Técnicas de Cultivo Celular - PDF

TEMA 1: PRINCIPIOS Y MÉTODOS BÁSICOS DE CULTIVO CELULAR activamente. A medida que proliferan, las células TÉCNICAS DE CULTIVO CELULAR establecen conexiones con...

TEMA 1: PRINCIPIOS Y MÉTODOS BÁSICOS DE CULTIVO CELULAR activamente. A medida que proliferan, las células TÉCNICAS DE CULTIVO CELULAR establecen conexiones con otras células cercanas, Las técnicas de cultivo celular consisten en el cultivo de formando una capa celular que cubre la superficie del células dispersas obtenidas de un tejido a partir de frasco de cultivo. disgregación mecánica, enzimática o química, o de líneas Cuando las células alcanzan la confluencia, es decir, celulares establecidas. Originalmente, estas técnicas se cuando el frasco se llena de células y la superficie denominaban “cultivo tisular”. Además, el término también disponible se agota, el medio de cultivo se consume debido se ha utilizado para referirse a cultivo tridimensionales de al crecimiento celular. En ese punto, es necesario realizar tejidos que no han sido disgregados, conocidos como un subcultivo o pase celular, que consiste en transferir una “cultivo de órganos”. En estos, en lugar de separar las porción de estas células a un nuevo frasco o medio de células individuales de un tejido, se cultiva el tejido en su cultivo fresco. Este proceso permite continuar la forma intacta, manteniendo su estructura tridimensional proliferación celular en condiciones óptimas, evitando que original, que permite estudiar cómo se comporta el tejido se saturen o se vean afectadas por la falta de nutrientes en de manera más cercana a su estado natural dentro del el medio anterior. cuerpo ya que conserva su arquitectura y organización celular. Durante el proceso de subcultivo o pase celular, las células pueden experimentar cambios con respecto a las células El proceso comienza con un explante de tejido humano, el originales. Esto ocurre porque, con cada división y pase cual se coloca sobre una superficie de vidrio o plástico en sucesivo, las células acumulan pequeñas variaciones un medio de cultivo adecuado para intentar mantener el genéticas o epigenéticas, lo que significa que no son clones tejido vivo. Sin embargo, uno de los desafíos principales es idénticos de las células iniciales. Estas variaciones pueden que el tejido en su conjunto no se puede propagar de afectar su comportamiento y características a lo largo del forma efectiva, ya que las células en su estado organizado tiempo. Para evitar la acumulación de demasiados cambios no se dividen de manera activa. que podrían alterar la función o las propiedades del cultivo, Sin embargo, si alguna de las células del tejido migra las células se congelan en etapas tempranas de espontáneamente fuera de este y sobrevive en el medio de crecimiento, cuando aún conservan sus características cultivo, tiene el potencial de dividirse. Si el entorno es el originales. Luego, cuando es necesario trabajar con ellas adecuado, esa célula podrá proliferar, es decir, dividirse nuevamente, se descongelan para continuar los continuamente. A medida que las células se dividen, van experimentos o la investigación, garantizando que se formando una población creciente que eventualmente utilizan células lo más parecidas posible a las iniciales. llenará el recipiente de cultivo, dando lugar a una mayor cantidad de células a partir de la célula original migrante llenando el frasco. Este proceso es clave en el establecimiento de un cultivo celular exitoso. En lugar de esperar a que una célula migre espontáneamente desde el tejido colocado en el medio de cultivo, se puede acelerar el proceso utilizando disgregantes químicos. Estas sustancias, como las enzimas tripsina o colagenasa, facilitan la disociación del tejido al romper las uniones entre las células, favoreciendo su individualización. Al emplear estos agentes, se obtiene una HISTORIA suspensión de células individuales mucho más 1885 Roux: Mantiene células embrionarias de rápidamente, lo que permite que cada célula quede libre pollo en solución salina durante varios días, pero para comenzar a dividirse de manera activa en el medio de las células a la larga no sobreviven. cultivo. Una vez que las células han sido individualizadas mediante el uso de disgregantes químicos, comienzan a dividirse  1907 Harrison: Cultiva médula espinal