Espectrometría de masas PDF

Espectrometría de masas en tandem En Genómica podemos hacer varias copias, pero en Proteómica es más difícil. Espectrometría de masas Partimos de biomoléculas que no están cargadas  DEFINICIÓN  Técnica analítica que consiste en:...

Espectrometría de masas en tandem En Genómica podemos hacer varias copias, pero en Proteómica es más difícil. Espectrometría de masas Partimos de biomoléculas que no están cargadas  DEFINICIÓN  Técnica analítica que consiste en:  la formación de iones en fase gaseosa a partir de moléculas sin carga  la posterior determinación de sus masas moleculares El resultado es una representación de la abundancia relativa de los iones producidos frente a su relación m/z 100 904.48 Vamos a obtener unos espectros de 90 masas donde vamos a ver la 80 1296.68 % Intensity abundancia relativa 70 60 50 2094.09 Primero tenemos 40 1570.64 2466.19 los más 30 pequeños 20 3659.68 10 0 0 699.0 1459.2 2219.4 2979.6 3739.8 4500.0 Mass (m/z) Espectrometría de masas - Sensibilidad: permite la identificación de (...)  PROPIEDADES -  Sensibilidad  Rapidez  Automatización  Economía el equipo en sí es caro pero la técnica es económica Espectrometría de masas  ISÓTOPOS  Átomo que pertenece al mismo elemento químico que otro, tiene su mismo número atómico, pero distinta masa atómica  Los isótopos tienen el mismo número de protones que los átomos normales, pero diferente número de neutrones Espectrometría de masas  MASA Masa y abundancia natural de distintos isótopos  Espectrometría de masas  MASA  Daltons (Da) o unidades de masa (u)  Masa monoisotópica:  suma las masas exactas de los isótopos más abundantes de cada elemento presente Forma de un más exacta de medir la masa  ej: H = 1.007825, C = 12.000 (por definición).  Medida más precisa  Elegida cuando hay resolución suficiente Masa monoisotópica Espectrometría de masas  MASA  Masa media  suma las masas químicas medias de los elementos presentes  Tiene en cuenta la abundancia natural de cada uno de los isótopos presentes  No tan exacta, por las variaciones en las abundancias naturales de los isótopos Masa media Cuando los isótopos no estan bien resueltos, el centroide de la envuelta de los picos isotópicos en el grupo, corresponde con la masa media Espectrometría de masas  MASA m/z m/z Espectrometría de masas  ESPECTRÓMETRO DE MASAS  Es una balanza de precisión de moléculas  Determinación muy precisa de masas moleculares o Produce iones en fase gaseosa de las moléculas. o Los mueve, los separa y los selecciona o Los detecta, determinando la relación masa/carga de estos iones Necesitamos una fuente de ionización donde produciremose sos iones donde no están cargados. Es una masa compleja que tenemos que separar FALTA IMAGEN Espectrometría de masas  ESPECTRÓMETRO DE MASAS  Componentes: Espectrometría de masas  ESPECTRÓMETRO DE MASAS  Componentes: Sistema de alto vacío Sistema de Fuente Proceso de Analizador Detector entrada de iones datos Portamuestras MALDI TOF Placa microcanal LC ESI Cuadrupolo Multiplicador de electrones (electroespray) Trampa de iones Sistemas híbridos Orbitrap TIMS FTMS … Espectrometría de masas  ESPECTRÓMETRO DE MASAS  Componentes: Sistema de alto vacío Sistema de Fuente Proceso de Analizador Detector entrada de iones datos Portamuestras MALDI TOF Placa microcanal LC ESI Cuadrupolo Multiplicador de electrones Trampa de iones Sistemas híbridos Orbitrap TIMS FTMS … Espectrometría de masas  ESTRATEGIAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS  Las proteínas deben ser convertidas en péptidos con proteasas utilizado para con dianas de corte conocidas (tripsina) fragmentar  Se mide la masa exacta de los péptidos o sus fragmentos Sabiendo por donde va a cortar una enzima, sabemos (...) sabemos que va a cortar por argenin(?), lo que hace es medir la amsa de cada uno de esos