T.1 Intro a la Técnica del Cultivo Celular PDF

**T.1 INTRO A TÉCNICA DEL CULTIVO CELULAR** **DESARROLLO HISTÓRICO** **Roux** Células de embrión de pollo en una solución salina durante 13 días (cultivo tisular in vitro) **Haberlandt** Inicia cultivo in vitro en vidrio de células vegetales aisladas en medios con glucosa (no se multiplicaban) *...

**T.1 INTRO A TÉCNICA DEL CULTIVO CELULAR** **DESARROLLO HISTÓRICO** **Roux** Células de embrión de pollo en una solución salina durante 13 días (cultivo tisular in vitro) **Haberlandt** Inicia cultivo in vitro en vidrio de células vegetales aisladas en medios con glucosa (no se multiplicaban) **Harrison** Primer cultivo de tejido animal (médula espinal embrionaria de anfibio) done explica la formación del axón de las neuronas. **Burrows y Carrel** Esencial: medios nutritivos (plasma suplementado con extractos de embrión-pollo) e inicio de asepsia Células de mamífero (perros, gatos, conejos, tumores sólidos) La prolongación de la vida en cultivo es mayor que la vida en el organismo mediante subcultivos. Frasco de Carrel: mantenimiento de asepsia, soporte **Rous & Jones** Extractos enriquecidos en tripsina para disociar las células de embriones de pollo, estableciendo el primer cultivo celular. 1920-1940 hubo avances en condiciones de asepsia y esterilidad (primeros antibióticos Flemming) **Sanford** Cultivar células aisladas. Para que una célula se divida necesita ser alimentada con nutrientes correctos. **1920-1970** se desarrollan técnicas de micropropagación vegetal (fitohormonas, factores crecimiento) **George Gey** Se establece la 1º línea celular humana Célula HeLa células en cultivo durante más tiempo de la vida de la persona. Medio complejo y poco definido: plasma de pollo, extracto de embrión bovino y suero de cordón umbilical. Características: - Células tumorales (cancerígenas que se dividen constantemente y son agresivas) proliferan rápidamente (ensayos a gran escala) - Inmortales (telomerasa extremadamente activa; por cada duplicación se pierde fragmento de los telómeros) - Cancerosas (acumulación de numerosas mutaciones) No hubo consentimiento no sabía que usaban sus células ni la madre (Henrietta ni los hijos) a raíz de ahí nació el CI. Sirvió para sacar la vacuna de polio necesitaban células que se dividiesen y muy rápido iguales para testear dif cosas en dif tiempo **Rita Levi-Montalcini y col.** Factor de crecimiento nervioso estimula el crecimiento de los axones en tejidos en cultivo **Eagle** Requerimientos nutritivos de las células en cultivo **Hayflick** cultivación de cultivos fibroblastos es finita podía mantenerse durante 12 pases (pasan células de una placa a otra) se podían hacer al cultivo antes de morir. **1968** primer trasplante de médula ósea alogénica (donante compatible) **Augusti-Tocco y Sato** Se establece la línea de neuroblastoma **1970** Comercialización de materiales para cultivo celular animal y vegetal **1980** proceso inmortalización o transformación celular. **1988** 1º trasplante de células madre de cordón umbilical **1990** medicamentos a escala industrial en biorreactores **1991** se aísla y cultiva células madre estromales: *Mesenchymal Stem Cells* (MSC): Bases para la regeneración de tejidos, terapia celular**.** Células mesentimales son multipotentes dan lugar diferentes linajes como adipocitos, condrocitos y osteocitos. **1995** 1º trasplante por ingeniería de tejidos: reparar o reemplazar parcial o totalmente tejidos (cartílago) **1998** se aísla y cultivan células madre embrionarias humanas (hESC) utilización clínica **2002** aíslan células progenitoras multipotentes de tejidos adultos humanos (MAPCs) esperanza como alternativa a hESC. Las células madre adultas más estudiadas hasta ahora son las que se derivan de la médula ósea - Células totipotentes: capaces de dar lugar a todos los linajes embrionarios y adultos - Células pluripotentes: capaces de dar lugar a todos los tipos de células en un adulto - Células multipotentes: capaces de dar lugar a múltiples células dentro de un linaje Cuando se fecunda: 1º son totipotentes, 2º multipotentes y 3º pluripotentes o multipotentes **2007** iPSc(induced Pluripotent Stem cells) Reprogramación de células adultas se derrumba el paradigma de la desdiferenciación (sólo células animales embrionarias o indiferenciadas pueden diferenciarse) Shinya Yamanaka demostraba que la introducción de 4 factores de transcripción (factores Yamanaka), en fibroblastos embrionarios y adultos de ratón, inducía su reprogramación a células madre pluripotentes (iPS) con características similares a las células madre embrionarias, capaces de inducir el desarrollo embrionario y generar todo un organismo. Los factores transcripción activan transcripción de genes relacionados con pluripotencia por eso añadiendo factores se puede volver a obtener células pluripotentes **2008** 1º trasplante tráquea híbrida generada con células madre adultas sobre