dióxido de carbono (CO2) que reciben las embrionaria de anfibios. Observa el crecimiento de células de cultivo. los axones de los neuroblastos, y establece que el o Fisiológicas: composición del medio de axón se formaba por expansión a partir del cuerpo cultivo en nutrientes, metabolitos, neuronal y no por fusión de una cadena de células. hormonas… El trabajo con cultivo celular proporciona muestras 1910 Burrows: Logra identificar un medio de homogéneas y una buena caracterización cultivo adecuado (plasma) para nutrir los explantes (capacidad de identificar, analizar y describir de (los fragmentos de tejido extraídos y puestos en el manera precisa las propiedades biológicas, medio de cultivo) de tejidos embrionarios de pollo. fisiológicas y genéticas de las células). Economía experimental (vs in vivo): el trabajo con 1912 Burrows y Carrel: Comprueban que las cultivo celular es barato en comparación con células pueden proliferar en cultivo. animales. El uso de cultivos celulares presenta ventajas 1916 Rous y Jones: Emplean por primera vez éticas significativas en comparación con los tripsina (disgregante químico) para disociar estudios in vivo, al reducir la necesidad de células. experimentar con animales y minimizar el sufrimiento. 1952 Gey: Establece una línea celular continua de carcinoma cervical humano conocido actualmente DESVENTAJAS DE LAS TÉCNICAS DE CULTIVO como “LÍNEA CELULAR HELA”. CELULAR Una desventaja del trabajo con cultivos celulares La línea celular HeLa, obtenida en 1951 de un es el riesgo constante de contaminaciones por tumor cervical de Henrietta Lacks, es notable por microorganismos, lo que exige condiciones su capacidad de dividirse indefinidamente en estrictas de asepsia. cultivo. Esta característica la hace muy útil para la El coste elevado del equipamiento y materiales investigación en cáncer, virología y biología celular. necesarios es otra desventaja significativa de A pesar de sus importantes contribuciones trabajar con cultivos celulares. científicas, la obtención de estas células sin el consentimiento informado de Henrietta Lacks ha A nivel biológico, los cultivos celulares presentan suscitado debates éticos sobre el consentimiento desventajas frente a los estudios in vivo, ya que los en la investigación. cultivos están fuera del contexto, no están en la estructura 3D en la que está el organismo vivo: o Inestabilidad de las poblaciones celulares 1954 Rita Levi-Montalcini: Establece que el factor (inestabilidad genética, desdiferenciación, de crecimiento nervioso (NGF) estimula el selección…) Ej: en determinado momento crecimiento de los axones en tejidos en cultivo un clon comienza a proliferar más rápido. favoreciendo la formación de redes neuronales o Falta de control nerviosos y endocrino. (Premio Novel 1986). o Ausencia de estructura 3D y de relaciones intercelulares específicas. 1955 Eagle: Realiza el primer estudio sistemático o Cambios relacionados con el metabolismo de los requerimientos nutricionales de las células energético. en cultivo. CARACTERÍSTICAS DE LA CÉLULA CULTIVADA 1961 Hayflick y Moorhead: Comprueban que los fibroblastos humanos en cultivo mueren tras un El cultivo primario se obtiene a partir de células extraídas número limitado de divisiones. directamente de un tejido mediante disgregación enzimática, mecánica o química, o por migración celular. VENTAJAS DE LAS TÉCNICAAS DE CULTIVO CELULAR Son células capaces de proliferar pese a haber perdido las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular que Control de las condiciones fisicoquímicas y son las que normalmente proporcionan señales de fisiológicas crecimiento y supervivencia. o Fisicoquímicas: pH, temperatura, presión osmótica, presión de oxígeno (O2) y de Se produce un proceso de selección (se escogen aquellos ejemplares que poseen las características más deseables para optimizar el rendimiento, la calidad o la adaptación a Epiteliales: las células tienen forma determinadas condiciones ambientales). poligonal con dimensiones más regulares y crecen adheridas a un Cuando ocupan toda la superficie disponible de la botella sustrato en parches discretos. se dice que han alcanzado la confluencia. En esta etapa, las células establecen contactos entre ellas que inhiben su Linfoblastos: las células son proliferación y el crecimiento se detiene. esféricas y generalmente