Tema 2 Biología de las Células Animales Cultivadas "In Vitro" PDF

Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES MANTENIDAS “IN VITRO” 1. INTRODUCCIÓN 2. ADHESIÓN CELULAR 2.1 Moléculas de adhesión celular 2.2 Uniones celulares 2.3 Influencia de la matriz extracelular (MEC) 2.4 Citoesqueleto 2.5 Movilidad celular 3. PROLIFERACIÓN CELULAR 4. DIFE...

Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES MANTENIDAS “IN VITRO” 1. INTRODUCCIÓN 2. ADHESIÓN CELULAR 2.1 Moléculas de adhesión celular 2.2 Uniones celulares 2.3 Influencia de la matriz extracelular (MEC) 2.4 Citoesqueleto 2.5 Movilidad celular 3. PROLIFERACIÓN CELULAR 4. DIFERENCIACIÓN CELULAR 4.1 Mantenimiento de la diferenciación 4.2 Desdiferenciación 5. SEÑALIZACIÓN CELULAR 6. METABOLISMO ENERGÉTICO 7. EVOLUCIÓN DE LAS CÉLULAS CULTIVADAS 8. TRANSFORMACIÓN Y DESARROLLO DE LÍNEAS CELULARES CONTINUAS 1. INTRODUCCIÓN La validez de los cultivos celulares “in vitro” como modelos fisiológicos ha sido frecuentemente criticada porque las células no mantienen el fenotipo que manifiestan “in vivo” debido a que su micro‐entorno ha cambiado. Las interacciones célula‐célula y célula‐ matriz se reducen o incluso desaparecen debido a la pérdida de la heterogeneidad asociada a una arquitectura tridimensional, además de la falta de determinados estímulos nutricionales, nerviosos y hormonales y la pérdida de la geometría 3D. Esto favorece la expansión, migración y Línea celular embrionaria adherente de lubina DLEC creciendo en monocapa. Castro Moledo, B y proliferación de células progenitoras no Martínez Lasso de la Vega, G. TFG 2023. especializadas en lugar de la expresión de funciones diferenciadas. Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 1. INTRODUCCIÓN Un entorno adecuado es fundamental para la expresión de funciones especializadas. La influencia del entorno puede resumirse en cinco factores: 2. El grado de 3. La 1. La naturaleza del contacto con otras células composición sustrato sobre el que físico‐química y crecen las células fisiológica del cultivadas medio 4. La composición de 5. La la fase gaseosa temperatura del cultivo de incubación A continuación, estudiaremos los parámetros biológicos más importantes que afectan a las células que crecen en cultivos “in vitro”. Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 2. ADHESIÓN CELULAR La mayor parte de células de tejidos sólidos crecen como cultivos adherentes en monocapa y a no ser que hayan sufrido una transformación y se hayan hecho anclaje‐independientes, para su proliferación necesitan estar anclados a algún sustrato. Por tanto, después de la disgregación del tejido en un cultivo “in vitro” o tras su subcultivo o pase tendrán que anclarse sobre el sustrato antes de que éstas comiencen a proliferar. Matriz extracelular: proteoglucanos Interacciones célula‐célula fibronectinas, las lamininas La adhesión celular necesita y las tenascinas una matriz extracelular (ECM) A través de receptores específicos de membrana para componentes de la matriz Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 2. ADHESIÓN CELULAR 2.1 Moléculas de adhesión celular Podemos dividirlas en dos grandes grupos: 1. Moléculas de Adhesión célula‐célula 2. Moléculas de adhesión célula‐matriz 1. Moléculas de Adhesión célula‐célula: ‐ CADHERINAS: dependientes de Ca2+, homófilas, conectan con citoesqueleto y tienen un papel estructural y de señalización. ‐ PROTEÍNAS DE ADHESIÓN ESPECIALIZADAS (CAMs): independientes de Ca2+, proteínas integrales de membrana, homófilas o heterófilas. Interaccionan con integrinas. Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 2. ADHESIÓN CELULAR 2.1 Moléculas de adhesión celular 2. Moléculas de adhesión célula‐matriz: ‐ INTEGRINAS: interaccionan con componentes de la matriz extracelular como fibronectina, laminina o colágeno (heterófilas). Se unen a ellos a través de motivo específico arginina‐ glicina‐ácido aspártico (RGD). Son muy diversas. Interaccionan con el citoesqueleto. ‐ PROTEOGLICANOS TRANSMEMBRANA: receptores de adhesión de la membrana plasmática a los componentes de la matriz extracelular (otros proteoglicanos o colágeno, heterófilas). No interviene motivo RGD. RGD motif Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 2. ADHESIÓN CELULAR 2.1 Moléculas de adhesión celular Las moléculas de adhesión celular se unen entre sí o con las proteínas intracelulares o del citoesqueleto. ADHESIÓN ADHESIÓN HOMOTÍPICA HETEROTÍPICA Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 2. ADHESIÓN CELULAR 2.1 Moléculas de adhesión celular 2.1 Moléculas de adhesión celular En el interior celular Los dominios citoplasmáticos de las moléculas de adhesión están a menudo asociados con proteínas adaptadoras que las unen a distintos componentes del citoesqueleto. Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 2. ADHESIÓN CELULAR 2.2 Uniones celulares Tipos de uniones celulares ‐ Uniones estrechas a) ‐ Uniones adherentes b) ‐ Uniones desmosomas c) a) Uniones estrechas (de oclusión) ‐ Uniones hemidesmosomas d) e) Uniones Gap (comunicantes) ‐ Uniones gap (huecos) e) Todas estas uniones ayudan a la estabilidad celular y el establecimiento de la polaridad b) Uniones adherentes (de anclaje): unión a filamentos de actina La mayor o menor resistencia a la disgregación depende del d) Hemidesmosomas (de anclaje): unión a tipo celular (presencia de c) Desmosomas (de anclaje): unión a filamentos de queratina filamentos intermedios uniones). Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO”  2. ADHESIÓN CELULAR 2.2 Uniones celulares UNIONES CELULARES Ayudan a la estabilidad celular y el establecimiento de la polaridad Confieren mayor o menor resistencia a la disgregación dependiendo del tipo celular (presencia de uniones). 1‐ Uniones estrechas (de oclusión). 2‐ Uniones adherentes (de anclaje): unión a filamentos de actina. Une la cadherina a la actina. 3‐ Desmosomas (de anclaje): unión a filamentos intermedios, queratina. 4‐ Hemidesmosomas (de anclaje): unión a filamentos de queratina. 5‐ Uniones Gap (comunicantes). Conectan las células entre sí por pequeños tubos comunicantes. Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 2. ADHESIÓN CELULAR 2.3 Influencia de la matriz extracelular (MEC) In vivo, la composición de la MEC es diferente según el tipo celular, siendo la propia MEC la que aporta el fenotipo del propio tejido. La composición y complejidad de la matriz extracelular son factores clave que determinan el fenotipo final de la célula en cultivo adherida a esa MEC. Es por ello que diferentes tipos celulares en cultivo necesitan diferentes tipos de MEC. No obstante, existen células capaces de generar su propia MEC en cultivo, aunque si no es así se puede generar artificialmente. Existe un equilibrio dinámico en el que las células adheridas a la MEC controlan su composición y a su vez, la composición de la MEC regula el fenotipo celular. Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 2. ADHESIÓN CELULAR 2.3 Influencia de la matriz extracelular (MEC) PREPARACIÓN ARTIFICIAL DE MEC ‐ Constituyentes purificados (colágeno, fibronectina, laminina recombinantes disponibles comercialmente). ‐ Uso de células que generan MEC y su posterior lavado (tratamiento con Tritón X‐100). ‐ Uso de MatrigelTM y similares, matriz preformada generada por EHS mouse sarcoma que produce grandes cantidades de MEC. Contienen al menos dos componentes de interacción con el sustrato: 1. Adhesión: permite la fijación y expansión que son necesarias para la proliferación (células anclaje‐dependientes). 2. Interacciones específicas: de la célula con la MEC o con células adyacentes. Requeridas para la expresión de funciones específicas. Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO”  2. ADHESIÓN CELULAR 2.4 Citoesqueleto El citoesqueleto Es un entramado tridimensional, Movimientos Integridad celular Desplazamiento celulares, y cohesión intracelular de resistente y dinámico, de proteínas endocitosis (cables orgánulos y que mantiene la forma de las células, y intracelulares), vesículas, fagocitosis, resistir tensiones segregación de provee soporte interno en las células, citocinesis y deformaciones cromosomas organiza las estructuras internas e división celular interviene en el transporte, tráfico intracelular y división celular. Facilita la movilidad celular (cilios y flagelos). Tiene 3 componentes estructurales: filamentos de actina, filamentos intermedios y microtúbulos, que en su conjunto constituyen una red interactiva. Distribución celular de los tres componentes principales del citoesqueleto en una célula animal. Atlas de histología vegetal y animal. Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 2. ADHESIÓN CELULAR 2.5 Movilidad celular ARRASTRE CELULAR (CELL CRAWLING) https://irp.nih.gov/catalyst/21/5/how‐cells‐crawl Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 2. ADHESIÓN CELULAR 2.5 Movilidad celular ARRASTRE CELULAR (CELL CRAWLING) Línea celular altamente migratoria, células de melanoma 1205Lu, embebidas profundamente en hidrogeles de colágeno reticulado Microtúbulos marcados endógenamente (α‐tubulina‐meGFP) Compression‐dependent microtubule reinforcement enables cells to navigate confined environments Nature Cell biology, 26 , 1520–1534 ( 2024 ) 6 Oct 2024 Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 2. ADHESIÓN CELULAR 2.5 Movilidad celular Visitar también https://www.youtube.com/watch?v=TB6H8RoyPh0 https://www.youtube.com/watch?v=V4tmi_Ah1uI Video 1 https://www.youtube.com/watch?v=t3u2_pAEB94 Video 2 https://www.youtube.com/watch?v=mhD7ntMgpMo Video 3 Tinción del citoesqueleto de una célula animal. Atlas de histología vegetal y animal. https://www.microscopyu.com/gallery‐images/madin‐ darby‐bovine‐kidney‐epithelial‐cells‐mdbk‐line Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 3. PROLIFERACIÓN CELULAR Ciclo celular: secuencia : general de acontecimientos que se producen durante la vida de una célula eucariota y se divide en cuatro fases diferenciadas: Fases del ciclo celular M: mitosis G1: gap 1 o intervalo 1 S: síntesis G2: gap 2 o intervalo 2 A veces una fase adicional G0: gap 0 Duración variable Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 3. PROLIFERACIÓN CELULAR Control de la proliferación celular: La entrada de la célula en el proceso de división está regulada mayoritariamente por señales que llegan desde el entorno. La proliferación celular en los cultivos “in vitro” puede y debe ser controlada a través de varios factores, a saber: CULTIVOS DE BAJA DENSIDAD Las células se extienden, permitiendo su entrada en el ciclo celular. La presencia de factores de crecimiento y mitogénicos en el medio de cultivo permite la progresión del ciclo celular. CULTIVOS DE ALTA DENSIDAD Cuando hay demasiadas células en un cultivo se producen fenómenos que comienzan por lo que se denomina inhibición por contacto y cuya consecuencia última es la paralización del ciclo celular. Favorece la diferenciación celular. Para mantener la proliferación celular, debemos evitar la inhibición por contacto, descendiendo la densidad celular, es decir, aumentando la frecuencia de los pases. Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO”  4. DIFERENCIACIÓN CELULAR DIFERENCIACIÓN CELULAR Proceso que conduce a la expresión de las Des‐diferenciación propiedades fenotípicas Diferenciación características de la célula funcionalmente madura in vivo. Las células cambian de un tipo celular a otro, generalmente uno tipo más especializado. Puede ser reversible e irreversible Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 4. DIFERENCIACIÓN CELULAR Clasificación de las células madre según su potencialidad Potencialidad celular: Totipotenciales Pluripontenciales ES Cells: células madre embrionarias PGC cells: células germinales primordiales Multipotenciales Unipotenciales Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 4. DIFERENCIACIÓN CELULAR Dado que las condiciones específicas para la diferenciación celular son distintas de aquellas requeridas para su proliferación debe mantenerse en los cultivos “in vitro”, al menos, dos juegos de condiciones distintas que deben emplearse en un delicado equilibrio. Densidad celular elevada Forma cellular y polaridad Factores de diferenciación Interacciones célula‐célula y célula matriz Densidad celular baja Factores de crecimiento y mitogénicos Propagación celular, nueva interacción con la matriz Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 4. DIFERENCIACIÓN CELULAR 4.1 Mantenimiento de la diferenciación Diferenciación desde Stem Cells. (a) In vivo, un pequeño grupo de células madre da lugar a un compartimento progenitor proliferante que produce el grupo de células diferenciadas (b) In vitro, la diferenciación está limitada por la necesidad de proliferar, y la población se convierte predominantemente en células progenitoras, aunque también pueden estar presentes células madre. También se han cultivado células madre pluripotentes (extremo izquierdo) de algunos tejidos, pero su relación con las células madre tisulares aún no está clara. Las condiciones de cultivo seleccionan principalmente el compartimento de células progenitoras en proliferación del tejido o inducen a las células que están parcialmente diferenciadas a revertir a un estado progenitor. Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 4. DIFERENCIACIÓN CELULAR 4.2 Desdiferenciación ¿Por qué ocurre? Desdiferenciación inducida OCT‐3/4 es un factor de transcripción temprano que Las células diferenciadas revierten a un fenotipo mantiene la pluripotencia y la autorenovación de células anterior para adaptarse (desarrollo de células madres embrionarias madre inducidas Ips: Induced Pluripotent Stem) SOX2, es un factor de transcripción cuya función es esencial en el mantenimiento de la auto‐renovación de las células madre embrionarias no diferenciadas Mala elección de la línea seleccionada KLF 4 es un factor de transcripción En células madre para el cultivo “in vitro”. embrionarias, KLF4 ha demostrado ser un buen indicador de la plasticidad de las células madre para desdiferenciarse. c‐Myc es una fosfoproteína nuclear que juega un papel Mal equilibrio entre proliferación y importante en la regulación de la expresión génica en diferenciación. células humanas; Uno de los avances más Ausencia de los inductores adecuados importantes de la para el mantenimiento de la investigación con células diferenciación. madre, ya que permite obtener células madre Las células revierten de manera natural a pluripotenciales a partir de un fenotipo anterior (aplicación células células adultas: estudio de IPs). enfermedades, usos terapéuticos (trasplantes), investigación básica. Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 5. SEÑALIZACIÓN CELULAR In vivo, la proliferación celular, migración, diferenciación y apoptosis están reguladas por las interacciones cell‐cell, cell‐matrix y señales nutricionales, hormonales y nerviosas. IN VIVO AUTOCRINAS: actúan sobre las mismas células HOMOCRINAS (paracrinas homotípicas): actúan sobre células similares adyacentes ENDOCRINAS PARACRINAS: interacciones heterotípicas entre Ej: Insulina, diferentes tipos de células glucocorticoides (sistémicos) Desde las glándulas endocrinas a través de los vasos sanguíneos ¿¿IN VITRO?? Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO”  5. SEÑALIZACIÓN CELULAR Además… La uniformidad de la respuesta del tejido diana está facilitada por uniones comunicantes o gap junctions, calcium signaling y In vitro, las señales son posiblemente por factores homocrinos de la autocrinas y homocrinas célula estimulada. Podemos simular las señales endocrinas incluyendo hormonas en el medio de Los efectos mediados por contacto también cultivo incluyen complejos de unión (desmosoma‐ adherente‐estrechas) y desmosomas. Estos, junto con las integrinas, señalizan vía citoesqueleto, que impone la posición, forma y polaridad de la célula. Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO”  6. METABOLISMO ENERGÉTICO METABOLISMO DE LA GLUCOSA La glucosa es una de las principales fuentes de C que utilizan las células en cultivo. La mayoría de los medios de cultivo contienen 4‐20 mM de glucosa. Uso metabólico de la glucosa lactato IN VIVO los niveles de O2 son regulados por la hemoglobina NAD+ NADH + H+ Si demasiado bajos generación de Ac. IN VITRO los niveles de O2 son Láctico por fermentación anaerobia, mantenidos modificación del pH ↓↓. artificialmente Si demasiado altos generación de radicales libres y muerte celular. METABOLISMO DE LA GLUTAMINA La glutamina es otra de las fuentes de C que utilizan las células en cultivo. El uso de Glutamina incorpora, por oxidación y transaminación, α‐ cetoglutarato al ciclo del ácido cítrico, pero genera amonio como subproducto, que in vitro no puede ser debidamente eliminado y es tóxico para la célula. Por ello también se utilizan los dipéptidos glutamil‐alanina y glutamil‐ glicina minimizan la formación de amonio además de ser más estables en el medio. Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO” 7. EVOLUCIÓN DE LAS CÉLULAS CULTIVADAS INICIO EVOLUCIÓN SENESCENCIA Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO”  8. TRANSFORMACIÓN Y DESARROLLO DE LÍNEAS CELULARES CONTINUAS Obtención de líneas celulares continuas: ‐ Líneas transformadas: espontáneas o inducidas. ‐ Líneas tumorales. ‐ Líneas embrionarias. Algunos ejemplos… Tema 2 BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS ANIMALES “IN VITRO”