peptidos  Espectrometría de masas  ESTRATEGIAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS  Digestión con tripsina Hay muchas más enzimas que se pueden utilizar en proteómica N C R KR R K RP N C Puede que aquí no haya unc orte N y se Espectrometría de masas  ESTRATEGIAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS  Métodos de identificación:  Huella peptídica (PMF)  Aproximación más sencilla para identificación proteínas: o Fácil y rápido o Sólo pueden identificar proteínas aisladas o Sólo pueden identificar proteínas depositadas en bases de datos o Se suele hacer con MALDI-TOF Necesitamos que ese microrognaismo o células está secuenciado, para poer tuilizar la base de datos  Fragmentación de péptidos (MS/MS o espectrometría de masas en tandem) MALDI-TOF  Fuente de ionización: MALDI (matrix-assisted laser desortion-ionization; desorción/ionización por láser asistida por matriz)  Analizador: TOF (time of flight; tiempo de vuelo;) MALDI-TOF  Espectrometría de masas MALDI-TOF  Preparación de la muestra y matriz  Placa portamuestras  Fuente de ionización: MALDI (desorción/ionización por láser asistida en matriz; matrix-assisted laser desortion-ionization)  Analizador: TOF (tiempo de vuelo; time of flight)  Detector: MCP (placa microcanal) MALDI-TOF  Selección de la matriz La matriz de si vamos a utilizar una proteína, un péptido... Ácido a-Cyano-4-hydroxy- Péptidos10kDa Ácid 2,5- Carbohydratos neutros, Dihydroxybenzoico (DHB) Polímeros sintéticos “Super DHB” Proteínas, Proteínas glicosiladas Ácido-3- Oligonucleótidos Hydroxypicolínico HABA Proteínas, Oligosacáridos MALDI-TOF  MALDI láser 1. La muestra (A) se mezcla con un Placa portamuestras exceso de matriz (M, es un ácido orgánico volátil pequeño) y se seca en una placa portamuestras para MALDI. 2. Flashes de láser ionizan las AH+ moléculas de matriz 3. Las moléculas de la muestra se ionizan por transferencia de protones desde la matriz en fase gaseosa: MH+ + A  M + AH+ +20 kV Se forman iones con una sola carga: AH+ MALDI-TOF  TOF 20-25 kV Tubo de vuelo Detector Fuente de iones Los pequeños van a volar antes que los grandes Principio: Si todos los iones son acelerados con el mismo potencial en un punto determinado en el momento inicial, y posteriormente, se les permite volar, se separarán según sus relaciones masa/carga KE =energía cinética (=zeV) KE = 1/2 Mv2 M =masa v= velocidad 2KE/M = v2 MALDI-TOF  TOF 20-25 kV Tubo de vuelo Detector Fuente de iones Principio: Si todos los iones son acelerados con el mismo potencial en un punto determinado en el momento inicial, y posteriormente, se les permite volar, se separarán según sus relaciones masa/carga Vacío: no rozamiento MALDI-TOF Normlamente  TOF utilizamos plcas microcanal que Fuente Tubo de vuelo permite (...) podemos + +amplfiicar señal esa detector + + V Los iones se forman mediante pulsos de láser. Los iones se aceleran mediante la aplicación de un voltaje Los iones pequeños llegan al detector antes que los grandes Se mide el tiempo que tardan los iones en llegar al detector. MALDI-TOF  MCP  Amplificación de la señal en una placa microcanal (MCP) -1000 V -100 V D= 6 u to 2nd e- Primary Ion e- e- e- e- MCP e- e- e- e- e- e- from Flight Tube + ~103 Amplification per MCP L  MALDI-TOF 4. Los iones son acelerados mediante un 1. Muestra+matriz campo eléctrico adquiriendo la misma se secan en la placa energía cinética. Van atravesando el 5. Los iones golpean el tubo de vuelo y separándose según su detector a distintos tiempos, masa según su relación m/z 20 - 25 kV Tubo de vuelo Cocristalizar con la placa Alto vacío 2. La placa es introducida en el High voltage portamuestras 3. Las muestras son irradiadas con pequeños pulsos de láser láser 6. Un sistema informático, controla los Tim e parámetros del aparato, adquiere las señales/tiempo y procesa los datos MALDI-TOF Hay un reflector al fina de tubo que hace que aumentemos el tiempo de vuelo. Eso significa que aumentamos la resolución. Si no tenemos este reflector y queremos obtener la misma resolución, tendríamos que tener equipos más grandes que ocuparían más espacio.  