Utilidad diagnóstica de la detección de ácidos nucleicos PDF

EDITORIAL Utilidad diagnóstica de la detección de ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa realizada en tiempo real M.ª Gema Codina-Grau y M.ª Teresa Tórtola-Fernández Servicio de Microbiología. Hospital Universitario Vall d’Hebron. Universitat Autònoma de Barcelona. España...

EDITORIAL Utilidad diagnóstica de la detección de ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa realizada en tiempo real M.ª Gema Codina-Grau y M.ª Teresa Tórtola-Fernández Servicio de Microbiología. Hospital Universitario Vall d’Hebron. Universitat Autònoma de Barcelona. España. Las primeras técnicas genéticas utilizadas en el diag- La incorporación de fluorescencia al proceso de PCR se nóstico microbiológico se basaban en hibridación con son- puede hacer de muy diversas maneras, pero las más utili- das de ADN. Aunque de elevada especificidad, en general zadas son colorantes intercalados o bien sondas marcadas. su sensibilidad no es adecuada. Una excepción la constitu- La modalidad más sencilla y económica, si bien la menos yen aquellos procesos que suelen cursar con carga micro- específica, es el colorante SYBR Green. Las sondas fluo- biana elevada, como el caso de la infección cervical por pa- rescentes más usadas son de tres tipos: sondas con activi- pilomavirus, en la que la técnica de captura de híbridos dad 5’ nucleasa (TaqMan), molecular beacons y sondas continúa siendo de referencia. FRET. Las tres se pueden aplicar en microbiología clíni- La estrategia más utilizada para aumentar la sensibili- ca, aunque las sondas FRET son conceptualmente las más dad se basa en crear múltiples copias de un fragmento del complejas. genoma. La técnica de reacción en cadena de la polimera- Cuando nos planteamos implementar este tipo de tecno- sa (PCR) supuso un gran avance y permitió introducir la logía en un laboratorio, podemos recurrir a dos fuentes biología molecular de forma generalizada en los laborato- para obtener los reactivos: preparados por nosotros o bien rios asistenciales. Se trata de una reacción enzimática comerciales en forma de kit. Con un poco de experiencia, la sencilla, rápida y susceptible de ser automatizada. El he- primera opción es relativamente sencilla y encontramos cho que complica y alarga extraordinariamente el proceso numerosos fabricantes que nos preparan el material que es la visualización del producto una vez amplificado, que les indiquemos (“a la carta”). En este caso, es habitual op- debe hacerse por hibridación en solución o en fase sólida tar por la tecnología menos complicada, como los coloran- (southern blot). De esta manera, y según nuestra expe- tes SYBR Green o las sondas Taqman. riencia, se tarda entre 2 a 4 días en poder informar un re- Actualmente, ya hay disponibles en el mercado nume- sultado, y se necesita disponer de personal altamente es- rosos equipos preparados que nos permiten disponer de los pecializado y de un espacio suficiente para poder separar protocolos optimizados y de certificación de calidad. Estos varias áreas de trabajo con la finalidad de evitar la temi- kits comerciales son considerablemente más caros, y es ha- ble contaminación por ADN sintetizado con anterioridad bitual que cubran únicamente las técnicas que generan un (amplicones). mayor número de determinaciones en la práctica clínica: La mayoría de estos inconvenientes se han solucionado virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la con la introducción de la PCR realizada en tiempo real hepatitis o citomegalovirus (CMV). Por el contrario, los (PCR-RT), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto métodos comerciales nos ofrecen las ventajas del control que monitoriza la progresión de la amplificación en el mo- en su producción y gran simplicidad en su realización. mento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencional Las indicaciones de la PCR-RT diagnóstica son en esencia (en punto final), que mide la acumulación ADN al final de las mismas que con la PCR convencional: microorganismos un número predeterminado de ciclos, con PCR-RT esto se de lento crecimiento o de difícil aislamiento. A ellas, po- hace durante el proceso de amplificación usando fluores- dríamos añadir aquellos procesos que por su gravedad pue- cencia, de forma que su aumento es proporcional a la can- dan beneficiarse especialmente de un diagnóstico rápido. tidad de ADN formada. El proceso se puede automatizar Dentro del campo de la bacteriología, nos gustaría destacar fácilmente usando un sistema que realice la amplificación la meningitis (Streptococcus pneumoniae, Neisseria menin- (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluores- gitidis, Haemophilus infuenzae)1 y las infecciones respirato- cencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el merca- rias (Bordetella pertussis, Chlamydophila pneumoniae, My- do. La mayoría pueden trabajar con las diversas opciones coplasma pneumoniae) 2. El diagnóstico por PCR ha sido de marcado fluorescente y son “abiertos”, es decir, permi- tradicionalmente de gran utilidad en virología. Es de espe- ten programar las condiciones de amplificación y lectura cial interés en meningoencefalitis (virus del herpes simple3, de forma que su uso no queda limitado a unos reactivos virus varicela-zóster 3, enterovirus 4) o cuantificación de vi- determinados. rus capaces de establecer latencia (CMV 5, virus Epstein- Barr6 y virus herpes 63). La obtención de resultados durante la fase exponencial Correspondencia: Dra. M.G. Codina-Grau. Departamento de Microbiología. Hospital Universitario Vall d’Hebron. de la síntesis de ADN implica que la PCR-RT es el método P.º Vall d’Hebron, 119-129. 