crecen en suspensión sin Para mantener el cultivo es necesario trasplantar las adherirse a una superficie. células a un nuevo soporte (diluirlas en nuevo medio de Suelen ser de origen cultivo y pasarlas a otros frascos) y realizar sucesivos sanguíneo. subcultivos o pases. En este caso se habla ya de línea celular. Además de las categorías básicas mencionadas anteriormente, ciertas células presentan características CRECIMIENTO EN MONOCAPA morfológicas específicas según su función especializada en el organismo. Las células crecen adheridas sobre un soporte sólido (plástico o vidrio). Células neuronales: Son células muy especializadas por lo que tienen morfología propia. Existen en diferentes formas En anclaje al sustrato es un prerrequisito para la y tamaños, pero se pueden dividir de manera general en proliferación celular. dos categorías morfológicas básicas: tipo I, con axones Es el modo normal de proliferación de la mayor parte de las largos que se utilizan para transmitir señales a largas células con excepción de las células hemotopoyéticas. distancias, y tipo II, sin axones. Una neurona típica proyecta extensiones celulares con muchas ramas desde el cuerpo CRECIMIENTO EN SUSPENSIÓN celular, lo que se conoce como árbol dendrítico. Las células neuronales pueden ser unipolares o seudounipolares, con Son independientes de anclaje. Es propio de células dendrita y axón emergiendo del mismo proceso; bipolares, hemotopoyéticas, células madre, de algunas líneas con axón y dendrita única en extremos opuestos del soma transformadas y de algunas células tumorales (que como (la parte central de la célula que contiene el núcleo); o son muy agresivas pierden la capacidad de anclaje y multipolares, con más de dos dendritas. crecen en suspensión): Líneas celulares finitas: dejan de dividirse tras un número limitado de divisiones en cultivo (ej. fibroblastos, 25-40 divisiones). Superado ese límite, las células entran en una etapa que se denomina senescencia en la que pierden su capacidad de proliferar (supuestamente por el acortamiento de los telómeros) y eventualmente mueren. Líneas celulares continuas: sufren una transformación que les hace capaces de crecer indefinidamente (ej. HeLa). MORFOLOGÍA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO Pueden sufrir dos tipos de transformaciones: Las células en cultivo se pueden dividir en tres categorías Transformación espontanea (mutación) básicas según su forma y apariencia (es decir, morfología). Transformación inducida (radiaciones, virus, La morfología nos indica con que clase de célula estamos agentes químicos…) trabajando y nos da información sobre su comportamiento. Es un cultivo Fibroblásticas (o similares a fibroblastos): las que entra en células son bipolares o senescencia, multipolares, tienen al dejar las formas alargadas y células sin crecen adheridas a un cambiarlas sustrato. de medio, y las dejas proliferar hasta que llenen la placa, y en ese momento entrarán en senescencia. CARACTERÍSTICAS DE LAS CÉLULAS van a seguir dividiéndose, aunque tengan TRANSFORMADAS IN VITRO por ejemplo menos suero (donde se encuentran los factores de crecimiento). Relativas al núcleo o Bajos requerimiento de factores de o Alta crecimiento. relación o Inmortalidad (capacidad de dividirse núcleo- indefinidamente). citoplasma o Capacidad de inducir tumores. La imagen muestra la CULTIVOS 3D comparación entre tejido de colon normal y tejido de adenocarcinoma de colon. En el adenocarcinoma se Las células en cultivo pierden muchas características tras observan características de células transformadas como un la disgregación (separación) del tejido. Por ello se están aumento en la relación núcleo/citoplasma, pérdida de volviendo a la utilización de explantes de tejidos y órganos. polaridad celular y núcleos grandes con poco citoplasma, típicos de células cancerosas. En ellos se retienen la estructura histológica y fisiológica original de las células, así como sus relaciones o Alteraciones cromosómicas (en número y intercelulares. estructura) Presentan limitaciones: Relativas a la superficie celular Necrosis por difusión pobre del O2 a las zonas o Cambios en la membrana plasmática más profundas del tejido (transporte, movilidad de proteínas, No se pueden propagar aumento de blebbing: formación de Variabilidad grande invaginaciones de la