Huella peptídica Es huella peptidica es unica de esa proteína.  Permite identificar proteínas aislada Lo que usamos mucho es la electoforesis  Estrategias basadas “en gel” bidimensional donde separamos las proteinas segun las caracteristicas de la proteina. La primera es segun su punto isoelectrico y luego lo separamos en funcion de su masa 1 moelcular. En vez de tener bandas tenemos 2 manchas que correpsonden a una proteína o (...) 1 Muestra 2 Separación de proteínas (2-DE) ? 3 Digestión en gel 4 Identificación: PMF (MALDI-TOF) Aquellas manchas que sean de interes las cortamos y (...). Digerimos ese gel con (...) para digereir al proteina dentro del gel. Y tendremos peptidos 3 cripticos de esa proteina. Podemos eluir su (...). Posteriormente lo introducimos en el MALDI-TOF. Obtenemos Vamos a bases de datos un espectrómetro de masas que se llama huella peptidica que es 4 para identificar la proteóna 1000 1500 2000 exclusiva de esa proteññiina Mass (m/z) Huella peptídica  Aplicaciones  PMF: Huella peptídica o Espectro de masas característico de cada proteína obtenido al analizar la mezcla de péptidos obtenidos por digestión enzimática (tripsina) o Este espectro es comparado (mediante motores de búsqueda) con los espectros teóricos calculados de las secuencias proteicas de las bases de datos o Cuando un número adecuado de péptidos coinciden con los péptidos teóricos de una proteína en la bases de datos y cubren un porcentaje adecuado de la proteína: IDENTIFICACIÓN MALDI-TOF: Huella peptídica  Aplicaciones Digestión  PMF: Huella peptídica MALDI-TOF MALDI-TOF: Huella peptídica  Aplicaciones  Espectro de MALDI Abundancia relativa m/z MALDI-TOF: Huella peptídica  Aplicaciones  Motores de búsqueda MALDI-TOF: Huella peptídica  Aplicaciones  Motores de búsqueda MALDI-TOF: Huella peptídica  Aplicaciones Nos permite obtener mapas de  Mapa de referencia 2-DE referencias. Comparacion de una cepa virulenta de otra que no lo 1p2p 3p4p es. Pdi1 8p 9p 5p 6p 7p Hsp90 30p Atp2 Pdi1 Tub2 Pdc11p 18p3a Cpy1 19p 20pAtp2 Gal1 ATP2p 21p Tal1 24p 25p 7a8aF Bm Yst Cip1 h2 1 Sou1 27a Egd2 Ipf5288 16a 26a 28a Ipf2857 Ipf17186 Ipf171 Tef4 86 18a Tsa1 MALDI-TOF: Huella peptídica  Aplicaciones Esto está altamente automatizado  Automatización: Análisis a gran escala para la obtención de la huella peptídica Robot digestor 2D Gel Robot que corta las manchas 1619.28 100 968.64 1251.93 1252.97 2313.69 969.70 2312.76 1621.14 2314.75 1670.25 1619.28 100 968.64 1671.24 1251.93 MALDI-TOF- % 1252.97 2313.69 969.70 2312.76 970.69 1254.00 1621.14 2315.80 1672.14 2314.75 1670.25 1619.28 2366.83 1013.80 100 968.64 836.58 1671.24 1251.93 1060.23 1570.17 2367.90 893.67 1873.46 1061.26 % 1448.14 1853.38 2019.57 2271.83 1252.97 2368.85 2313.69 MS 969.70 1876.41 2036.57 2312.76 2369.91 970.69 1254.00 1672.14 1621.142718.092315.80 0 m/z 2314.75 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 1670.25 2600 2800 1013.80 1619.28 2366.83 100 968.64 836.58 1671.24 1251.93 1060.23 1570.17 2367.90 893.67 1873.46 1061.26 % 1448.14 1853.38 2019.57 2271.83 1252.97 2368.85 2313.69 1876.41 2036.57 969.70 2312.76 2369.91 970.69 1254.00 1672.14 1621.142718.092315.80 0 m/z 2314.75 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 1670.25 2800 1013.80 2366.83 836.58 1671.24 2367.90 (modo 893.67 1060.23 1570.17 1873.46 1061.26 % 1448.14 1853.38 2019.57 2271.83 2368.85 1876.41 2036.57 2369.91 970.69 1254.00 2718.092315.80 1672.14 0 m/z 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 1013.80 2366.83 836.58 1060.23 1570.17 2367.90 893.67 1873.46 automático) 1061.26 1448.14 1853.38 2019.57 2271.83 2368.85 1876.41 2036.57 2369.91 2718.09 0 m/z 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 Obtención de Procesamiento automatizado resultados de los datos y búsqueda en las bases de datos. MS/MS Para microorsganismos que no  Espectrometría de masas en tandem (MS/MS) están secuenciadso  Estrategias “sin gel” basadas en MS La cromografía no separamos (...) 