Diapos 232-304 PDF - BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale) Automne 2024

Les applications de la technologie de l’ADN recombinant 232 La mutagénèse in vitro La mutagenèse dirigée permet de créer des mutations au niveau de n’importe quel site spécifique...

Les applications de la technologie de l’ADN recombinant 232 La mutagénèse in vitro La mutagenèse dirigée permet de créer des mutations au niveau de n’importe quel site spécifique dans un gène dont on connaît la séquence de type sauvage. Il s’agit d’un principe d’utilisation d’oligonucléotides qui s’hybrident avec des fragments simple brin => phage M13 simple-brin => vecteurs double-brin dénaturés Il existe différents types de mutations que l’on peut provoquer: 233 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 1  La mutagénèse in vitro 234 La cartographie à l’aide des RFLP RFLP: restriction fragment length polymorphism (polymorphisme de longueur des fragments de restriction). L’ADN génomique d’un individu est digéré avec une enzyme de restriction et hybridé avec une sonde. Puisque l’ADN des chromosomes d’une espèce est généralement similaire, on pourrait s’attendre à ce que la sonde s’hybride avec un fragment génomique de taille constante chez tous les individus. Pourtant, lorsqu’on utilise des sondes de cette façon, les fragments hybridés sont souvent de taille différente chez des individus distincts. Ceci s’explique par le fait qu’un site de restriction donné ne s’observe pas toujours chez tous les individus. 235 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 2  La cartographie à l’aide des RFLP On identifie les RFLP de façon empirique en hybridant systématiquement un grand nombre de fragments génomiques clonés, obtenus après digestion par des enzymes de restriction, de l’ADN de plusieurs individus distincts d’une même famille ou d’une population. 236 La cartographie à l’aide des RFLP Quel est l’importance des RFLP? 1) Si un individu est hétérozygote pour 2 morphes d’un RFLP, on peut utiliser ce « locus » hétérozygote comme marqueur pour la cartographie des chromosomes. Les RFLF n’ont pas d’importance biologique dans la plupart des cas, mais ils peuvent être utilisés pour déterminer la position de gènes intéressants et servir de point de départ pour cloner ces gènes par la technique du clonage positionnel. 2) Outils diagnostic: par exemple, dans une famille dont certains membres ont été affectés par une maladie donnée, si l’on peut établir que les personnes atteintes de la maladie portent également un allèle particulier d’un RFLP, alors ce fait suggère non seulement que le locus du RFLP est lié au locus du gène responsable de la maladie, mais également que l’allèle particulier de ce RFLP est en configuration cis par rapport à l’allèle de la maladie. 237 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 3  La cartographie à l’aide des RFLP Quel est l’importance des RFLP? 3) Les RFLP peuvent être utilisés pour mesurer la divergence génétique entre les populations différentes ou des espèces apparentées. Une différence portant sur des sites de restriction est effectivement une différence dans l’ADN. Une mesure du nombre total de différences de RFLP représente donc une mesure de la différence génétique. L’allèle RFLP devient alors un marqueur servant de diagnostic de la maladie, et cette information peut servir à un conseiller génétique. www.hapmap.org 238 La cartographie à l’aide des RFLP La cartographie par des RFLP est souvent réalisée sur un groupe défini de souches ou d’individus qui servent de « référence » pour la cartographie de l’espèce concernée. Une approche analogue a été utilisée pour la cartographie du génome humain en recueillant l’ADN d’un groupe défini d’individus issus de 61 familles, comportant en moyenne 8 enfants par famille. 239 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 4  Allèle conférant la Allèle sauvage: d maladie: D 240 Exemple de polymorphisme chez l’humain: Le complexe majeur d’histocompatibilité Le CMH est constitué de 15 différents gènes qui sont extrêmement polymorphique: 500 allèles différentes ont été identifiées. La probabilité est donc très faible dans une population que deux individus aient la même combinaison d’allèle. Présents à la surface des APC (antigen-presenting cell) (toutes les cellules du corps peuvent être des APC; macrophages, cellules dendritiques et cellules B= APC professionnels) Les cellules T interagissent avec les APC via leurs récepteurs TCR et les CD. En d’autres termes, le polymorphisme est la forme différente que peut prendre un même gène. 241 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 5  Le complexe majeur d’histocompatibilité Hétérozygote Homozygote 242 La génétique inverse La génétique inverse permet de découvrir le rôle normal de séquences inconnues d’ADN ou de