membrana) Reproducibilidad baja o Cambios antigénicos, de glucoproteínas de membrana, lo que afecta a su CULTIVOS HISTOTÍPICOS Y ORGANOTÍPICOS interacción con otras células y su (CULTIVOS 3D) capacidad para evadir el sistema inmunológico. Alteraciones de la adherencia CULTIVO HISTOTÍPICO o Independencia de anclaje: disminución de Es un cultivo celular tridimensional en el que se busca la la necesidad de adherencia a superficies. amplificación de un solo tipo celular en ambiente Las células normales requieren anclarse a tridimensional que mimetice la estructura original del una superficie para crecer y dividirse, pero tejido. las células transformadas pierden esta necesidad, lo que les permite proliferar en Esferoides: clusters de células suspensión y volverse más invasivas. formadas por reasociación de o Disminución de la capa externa de células en cultivo. Pueden fibronectina (participa en la adherencia crecer en suspensión o en la celular). En células transformadas, la capa parte superior de una matriz 3D. de fibronectina disminuye, facilitando la Se pueden obtener por varios pérdida de adhesión y el movimiento. métodos: o Desorganización de las fibras de estrés → Método de la superficie no adherente (haces de filamentos de actina), hace que (para evitar que las células se puedan disminuya la integridad estructural de la adherir al plástico favoreciendo la célula y favorece la invasión. formación de esferoides) o Aumento de la producción de proteasas, y → Cultivo en suspensión: por lo tanto, incremento de la proteólisis agitación/viscosidad del medio extracelular. → Método de la gota colgante Relativas al crecimiento y división o No inhibición del crecimiento por densidad cellar. Llegan a formar mini tumores. Cuanto menos dependiente sea del medio de cultivo mas agresivo va a ser por lo que  SISTEMAS DE CULTIVO TRIDIMENSIONAL EN LA INVESTIGACIÓN DEL CÁNCER: ENFOQUE EN EL MODELO DE ESFEROIDE TUMORAL Estos sistemas se emplean para estudiar el crecimiento y el comportamiento de las células tumorales en un entorno que simula más fielmente el microambiente tumoral en el cuerpo humano, en comparación con los cultivos bidimensionales tradicionales. Aquí se describen los tres tipos de modelos presentados en la imagen: A) Explante de tejido (Tumor tissue explant) Se parte de una biopsia de tumor, eliminando el tejido adiposo y otros componentes no deseados. Posteriormente, se divide en fragmentos más pequeños. Los fragmentos de tumor se colocan en un plato de cultivo recubierto con matriz y se sumergen en un medio de cultivo. Este modelo mantiene la arquitectura y las interacciones En una placa Petri se ponen gotas que contienen células de celulares del tumor original, siendo útil para estudios sobre ese tipo celular. Se juega con la viscosidad del medio de la respuesta del tumor a fármacos y su crecimiento en cultivo. Se genera un ambiente con humedad muy alta, y condiciones in vitro. las gotas permanecen en la tapa de la placa Petri y las células se reasocian en la gota formando esferoides. Esferoides multicelulares (MCTS: Multicellular tumor spheroids): para observar interacciones entre células. B) Organotípico (Tumor on a chip) CULTIVOS ORGANOTÍPICOS Es un sistema que permite recrear el entorno Se caracterizan porque constan de varios tipos celulares tridimensional del tumor y su microambiente. que interaccionan entre sí de una forma que intenta ser lo Contiene células tumorales, células endoteliales (que más similar posible a la original. A diferencia de los cultivos forman vasos sanguíneos), matriz, y células inmunes. Un histotípicos (compuestos por un solo tipo celular), los sistema de cámara neumática permite la perfusión de cultivos organotípicos buscan imitar la complejidad del nutrientes y oxígeno para simular mejor las condiciones tejido natural, incluyendo la disposición espacial y las fisiológicas. interacciones célula-célula y célula-matriz. Se utiliza para estudiar la interacción del tumor con su entorno (como con los vasos sanguíneos y el sistema Los cultivos organotípicos constituyen la base de la inmune) y para pruebas de fármacos más precisas. ingeniería de tejidos. Este tipo de cultivos persigue la creación “in vitro” de tejidos u órganos completamente funcionales que puedan ser utilizados en injertos o en trasplantes. Requieren el diseño de soportes especiales que crean una interfaz en el aire/medio. Esto es crucial para ciertos tejidos como la piel, donde las capas superficiales están expuestas al aire, mientras que C) Esferoides tumorales (Tumor spheroid) las capas más profundas se encuentran en I. Monocultivo (Monoculture): contacto con un medio de nutrientes. o Se utiliza una suspensión de células tumorales individuales que se colocan en un pozo recubierto con matriz. Las células se agregan para formar esferoides homogéneos.  