EN ALIMENTOS Mónica Patricia Osorio Tangarife 30 de Abril de 2009 Ibagué Tolima Universidad del Tolima  Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos Es un tipo de ácido nucleico, nucleico una macromolécula que forma parte de todas las células. Contiene la información genética usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos, siendo el responsable de la herencia de las características genotípicas. ADN el ADN es un polinucleótido constituidos por d‐AMP, d‐GMP, d‐CMP, d‐TMP. Esta formado ppor un nucleótido y a su vez,, está formado p por un azúcar, una base nitrogenada y un grupo fosfato que actúa como enganche de cada nucleótido con el siguiente. Universidad del Tolima  Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos Ácidos nucleídos 3´ Moni Fosfato Di Tri Composición Ribosa Azucares 5` estructural Desoxiribosa Purinas: A ‐ G Bases nitrogenadas Pirimidinas: U ‐ T ‐ C Guanina Timina Citosina Uracilo Adenina (ADN) (RNA) Purinas Pirimidinas Universidad del Tolima  Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos Polinucleótidos constituidos por d‐AMP, d‐GMP, ADN d‐CMP, d‐TMP. Universidad del Tolima Estructura primaria  Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos Polinucleótidos constituidos Ribosa. A diferencia de ADN ARN reemplaza la Timina por Uracilo. No forma dobles cadenas. Constituido por única cadena sin estructura superior. Masa molecular elevada. RNAm Contiene información genética del ADN, para utilizarla en la síntesis de proteínas. Determina el orden en que se unirán los aminoácidos. Se sintetiza i i en ell núcleo ú l celular l l y pasa all citoplasma. Griffiths, A.; Gelbart, W.; Miller, J.; Lewontin, R. 2000. Universidad del Tolima  Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos Reacción en Cadena de la Polimerasa Técnica de biología molecular descrita en 1985 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un ggran número de copias p de un fragmento g de ADN p particular,, partiendo de un mínimo Amplifica un fragmento de ADN; su utilidad es que, tras la amplificación, resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad microorganismos en alimentos. alimentos Universidad del Tolima  Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos F d Fundamentos de d PCR Técnica que permite la copia In vitro de secuencias especificas de ADN. ADN Consiste en la separación por calor de las dos cadenas de ADN que se desea amplificar y su copia simultanea a partir de un punto determinado por un fragmento de ADN artificial llamada cebador, mediante la acción de la ADN Polimerasa. Resultado es la duplicación del número de moléculas de una secuencia concreta de ADN. El proceso se repite un número determinado de veces (30), consiguiendo un aumento o amplificación exponencial de copias del fragmento de ADN molde. Si se parte de una molécula única de ADN en la muestra inicial y en cada ciclo se duplica el numero de moléculas, al final de los 30 ciclos, se obtendrá 230 moléculas idénticas (1`073.741.824 moléculas). Universidad del Tolima  Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos Fundamentos de PCR Desarrollada por Kally Mullis en 1985, utilizando ADN polimerasa del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli. Alta sensibilidad Amplifica únicamente el fragmento La reacción es eficaz si se de ADN que se desea aunque esté parte de una muestra poco Alta especificidad en bajas cantidades o en presencia purificada, en presencia de de altas cantidades de ADN otros componentes semejantes El mayor de los dos fragmentos que se produce en la ruptura proteolítica con subtilisina (serina endopeptidasa) de la DNA polimerasa I de E. E coli. coli Retiene la Fragmento Klenow actividad de 5´→ 3´ polimerasa, posee actividad 3´ → 5' exonucleasa, pero carece de la actividad 5‘ → 3' exonucleasa que se encuentra normalmente en la DNA PM: 68 KDa polimerasa I de E. coli. 5’→ 3’ DNA polimerasa 3’→ 5’ exonucleasa ADN Polimerasa I Holoenzima Proteólisis Fragmento Klenow ADN Polimerasa Exonucleasa 5´ → 3´ 5´ → 3´ 5´ → 3´ Exonucleasa Exonucleasa 3´ → 5´ Universidad del Tolima  Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos Fundamentos de PCR Que se necesita Mg++ Pi Primers Termociclador: Permite realizar ciclos de ADN polimerasa temperatura necesarios Cadena de ADN molde para la l amplificación lifi ió de d ADN Nucleótidos: dNTPs (A, G, C, T) Buffer de la reacción: TRIS‐HCl, TWEEN 20, KCl… Existen otras tecnologías menos populares utilizando distribución de aire caliente en tubos suspendidos, logrando el mismo objetivo de transferir calor eficientemente a la reacción p para q que cambien los ciclos de temperaturas p Universidad del Tolima  Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos Elección de los primers Contengan C y G ∼ 50% Concentración de 0.1 a 0.5 µM 5´ SI 3´ 1 GTATGTAACAGACGGCCAGT 1. Tamaño recomendado de 20 a 30 pb 2. ACCAGCTATGACCATGATGA Evitar C y G en el extremo 3´ NO No largas secuencias de una sola base 5 5´ 3´ 3 1. ACCTCGCGGGGGATCGCGAA 2. TTCGCCCCATCGCCTTCGC Evitar complementariedad entre cada uno y entre varios La ADN polimerasa realiza extensión del primer Extensión del primer usando la cadena complementaria como molde ADN Polimerasa 3 5 dNTPs + Mg ++ 5 3 Universidad del Tolima 3 5  Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos ADN polimerasas Termolábiles Termoestables Temp. óptima de actuación a 42ºC Temp. óptima de actuación a 72‐74ºC ADN polimerasa I de E. E coli Taq ADN polimerasa Fragmento Klenow de ADN polimerasa Tth polimerasa T4 ADN polimerasa No poseen actividad exonucleásica Actividad exonucleásica 3´→ 5´ Taq polimerasa Aumenta la fidelidad: No p posee actividad exonucleásicas. No se añaden cantidades excesivas de Mg++. Se añade igual cantidad para dNTPs en la mínima concentración posible. Universidad del Tolima  Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos dNTPs dNTP dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Se recomienda una concentración de 20 a 200 µM de cada uno La concentración debe ser similar entre cada uno de ellos y se debe relacionar con la Mg++. Buffer de la reacción Composición distinta, dependiendo de las casas comerciales: KCl. TRIS‐HCl. Gelatina. DMSO. Detergentes: Tritón. BSA. PEG… Mg++ La concentración es fundamental para la optimización de la reacción. Contribuye a aumentar la temperatura de hibridación [Mg++]: Disminuye la especificidad Universidad [Mg++]: del Tolima Aumenta la especificidad  Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades PCR Fisicoquímicas de Alimentos El termociclador Perkin Elmer Cetus: Permite la programación flexible de la temperatura Rápido calentamiento y enfriamiento paso a paso para resultados consistentes. Rango de temperatura de 0‐99°C Bloque de aluminio para 48 tubos de reacción de 0.5 0 5 ml. ml Universidad del Tolima  Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos Desnaturación Universidad del Tolima  Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades PCR Fisicoquímicas de Alimentos dATP, dCTP, dGTP y dTTF (cada uno 0.2 mM) 0.625 a 1.25 unidades 10 – 20 pmol de primer de Taq polimerasa R Reacción ió de d la l mezcla l 1 X buffer de PCR (50 mM KCl, 10 mM TRIS‐HCl, 3 mM Cadena de ADN molde o MgCl2 pH 9 a 25ºC) MgCl2, plantilla l ill Volumen final de Superpone con una 25 µl o 50 µl gota de aceite mineral Cada ciclo de PCR consiste Denaturacion a 94ºC por 30´´ Hibridación a 60ºC (para H1 y H2 55ºC) por 30´´ Amplificación a 72ºC por 1´ Muestras de tamaño normal: 35 ciclos Muestras Universidad de tamaño dedel Tolima biopsia: 40 ciclos  Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos Los métodos tradicionales de Control de calidad en las empresas alimentarias se basan en dos únicos procesos, La inspección visual y el análisis microbiológico del Producto