protéines, en mutant leur séquence in vitro et en cherchant les changements induits au niveau phénotypique. Génétique classique Génétique inverse Phénotype mutant Séquence de la protéine Allèle mutant Séquence de l’ADN Séquence de l’ADN Allèle mutant Séquence de la protéine Phénotype mutant 243 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 6  La génétique inverse Génétique inverse (protéine) Génétique inverse (gène) Séquençage d’une protéine Clonage d’un gène (séquence-ORF) Déduction de la séquence ADN Mutagenèse in vitro Fabrication d’une sonde Réinsertion dans organisme de départ Criblage d’une banque d’ADNc Conséquence sur le phénotype Mutagenèse in vitro 244 La génétique inverse Le knock out d’un gène (inactivation complète) par l’intégration homologue d’une séquence contenant un marqueur sélectionnable: 245 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 7  246 Exprimer des gènes eucaryotes dans des bactéries Organismes transgéniques:organismes contenant de l’ADN étranger (transgène) Bactéries contenant des gènes eucaryotes = bactéries transgéniques Biotechnologie: technologie de l’ADN recombinant aux fins commerciales 247 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 8  Exprimer des gènes eucaryotes dans des bactéries Exemple facteur de coagulation VIII (hémophiles): Un vecteur d’expression en 2 étapes, basé sur l’ARN polymérase et le promoteur tardif du phage T7. IPTG 248 Exprimer des gènes eucaryotes dans des bactéries Exemple insuline humaine: Un vecteur d’expression contient l’information génétique codant pour chacune des chaînes polypeptidique de l’insuline (protéine de fusion avec la b-gal pour la purification). 249 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 9  Exprimer des gènes eucaryotes dans des bactéries Exemple hGH Attention à l’orientation de l’insert! 250 Créer de nouvelles bactéries par le génie génétique Des bactéries conçues par génie génétique produisant des antibiotiques 251 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 10  Exprimer des gènes eucaryotes dans des bactéries 252 La technologie de l’ADN recombinant chez les eucaryotes Comment l’ADN est introduit dans une cellule eucaryote? 1) Transformation 2) Transfection 3) Injection 4) Infection virale 5) Bombardement au tungstène Généralement, l’ADN exogène doit s’insérer dans le génome de la cellule eucaryote pour pouvoir se répliquer. 253 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 11  La technologie de l’ADN recombinant chez les eucaryotes Le génie génétique de la levure (Saccharomyces cerevisiae) Possède un plasmide circulaire naturel de 6,3 Kb (2µm) qui est transmis à la descendance lors de la réplication. Avantage sur les plasmides bactériens: les chromosomes artificiels de levure peuvent atteindre jusqu’à 1000 Kb. Exemples: - Gène du facteur VIII de coagulation humain => 190 Kb - Gène de la dystrophie musculaire de Duchenne => plus de 1000 Kb 254 La technologie de l’ADN recombinant chez les eucaryotes A) Plasmide intégratif: ne peut se répliquer (intégration au chromosome pour transformation stable) B) Plasmide épisomal: peut se répliquer C) Centromère: permet aux cellules filles de toutes avoir le plasmide D) Yeast Artificial Chromosome (présence de télomères) 255 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 12  La technologie de l’ADN recombinant chez les eucaryotes La technologie Tet-On 256 Définir la région régulatrice essentielle d’un gène La régulation du gène de levure X+ peut être étudiée en manipulant sa région régulatrice par une analyse de délétion in vitro, puis en transformant une souche de levure portant un allèle déficient X- par ces constructions (il est possible d’ajouter une protéine de fusion –b- Gal en aval du gène X+). ARS= autonomously replicating sequence 257 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 13  Le génie génétique chez les animaux Les organismes les plus utilisés: Caenorhabditis elegans, la drosophile et la souris. 258 Le génie génétique chez les animaux Les organismes les plus utilisés: Caenorhabditis elegans, la drosophile et la souris. Gène rapporteur Drosophile transgénique exprimant le gène bactérien de la b-gal sous un promoteur de choc thermique de drosophile. 259 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 14  Le génie génétique chez les animaux Gène rapporteur Souris transgéniques contenant le gène de méduse qui code la protéine vert fluorescent (GFP), insérée dans leur génome. 260 Le génie génétique chez les animaux La production d’une protéine recombinante dans le lait d’une brebis transgénique. Autres exemples comme la vache et le porc. 261 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 15  Le clonage 1997- Dolly et sa « mère » 262 263 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 16  Le génie génétique chez les animaux (KO) 264 Le génie génétique chez les animaux (KO) 265 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 17  Le système CRE/LOX CRE: Cyclization REcombination, code pour une ADN recombinase site-spécifique. loxP: locus of X-over P1 (vient du bactériophage P1); 34 paires de bases. 