Útil para estudios de crecimiento tumoral TIPOS DE LABORATORIO DE CULTIVO CELULAR y resistencia a medicamentos en un entorno más fisiológico. II. Co-cultivo (Co-culture): NIVELES DE BIOSEGURIDAD o Se parte de una suspensión de células Atendiendo a los agentes biológicos con los que se va a tumorales mezcladas con fibroblastos (un trabajar, los laboratorios se clasifican como: tipo de célula del tejido conectivo). Las células se agregan para formar Laboratorio básico– nivel de bioseguridad 1 (BSL- esferoides heterogéneos, que simulan 1) mejor la heterogeneidad celular y la Laboratorio básico– nivel de bioseguridad 2 (BSL- interacción tumoral con células del 2) microambiente. Se da la reasociación de Laboratorio de contención– nivel de bioseguridad dos tipos celulares. 3 (BSL-3) Permite estudiar la interacción entre Laboratorio de contención máxima– nivel de diferentes tipos de células, como la bioseguridad 4 (BSL-4) influencia de los fibroblastos en la Las designaciones del nivel de bioseguridad se basan en progresión del tumor y la respuesta a una combinación de las características de diseño, tratamientos. construcción, medios de contención, equipo, prácticas y procedimientos de operación necesarios para trabajar con ORGANS-ON-A-CHIP agentes biológicos de los distintos grupos de riesgo. Los cultivos organotípicos o cultivos 3D (como los organs- on-a-chip) son modelos experimentales que recrean la AGENTES BIOLÓGICOS estructura y función de tejidos u órganos humanos en un entorno tridimensional. Estos cultivos integran diversos Microorganismos, con inclusión de los genéticamente tipos celulares, matrices extracelulares y un entorno modificados, cultivos celulares y endoparásitos humanos, controlado para simular con mayor precisión las susceptibles de originar cualquier tipo de infección, alergia condiciones fisiológicas de un órgano. o toxicidad. Agente biológico del grupo 1: nula o escasa probabilidad de causar una enfermedad al ser humano. o Ejemplos: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, ciertas cepas de Escherichia coli. Agente biológico del grupo 2: puede causar enfermedades (supone un riesgo para los trabajadores) pero existe muy baja probabilidad de que se propague a la comunidad y se dispone de RESUMEN profilaxis o un tratamiento eficaz. o Ejemplos: Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii Agente biológico del grupo 3: puede causar enfermedades graves (peligro serio para los trabajadores) y la infección puede propagarse con cierta facilidad a la comunidad, si bien existen posibles medidas preventivas o terapéuticas. o Ejemplos: VIH, Coxiella burnetii, Mycobacterium tuberculosis. Agente biológico del grupo 4: puede causar enfermedades graves (peligro serio para los trabajadores) y la infección puede propagarse con cierta facilidad a la comunidad. No existe profilaxis o un tratamiento eficaz disponible. o Ejemplos: Virus del ébola, de Marburg y de Lassa LOS BÁSICOS EN UN LABORATORIO DE CULTIVO CABINAS DE FLUJO LAMINAR CELULAR La función principal de un flujo unidireccional/laminar es Cabina de flujo laminar proporcionar un área de trabajo libre de partículas y Incubador de CO2 contaminación. Esto se consigue gracias a la ausencia de partículas al ser filtrado el aire por un filtro de alta Microscopio invertido eficiencia HEPA (high efficiency particulate air). El filtro Centrífuga para tubos HEPA retiene partículas desde un tamaño de 0.3 µm con Contador de células una eficiencia del 99,97% que hace que el aire que incide sobre mi muestra esté estéril y no contamine. Filtros ULPA Material estéril (Ultra Low Penetration Air): 99,9995% de eficiencia para la Contenedor para desechar material biológico filtración de partículas MMPS (0,1-0,25 micras). El aire impulsado debe tener una uniformidad de velocidad Baño termostático controlada acorde a la normativa a cumplir. Congeladores