1 Muestra 2 Digestión 3 Separación 4 Identificación (MS/MS) MS/MS  Espectrometría de masas en tandem (MS/MS)  Estrategias “sin gel” basadas en MS MS/MS  Espectrometría de masas en tandem (MS/MS)  Estrategias “sin gel” basadas en MS Espectrometría de masas  ESPECTRÓMETRO DE MASAS  Componentes: Sistema de alto vacío Sistema de Fuente Proceso de Analizador Detector entrada de iones datos Portamuestras MALDI TOF Placa microcanal LC ESI Cuadrupolo Multiplicador de electrones Trampa de iones Sistemas híbridos Orbitrap TIMS FTMS … MS/MS  Purificación de la muestra  Columna de fase reversa: puede ser “on line” o “off line” Reduce complejidad de muestras (separa los péptidos) Se eliminan contaminantes Concentración de analito Se puede acoplar directamente a MS Automatización RT: 10.39 - 28.68 100 - 20.32 90 Base peak chromatogram 17.26 80 70 60 Relative Abundance 50 40 22.22 15.98 19.28 21.41 30 25.08 20 14.80 17.88 10 15.28 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Time (min)  Tenemos peptidos no ionizados que tenemos que ionizar. Crear iones de esos MS/MS peptidos en fase gaseosa  ESI (Ionización por electrospray)  Proceso de generación de iones en forma gaseosa a partir de una muestra líquida, al aplicar un alto voltaje  Acoplado a cromatografía líquida  Produce iones multicargados  La ionización desde líquido: el analito recibe poca E interna. No hay fragmentación en la fuente.  2 analizados en el espacio o 1 analizador MS/MS en el tiempo. TOF-TOF en el espacio. Utilizamos dos analizadores para fragmentar esos peptidos y obtener esos framgnetos(...)  Analizadores de masas  MS/MS usa 2 analizadores de masa (combinados en un instrumento) o el primero selecciona un analito (ion) de una mezcla, o entonces genera fragmentos del ion aislado para obtener información estructural en el segundo analizador. Mezcla de iones 1 único ión Fragmentos Ion MS-1 MS-2 source MS/MS  Analizadores de masas  CID: Disociación inducida por colisión Fragmentación de un ión seleccionado y aislado mediante choque con un gas inerte como el Nitrógeno o el Argón Son colisiones de baja energía Los iones se fragmentan frecuentemente por los enlaces peptídicos dando lugar a una “escalera de iones peptídicos” característica de la secuencia del péptido MS/MS  Analizadores de masas  CID: Disociación inducida por colisión + + + + F L G K F L G K + + b3 y1 F L G K + + + + F L G K F L G K CID b2 y2 + F L G K + + + + F L G K F L G K b1 y3 y 1 y b1 y b3 b2 2 3 K G L F F L G K m/z MS/MS  Analizadores de masas  Espectrómetros de masas en tandem en el espacio: o 1 analizador para cada paso (1 anterior y 1 posterior a fragmentación):  triple cuadrupolo  TOF-TOF  combinaciones de cuadrupolo y TOF ....  Espectrómetros de masas en tandem en el tiempo: o 1 único analizador  trampa iónica MS/MS  Analizadores de masas MS/MS  Analizadores de masas  TOF/TOF Precursor Ion Selector Ion Source Ion Source Analyzer Analyzer #1 Detector Mass Collision Mass Cell #2 #1 Generates and TOF 1 Separates Induces Fragmentation #2 Re-Accelerates Fragments TOF 2 Separates Accelerates Ions of Precursor Fragments Ions MS/MS  Analizadores de masas 4 electrodos de metal en forma  CUADRUPOLO de rodillos , paralelos y de longitud 5-11 cm. Cambia alternativamente la polaridad de los electrodos Permiten avanzar los iones a lo largo de un solo eje: z Usa una combinacion de radiofrecuencia (RF) y corriente continua (DC) opuestas para funcionar como un filtro de masa