final. Esto lleva a una serie de DESVENTAJAS: No detectar en que fase de la cadena de recepción y/o producción se produce la contaminación microbiológica o fisicoquímica del alimentos Se requiere un muestreo estadísticamente significativo lo que supone la recogida de un importante numero de muestras con limitaciones económicas y temporales que ello ll supone. En el caso de detectarse una anomalía, debe d desecharse h T d ell Lote, Todo L t con la l consiguiente i i t pérdida financiera Universidad del Tolima  Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos En muchos casos la industria tiene conocimiento de los problemas cuando el producto ya se halla en el mercado, lo que supone una mala imagen para la empresa y el peligro potencial de que el consumidor desconfíe de esa casa comercial en el futuro. Las técnicas de PCR son rápidas para la detección de microorganismos en alimentos. Se caracterizan por su: Especificidad ibilid d Sensibilidad Corto tiempo de análisis Capacidad de inclusión en sistemas integrados S ill Sencillez Universidad del Tolima Integración en sistemas HACCP Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos Universidad del Tolima Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos Universidad del Tolima Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos Universidad del Tolima Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Fisicoquímicas de Alimentos Universidad del Tolima  Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades REFERENCIAS Fisicoquímicas de Alimentos Wan, J. H.; Trainor, k. J. ; Brisco, M. J.; Morley, A. A. 1990. Monoclonality in B cell lymphoma detectec in paraffin wax embedded sections using the polimerase chain reaction. Clin Pathol; 43: 888‐890. Redondo, G. O. 2007, Abril. Conceptos generales de biologia molecular. Extracción de DNA y reacción en cadena de polimerasa (PCR). Tomado de http://www.aebm.org/jornadas/guadalajara/EXTRACCI%D3N%20DE%20DNA%20Y%20 PCR pdf PCR.pdf Shibata, d. K.; Arnheim. N.; Martin, W. J. 1988. Detection of human papilloma virus in paraffin‐embedded tissue using the polymerase chain reaction. Exp. Med. 167: 225‐230. Ramasamy. I.; Brisco. M.; Morley. A. 1992. Improved PCR method for detecting monoclonal inmunoglobulin heavy chain rearrangement in B cell neoplasm. Clin Pathol. 45:770‐775. Jackson, D. P.; Lewis, F. A.; Taylor, G. R.; Boylston, A. W.; Quirke. P. 1990. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reactions. 43: 499‐ 504. Chen. B.; Clejan. S. 1993. Rapid preparation of tissue DNA from paraffin‐embedded blocks and analysis by polymerase chain reactions. Journal Histochemistry and cytochemistry Vol 41. cytochemistry. 41 No. No 5. 5 Universidad del Tolima  Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades Referencias Fisicoquímicas de Alimentos J.I. Taylor,; C.D. Hurst.; M.J. Davies.; N. Sachsinger.; I.J. Bruce. 2000. Application of magnetite and silica–magnetite composites to the isolation of genomic DNA, J. Chromatogr. A 890 159–166. B. Yoza.; M. Matsumoto.; T. Matsunaga. 2002. DNA extraction using modified bacterial magnetic particles in the presence of amino silane compound, J. Biotechnol 94 2002) 217–224. Biotechnol. 217 224 C.L. Chiang.; C.S. Sung.; T.F. Wu.; C.Y. Chen.; C.Y. Hsu. 2005. Application of super paramagnetic nanoparticles in purification of plasmid DNA from bacterial cells, cells J. J Chromatogr. B 822 54–60. JJ. Sambrook.; Sambrook ; D.W. D W Russell. Russell 2001. 2001 Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Manual third ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. K.H. Wilson.;; R.B. Blitchington.; g ; R.C. Greene. 1990. Amplification p of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase chain reaction, J. Clin. Microbiol. 28 1942–1946. J. Struthers.; R. Westran. 2001. Bacteriología g clínica. Ed. Masson. Premio de la British Medical Association. Universidad del Tolima