y depósito de N2 líquido Las cabinas pueden tener configuración vertical o horizontal. Supone una gran diferencia, ya que la vertical LA IMPORTANCIA DE MANTENER UNA TÉCNICA hace que el aire incida verticalmente sobre nuestra ASÉPTICA PARA EVITAR CONTAMINACIONES muestra protegiéndolas, y, sin embargo, la horizontal índice Asepsia: ausencia absoluta de gérmenes. Sin infección o además de sobre la muestra, sobre ti, y eso no garantiza tu contaminación. Conjunto de procedimientos o métodos seguridad. para evitar la contaminación. Exclusión continua de microorganismos contaminantes (no excluir toda forma de Ofrece una protección de la muestra, del operador y vida como pasa con la esterilización). medioambiental. Esterilización: eliminación de toda forma de vida de un Las recomendaciones son las siguientes: encender la material o medio. Conjunto de procedimientos que lampara ultravioleta 30 min antes (como germicida: Que destruyen los gérmenes, impiden su desarrollo y evitan destruye gérmenes, especialmente los dañinos), no contaminación. generar corrientes de aire y cambiar periódicamente los filtros. Desinfección: conjunto de procedimientos para destruir o eliminar agentes contaminantes de todo lo que no pueda esterilizarse (por ejemplo: mobiliario o materiales que no se pueden esterilizar). Si los medios de cultivo de vuelven amarillos o naranjas están contaminados, ya que el rojo fenol vira de color conforme se acidifica el medio debido a la presencia de bacterias. Hay varios tipos de cabinas dentro de las verticales: las de clase I no son adecuadas para trabajar con cultivos. Las de Contaminantes de cultivo celulares: clase II se subdividen según las distintas velocidades y % Químicos: impurezas en el medio, suero o agua, incluyendo de aire reciclado (A1, A2, B1 y B2). endotoxinas, plásticos y detergentes. Biológicos: bacterias, levaduras, hongos, micoplasma (bacterias sin pared celular que provocan en el cultivo cambios que no se observan a simple vista, como cambio de color del medio), virus y otras líneas celulares. INCUBADOR DE CO2 usadas con los microscopios invertidos para el estudio de las células vivas. Permite un control de la temperatura, la humedad y la presión parcial de CO2. Se utilizan para las técnicas de fecundación in vitro. La T óptima depende de la temperatura corporal del animal del que proceden las células. También varía según el tejido HEMOCITÓMETRO (ej. testículo). El hombre y la mayoría de los animales de El hemocitómetro es un dispositivo de laboratorio utilizado sangre caliente: 36,5-37ºC. Excepciones: aves (39-40ºC), para contar la cerdos (38,5ºC) concentración de células en La humedad es elevada para evitar la evaporación del una muestra medio de cultivo. líquida. Consiste en El nivel de CO2 suele ser de en torno al 5%. El CO2 en la una cámara fase gaseosa se disuelve en el medio, estableciéndose un equilibrio con los iones de bicarbonato y estabilizando el con una cuadrícula pH. La mayoría de las líneas celulares crecen bien a pH de grabada que permite visualizar y contar el número de 7.4, pero el pH óptimo para una determinada línea celular células bajo el microscopio. puede variar: fibroblastos (7,4-7,7), células transformadas (7-7,4). RECUENTO CELULAR AUTOMATIZADO: CONTADOR El nivel de O2 es variable. La presión atmosférica (21%) es ELECTRÓNICO Y ANÁLISIS DE IMAGEN suficiente para células en cultivo. El requerimiento es El recuento celular automatizado utiliza dispositivos mayor en el cultivo de órganos (hasta un 95%). La electrónicos y análisis de imagen para contar y caracterizar profundidad del medio de cultivo puede influir en la tasa de células con mayor precisión y rapidez: difusión del O2 a las células (aconsejable 2-5 mm altura; 0,2 a 0,5 mL/cm2). 1. Contadores Coulter: Miden cambios en la resistencia eléctrica cuando las células pasan por una apertura En los más modernos: + filtro HEPA + inyección agua estrecha, determinando número y tamaño celular. filtrada. 