08035 Barcelona. España. más preciso de que disponemos para cuantificar. A pesar Correo electrónico: [email protected] de ello, debemos señalar varias limitaciones del procedi- Manuscrito recibido el 24-8-2006; aceptado el 6-9-2006. miento. En el momento actual no existe un acuerdo inter- Enferm Infecc Microbiol Clin 2006;24(9):539-40 539 Codina-Grau MG y Tórtola-Fernández MT. Utilidad diagnóstica de la detección de ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa realizada en tiempo real nacional sobre puntos de corte para valoración de carga vi- cuente con poco personal y se nos pida una respuesta rápi- ral. Como es conocido, éstos deben establecerse teniendo da. La PCR-RT con preparación de muestra simultánea en cuenta varios parámetros, dependiendo del tipo de mi- es una opción muy atractiva, y el principal inconveniente croorganismo, del paciente (tipo y grado de inmunodepre- actualmente es su precio elevado. sión), o de la técnica. A pesar de que nos encontramos en Por último, quisiéramos señalar que, a pesar de la sim- una fase en que se deben realizar estudios que conduzcan plicidad técnica, la PCR-RT comporta similar complejidad a la normalización de los procedimientos, desde la conceptual que la convencional. El haber trabajado duran- recepción de muestra hasta la validación facultativa, con- te la etapa de la PCR clásica, ardua en numerosas ocasio- sideramos que las técnicas que acabamos de señalar de- nes, proporciona un bagaje valioso cuando debemos utili- berían introducirse en la sistemática asistencial. zar un método aparentemente más sencillo pero que nos En este número de Enfermedades Infecciosas y Micro- va a plantear así mismo problemas técnicos y diagnósti- biología Clínica se presenta un estudio sobre la detección cos. Aunque es posible pasar directamente del cultivo a la de CMV en plasma utilizando SYBR Green I como señal PCR-RT, este proceso se realizará con mayor seguridad si de amplificación 7. Los autores ponen a punto un método podemos contar con la ayuda de profesionales con expe- no comercial, comparando los resultados con otra técnica riencia. de PCR-RT que utiliza sondas FRET, y con antigenemia clásica. Estudian pacientes inmunodeprimidos con y sin Agradecimientos sospecha clínica de enfermedad, y personas sanas. El sis- tema propuesto por ellos es rápido, económico y similar a Muy especialmente al doctor Guillermo Prats Pastor por su es- las técnicas que consideran de referencia. Destacamos, sin tímulo, guía y confianza. embargo, la dificultad ya apuntada anteriormente de ge- neralizar su uso en otros centros hospitalarios por cuanto la preparación de todos los materiales, incluso de los cali- bradores, es a cuenta de cada laboratorio. Remarcamos Bibliografía una vez más la gran importancia de la estandarización, 1. Corless CE, Guiver M, Borrow R, Edwards-Jones V, Fox AJ, Kaczmarski EB. para que técnicas como la propuesta puedan aplicarse en Simultaneous detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae and Streptococcus pneumoniae in suspected cases of meningitis and septice- asistencia y los resultados obtenidos por diferentes centros mia using real-time PCR. J Clin Microbiol. 2001;39:1553-8. sean comparables. 2. Welti M, Jaton K, Altwegg M, Sali R, Wenger A, Bille J. Development of mul- Si queremos introducir la PCR-RT en un laboratorio, de- tiplex real-time quantitative PCR assay to detect Chlamydia pneumoniae, Le- bemos considerar algunos aspectos prácticos. Se trata de gionella pneumophila and Mycoplasma pneumoniae in respiratory tract se- cretions. Diagn Microbiol Infect Dis. 2003;45:85-95. una tecnología mucho más sencilla de realizar que la PCR 3. Watzinger F, Suda M, Preuner S, Baumartinger R, Ebner K, Baskova L, et al. convencional, de manera que con el mismo personal se Real-time quantitative PCR assays for detection and monitoring of pathogenic puede asumir más carga de trabajo, y los resultados se in- human viruses in immunosupressed pediatric patients. J Clin Microbiol. forman el mismo día de recepción de la muestra. 2004;42:5189-98. 4. Verstrepen WA, Bruynseels P, Mertens AH. Evaluation of a rapid real-time Debido a que los tubos que contienen el ADN amplifica- RT-PCR assay for detection of enterovirus RNA in cerebrospinal fluid speci- do ya no se tienen que volver a abrir, prácticamente se mens. J Clin Virol. 2002;25:S39-S43. elimina la contaminación por amplicones. No es necesario 5. Hernando S, Folgueira L, Lumbreras C, San Juan R, Maldonado S, Prieto C, disponer de gran infraestructura con sistemas de ventila- et al. Comparison of cytomegalovirus viral load measure by real-time PCR with pp65 antigenemia for the diagnosis of cytomegalovirus disease in solid ción específicos y ambientes separados de forma absoluta. organ transplant patients. Transplant Proc. 2005;37:4094-6. Por ello, es factible su adaptación a laboratorios pequeños. 6. Ruiz G, Pena P, De Ory F, Echevarría JE. Comparison of commercial real- Actualmente ya podemos encontrar en el mercado siste- time PCR assays for quantification of Epstein-Barr virus DNA. J Clin Micro- mas que automatizan simultáneamente la preparación de biol. 2005;43:2053-7. 7. Varela-Ledo E, Romero-Yuste S, Ordóñez-Barbosa P, Romero-Jung P, Prieto- muestra y la amplificación con una manipulación real- Rodríguez E, Aguilera-Guirao A, et al. Detección de ADN de CMV en plasma mente mínima, de forma que pueden utilizarse en labora- mediante PCR en tiempo real utilizando SYBR-Green I como señal de ampli- torios de urgencias. Es habitual que en esta situación se ficación. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2006;24:541-5. 540 Enferm Infecc Microbiol Clin 2006;24(9):539-40