estructura acelular de tráquea donada. **2011** trasplante de una tráquea generada con células madre adultas sobre una estructura 3D bioartificial. Sin embargo, estos trasplantes se ha visto recientemente que no tuvieron éxito y han generado gran polémica **2011-2017** nuevos trasplantes de distintos órganos sencillos (vejigas, vías respiratorias superiores, arterias, piel, etc) generados con células madre y estructuras artificiales, algunas de ellas generadas mediante impresoras 3D. Procedimientos experimentales y todavía costosos. **2011-Actualidad** obtención de nuevos tejidos a partir de células madre adultas e iPSc humanas. **CULTIVOS ANIMALES** - Diferencia con células vegetales: plasticidad limitada Plasticidad celular: capacidad que tiene una célula para diferenciarse - Sólo las células madre pueden dividirse indefinidamente y dar lugar a distintos linajes celulares **Explantes primarios** Es un fragmento de tejido o de órgano en una interfase sólido-líquido donde las células se adhieren a la superficie. Las células de la periferia del explante pueden migrar y proliferar por la superficie del soporte.  **Cultivos de células disociadas** Es un cultivo *in vitro* (más utilizado: cultivo celular)**.** Según su morfología: en suspensión o en monocapa Se obtiene mediante: explantes primarios, cultivos primarios**.** Su disgregación del tejido: métodos mecánicos o enzimáticos**.** Pérdida de contacto con la matriz extracelular**.** Proliferación posible. [Según mortalidad] - **Cultivo celular finito** - **Cultivo primario** - Baja densidad mediante pases se mantiene el fenotipo celular normal, no transformante - Con medios selectivos se pueden mantener distintos tipos celulares de un mismo explante. - Tras un número de pases el cultivo entra en senescencia (envejece) - Ej: hepatocitos hígado adulto, neuronas, macrófagos peritoneales - **Línea celular primaria** - Ej: células endoteliales de aorta bovina (BAEC), células endoteliales de cordón umbilical (HUVEC en cultivo de 3 a 9 pases), fibroblastos dérmicos (pueden superar los 20 pases), queratinocitos. - **Cultivo celular continuo** - **Línea celular continua** - Ej: HeLa, Raw, Jurkat [Según morfología in vitro] Epiteliales, tejido conjuntivo, tejido muscular, tejido nervioso adherentes (monocapa) Sangre, tejidos linfoides, células madre embrionarias o adultas en suspensión - **Cultivos en monocapa o adherente** - Cultivo en superficies de cristal o plástico tratado: placas Petri, frascos de cultivo o de Roux, botellas rodantes, placas multipocillo - Células anclaje-dependientes: no proliferan hasta que se han adherido al sustrato (plástico o vidrio) - Método usado para célula excepto hematopoyéticas - Confluencia: inhibición por contacto - Para obtener grandes producciones de células adherentes: microsoportes o microcarriers: microbolas que proveen un soporte y facilitan la adhesión y crecimiento de las células - Mayor ratio área de superficie-volumen, por lo que favorecen cultivos en un menor espacio - **Cultivos en suspensión** - Cultivo en frascos agitados o en botellas donde, aunque no hay agitación, las células no se adhieren al sustrato - Células dispersas en el medio de cultivo - Crecimiento no depende del anclaje - Solo para células hematopoyéticas, ciertas células madre y líneas celulares transformadas - Confluencia cuando el número de células es grande y los nutrientes son insuficientes. **Cultivo de órganos** Ventajas: - Órgano sobre una rejilla en la interfase líquido-gas de un medio nutritivo al que puede liberar desechos - Se mantiene parcialmente la arquitectura del tejido in vivo - Se conservan las interacciones histológicas y los tipos celulares diferenciados: buena réplica del tejido de origen Desventajas: - No crecen mucho (proliferación celular limitada a las células embrionarias de la periferia) - No se puede propagar: se necesita un nuevo explante para cada experimento - Más complejo - Limitada reproducibilidad de la muestra - Cantidad de material que se puede cultivar es reducida **Cultivo organotípicos (Ingeniería de tejidos)** Ingeniería de tejidos - Combinar co-cultivos de distintos tipos celulares y/o células madre - Soportes biocompatibles 3D que permitan generar una estructura similar a un órgano real.  **Principales aplicaciones de cultivos celulares** Cultivo celular: conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células in vitro, manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. **CULTIVOS VEGETALES O MICROPROPAGACIÓN** **Características de las células vegetales:** - Células totipotentes: elevada plasticidad- capacidad para alterar su metabolismo, crecimiento y desarrollo en función de las condiciones ambientales - Elementos esenciales: iones, vitaminas y aminoácidos. - Fuente de carbono (no siempre son fotosintéticas en cultivo). - Fitohormonas: auxinas, citoquininas, giberelinas (+), ácido abscísico (-) y etileno (maduración). - Intensidad lumínica y fotoperiodo: p ej algas unicelulares fotosintéticas - Temperatura **Tipos de cultivos vegetales (micropropagación)** - Explantes (del pie adulto): inicio del cultivo - Callos: formas desdiferenciadas de parénquima en presencia de fitohormonas: raíces o tallos. Sin capacidad fotosintética. - Céls en suspensión y protoplastos: mantenimiento indefinido en cultivo **Protoplastos** - Células veg. sin pared por técnicas enzimáticas: inestables - Formación de callos en medio adecuado - Usos: transfección con DNA exógeno, fusión para híbridos somáticos **DIFERENCIAS ENTRE EL CRECIMIENTO CELULAR IN VIVO E IN VITRO** **Ventajas cultivo celular in vitro** - Control preciso y fino del medio ambiente - pH, Tª, P.osm, \[02\], \[C02\] - Hormonas, nutrientes, densidad celular - Medios de cultivos definidos: conc exacta - Caracterización y homogeneidad - Las células en cultivo tienden a la homogeneidad tras varios pases: presión selectiva - Obtener réplicas idénticas de cada subcultivo - Conservación de características tras varias generaciones - Posibles mutaciones o contaminaciones tras sucesivos pases: chequear identidad celular - Escala y mecanización - Menor coste de ensayos preclínicos - Baja conc. compuestos activos (nanoescala): se evita pérdida de compuesto por proceso ADME - Cuestiones éticas - Alternativa a experimentos *in vivo* - Menor tasa de sacrificio de animales de experimentación **Limitaciones del cultivo celular in vitro** - Precisión - Asepsia estricta: crec. más lento que los contaminantes (virus, bacterias, hongos) - Contaminación cruzada: mantener homogeneidad de los cultivos - Mezclas complejas de nutrientes: imprescindible para su supervivencia - Necesidad instrumental y personal cualificado - Cantidad y coste - Obtención de gran cantidad de células es más caro que de animales - Desdiferenciación e identificación - Desdiferenciación: conforme proliferan en cultivo - Marcadores específicos de las células originales - Rediferenciación: por hormonas, compuestos químicos - Inestabilidad cromosómica - Validez del modelo in vitro - Nº limitado de pases: evita aneuploidía por pases sucesivos (nº distinto de cromosomas que el original) - **Biología del cultivo** - Presión selectiva: células que sean capaces de superar el proceso de disgregación, de adherirse al sustrato y de proliferar (bien en forma de monocapa, bien en suspensión). - Replaqueos/pases/subcultivo: Al llegar a confluencia (limitación de superficie o nutrientes): Dilución de densidad celular. I. II. III. IV. V. VI. - **EQUIPAMIENTO DEL LABORATORIO DE CULTIVOS** **Distribución y características de un laboratorio de cultivos celulares** - Aislados de otras estancias mediante doble puerta - Zona intermedia para dejar las batas exclusivas - Atmósfera a una presión ligeramente superior a la del exterior (presión positiva) para evitar la entrada de aire (que porta contaminantes) - Suelo fácil de limpiar, no poroso, sin esquinas - Mantener una temperatura estable: instalación de aire acondicionado **Sistemas de esterilización** - Autoclave - Equipos de filtración - - - **Espacio estéril de trabajo** - - - - - - - Cabinas se seguridad biológica - - - - - - - - - - - - - **Incubación** - Incubador de CO2 (5%), 99% humedad: frasco abierto - Estufa seca sin gas: frasco cerrado, evitar desecación - Incubadores robotizados: Tª crec 37º, menos Tª para células de peces, insectos, estricta limpieza: crecimiento de bacterias y hongos **Microscopios** - Microscopio invertido de contraste de fases. El objetivo esta abajo. **Neveras y congeladores** - Neveras (4ºC): medios, PBS (phosphate buffered saline) - Congeladores de -20ºC: suero, aditivos (glutamina, antibióticos) y soluciones enzimáticas (tripsina, colagenasa) - Congeladores de -80ºC: almacenamiento a largo plazo de los aditivos del medio (suero, glutamina, antibióticos...) y de sustancias especialmente sensibles (factores de crecimiento, mitógenos, inductores, \...). - Suelen denominarse ultracongeladores. - Contenedores de isopropanol para congelación de células **Contenedores de N2 liquido** - Almacenamiento de líneas celulares a largo plazo. **Centrífugas** - Siempre bien equilibradas - Velocidad y tiempo mínimos adecuados: las células se dañan al compactarse en el fondo de los tubos - 150-200 x g (RCF) durante 5-10 min suele ser suficiente (1500-1800 rpm) - Una vez terminada la centrifugación, el sobrenadante debe decantarse y las células resuspendidas en medio nuevo inmediatamente. - Las centrífugas deben limpiarse regularmente: - El fondo de los adaptadores de tubos acumulan residuos que pueden desequilibrar el rotor - Pueden favorecer la contaminación de la cabina de flujo al meter los tubos **Otros instrumentos** - Hemocitómetro: cámara de Neubauer - Contador electrónico de células - Citómetro de flujo - Equipo de purificación de agua - Balanzas - pH-metro - Micropipetas y pipeteadores - Sistemas de aspiración de líquidos - Baño de agua o metal