2. Análisis de imagen: Usa microscopía y software para MICROSCOPIO INVERTIDO identificar y contar células basándose en características visuales. El revólver portaobjetivos se encuentra debajo de la 3. Citometría de flujo: Detecta y cuenta células en platina. La platina se suspensión al hacerlas pasar por un rayo láser, midiendo encuentra en posición fija y propiedades como tamaño, complejidad y fluorescencia. para enfocar la muestra lo que se mueven son los objetivos. ´ RECIPIENTES DE CULTIVO Y SUSTRATOS La fuente de luz y el condensador se localizan en la Las células hematopoyéticas y algunas células parte superior. transformadas pueden proliferar sin adherirse al sustrato. Crecen en suspension. La amplia distancia de trabajo que así se genera permite observar especímenes o La mayoría de las células son dependientes de anclaje: muestras gruesas, como células creciendo en medios de necesitan adherirse al sustrato (matriz o base sólida) para cultivo de varios milímetros de espesor. dividirse. Permiten observar las muestras situadas en el fondo de un Originalmente se utilizó el vidrio (barato, fácil de lavar, recipiente. Esto es muy útil para mantener las muestras esterilizable, ópticamente claro). Hoy en día se utiliza hidratadas y permite hacer observaciones de muestras plástico (poliestireno) con una superficie totalmente plana y vivas durante largos periodos de tiempo. propiedades ópticas superiores. El poliestireno es hidrofóbico, no adecuado para la adhesión celular, por eso El contraste de fases, la interferencia diferencia o la debe recibir un tratamiento químico o con radiación γ, para fluorescencia… son algunos de las técnicas de observación producir una superficie con carga y capaz de humedecerse para permitir que se dé la unión de células al fondo. En algunos casos se usan recubrimientos de proteína de la matriz extracelular para mejorar la adherencia (colágeno, fibronectina, laminina). LOS MEDIOS DE CULTIVO CONGELACIÓN Las células en cultivo de mamífero no toleran aumentos de más de 2º C por encima de su temperatura óptima (las humanas mueren rápidamente a 40ºC). Toleran muy bien las disminuciones de temperatura, no como el aumento, que aumentando 2 grados por encima de su crecimiento optimo se mueren. En cambio, pueden tolerar disminuciones de temperatura: Las formulaciones más comunes: pueden sobrevivir varios días a 4ºC o ser congeladas (- 80ºC; -196ºC en nitrógeno líquido). Para su congelación MEM o EMEM: medio esencial mínimo de Eagle, necesitan de agentes crioprotectores (DMSO o glicerina) Eagle´s minimum essential medium para evitar la formación de cristales de hielo que rompan DMEM: medio de Eagle modificado por Dulbecco, las paredes de las membranas para que luego en el Dulbecco´s modified Eagle medium proceso de descongelación puedan ser viables. RPMI: formulación de Roswell Park Memorial Institute APLICACIONES DEL CULTVO CELULAR Otros: F12 (Ham´s nutrient mixture), Opti-MEM, Media 199 El cultivo celular es una de las principales herramientas utilizadas en biología celular y molecular, proporcionando Soluciones salinas: ej. PBS (Phosphate-Buffered Saline) excelentes sistemas modelo para estudiar la fisiología y bioquímica normal de las células (por ejemplo, estudios Contienen sales inorgánicas y en algunos casos, metabólicos, envejecimiento), los efectos de fármacos y glucosa y bicarbonato compuestos tóxicos en las células, así como la Para diluir medios, hacer lavados e incubaciones mutagénesis y carcinogénesis. También se utiliza en la cortas (no más de 4h siempre y cuando lleven detección y desarrollo de medicamentos, y en la glucosa) producción a gran escala de compuestos biológicos (por Son soluciones isotónicas, pero no ejemplo, vacunas, proteínas terapéuticas). La principal necesariamente nutrientes ventaja de utilizar cultivos celulares en estas aplicaciones es la consistencia y reproducibilidad de los resultados que Suero (5-20%) (Excepcionalmente se puede no utilizar se pueden obtener a partir de un lote de células clonales. suero porque hay ciertas células transformadas que van a adquirir esa independencia del medio que les rodea y son capaces de crecer sin factores de adhesión que es lo que aporta el suero) Los más comunes: FBS (suero fetal bovino), el de ternera recién nacida, de caballo y humano. Contiene factores de crecimiento y factores de adhesión. Fuente de minerales, lípidos (vitaminas liposolubles) y hormonas. Se obtiene mediante coagulación-filtrado (para obtener solo suero)-control (para ver que no está contaminado)-inactivación para evitar que haya linfocitos citotóxicos que puedan alterar el cultivo. Importancia de la adquisición de lotes completos para evitar variabilidad en los resultados.