creando un campo cuadrupolar. MS/MS  Analizadores de masas  CUADRUPOLO Cuadrupolos m1 m2 tienen varios m4 m3 m2 m1 m4 modos de m3 transmision de RF mass scanning mode iones Puede escanear todas las masas https://www.youtube.com/watch?v=qxPb9vFWdqo m1 m2 m2 m2 m2 m2 m4 m3 RF+DC single mass transmission mode Selecciona una masa en un tiempo MS/MS  Analizadores de masas  TRIPLE CUADRUPOLO MS/MS  Espectrometría de masas en tandem (MS/MS)  Estrategias “sin gel” basadas en MS MS/MS  Analizadores de masas Seleccionamos el peptido de itners y abrimos las compuetas de estas trampas y expulsamos las que no queremos. Ese le vamos a fragmetnar, energia de (...) suave y lo fragmetnamos. Vamos a ir separando cada uno de esos fragmetnosd e eso speptidos apra que nos de nuesto espectro de masas de (...) MS/MS  Analizadores de masas  TRAMPA IONICA (MSn) Electrodo en forma de anillo con 2 tapas en los extremos. Top View La trampa de iones genera un campo cuadrupolar para atrapar los iones en una cámara 3D Cambiando las características del campo, los iones pueden ser retenidos o expulsados de la trampa. Cut away side view MS/MS  Analizadores de masas  TRAMPA IONICA (MSn) 1) Atrapamiento (Trapping) 2) Aislamiento (Isolation) 3) Excitación (Excitation) 4) Expulsión (Ejection) MS/MS La trampa iónica  Analizadores de masas Solo podemos  TRAMPA IONICA (MSn) RT: 10.39 - 28.68 hacer MS^n con la 100 20.32 trampa ionica 90 Base peak chromatogram 17.26 80 70 60 Relative Abundance Queremos fragmetnosd e los 50 40 19.28 21.41 22.22 fragmentos. Hariamos un MS, MS/MS, MS/MS/MS. 30 15.98 25.08 20 14.80 17.88 Fragmentos de esos tres 10 15.28 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Time (min) alphabeta10fmole1_2msms # 3148 RT: 16.75 alphabeta10fmole1_2msms # 3149 RT: 16.75 alphabeta10fmole1_2msms # 3150 RT: 16.76 T: + c ESI Full ms [ 500.00-1800.00] T: + c ESI Full ms2 [email protected] [ 215.00-1675.00] T: + c ESI Full ms3 [email protected] [email protected] [ 205.00... 831.61 782.10 680.18 100 100 100 MS MS/MS 883.29 MS/MS/MS 90 90 882.15 90 80 80 80 Hay que hacer 70 70 70 estos experimentos 60 60 60 Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance 996.27 con energia muy 50 50 50 1125.29 suave para no 40 40 40 680.28 981.20 reomper los 30 30 30 567.26 468.15 fragmentos. 20 20 20 304.23 1094.22 1238.43 10 10 567.19 10 976.55 1205.23 1366.43 1124.24 339.24 1300.19 1522.06 1759.24 1487.21 0 0 0 1000 1500 500 1000 1500 500 1000 1500 m/z m/z m/z MS/MS  Análisis mediante sotfware: resultados o “secuenciación de novo”  Proteómica dirigida En westernblot necesita un anticuerpo.. NO TENEMOS  PROTEÓMICA DIRIGIDA (TARGETED-PROTEOMICS) ANTICUERPO PAR TODAS LAS PROTEINAS. identificar y cuantificar las proteínas de interés en muestras complejas biológicas. Un anticuerpo monoclonal puede llegar a tardar 1 año. El coste de los anticuerpo es elevcado. Detecta y cuantifica proteínas específicas Puede detectar proteínas con muy baja cantidad Se buscan péptidos proteotípicos Utiliza péptidos sintéticos marcados Basada en técnicas adecuadas de espectrometría de masas: SRM (selected reaction monitoring) MRM (multiple reaction monitoring) Concentración celular de las proteínas Infinitas aplicaciones estudiadas Proteómica dirigida  PROTEÓMICA DIRIGIDA (TARGETED-PROTEOMICS) Se buscan varios (3) péptidos proteotípicos y sus transiciones (3) por proteína: - Pertenencia a una única especie proteica (identifican la proteína de interés) - Alta frecuencia de observación en diferentes experimentos Proteómica dirigida  PROTEÓMICA DIRIGIDA (TARGETED-PROTEOMICS) El sistema híbrido LC/MS/MS triple cuadrupolo - trampa de iones lineal, QTRAP 5500 Cuantificación de péptidos proteotípicos mediante MRM (Múltiple Reaction Monitoring) alta sensibilidad y especificidad Proteómica dirigida  PROTEÓMICA DIRIGIDA (TARGETED-PROTEOMICS)