266 Le système CRE/LOX Knockin: expression d’une protéine mutante avec fonction différente de la protéine de type sauvage. 267 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 18  Le système CRE/LOX 268 Le système CRE/LOX 269 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 19  La thérapie génique Exemple de la mutation récessive petite (lit) qui rends les souris affectées naines. 270 La thérapie génique Deux souris sœurs. Gauche la souris transgénique (rétablissement du phénotype normal lit+). 271 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 20  La thérapie génique Introduction d’un complexe transgénique hormonal (hormone de croissance) sous le contrôle d’un promoteur fort (métallothionéine) chez des saumons du Pacifique. Tous les saumons ont le même âge. 272 La thérapie génique chez l’homme L’application de la technologie de la transgenèse sans doute la plus séduisante et controversée se trouve dans la thérapie génique humaine. La thérapie génique germinale: insertion d’une cellule transgénique dans le bouton embryonnaire du blastocyste. Chez l’homme, ce type de thérapie est très contesté puisqu’il peut provoquer l’insertion de copies du gène d’intérêt à des endroits dans le génome pouvant perturber d’autres gènes. 273 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 21  La thérapie génique chez l’homme 274 La thérapie génique chez l’homme La thérapie génique somatique: correction d’un phénotype par le traitement de quelques cellules somatiques chez la personne atteinte. Cette technique s’applique aux maladies dont le phénotype est causé par des gènes exprimés de façon prédominante dans un tissu. Dans ce cas, il n’est pas nécessaire que toute les cellules de ce tissu deviennent transgéniques. Une fraction de ces cellules rendues transgéniques pourra atténuer les symptômes de la maladie. La technique consiste à prélever des cellules d’un malade présentant le génotype déficient et à rendre ces cellules transgéniques grâce à l’introduction de copies du gène cloné de type sauvage. Les cellules transgéniques sont ensuite réintroduites dans le corps du malade et la fonction normale du gène s’y exerce. 275 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 22  La thérapie génique chez l’homme Deux moyens sont utilisés afin d’introduire le transgène dans les cellules: Rétrovirus inactivé (défectif); Lentivirus => problème: 1) doit s’insérer dans le génome de la cellule hôte donc effets mutagènes 2) s’attaque aux cellules en prolifération seulement Adénovirus => avantage: 1) ne s’intègre pas dans le chromosome de l’hôte 2) attaque tous les types de cellules même celles qui ne prolifèrent pas 276 La thérapie génique: transporteur non-viral Les liposomes 277 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 23  Réussite de la thérapie génique pour la 1ère fois (1990) pour syndrome de l'immunodéficience congénital (SCID) due à l'altération du gène de l'adénosine désaminase (désamination de l’adénosine et 2'-déoxyadénosine) => fonctionnement anormal de lymphocytes B et T => infections répétées Construction du vecteur de transfert ADA-SAX (simian virus 40, ADA, Xhol site). Le promoteur est obtenu de SV40. 278 ** Utilisation de cellules de la moelle osseuse plus efficace! 279 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 24  Ashanti de Silva, 1ère traitée pour un SCID 280 281 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 25  La thérapie génique * Liposomes et nanoérythrosomes 282 La thérapie génique REF: Biomedicine & Pharmacotherapy Vol.153, Sept. 2022, 113324; https://doi.org/10.1016/j.biopha.2022.113324 (voir PDF) 283 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 26  La thérapie génique REF: Biomedicine & Pharmacotherapy Vol.153, Sept. 2022, 113324; https://doi.org/10.1016/j.biopha.2022.113324 (voir PDF) 284 La thérapie génique Exemple d’essai clinique pour un type d’hypercholestérolémie familiale pour corriger le gène d’un récepteur de lipoprotéine de faible-densité (LDL: le « mauvais cholestérol »). 285 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 27  La thérapie génique chez l’homme Autres moyens pour introduire le transgène dans les cellules: le chromosome artificiel humain (HAC). Le HAC est transfecté à l’aide d’agents de transfection (lipofectine, transfectene, effectene) et on peut observer le HAC à l’aide de sondes par fluorescence. 286 La thérapie génique anti-sens 287 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 28  La thérapie génique anti-sens: siRNA L’interférence ARN ou RNA interference (RNAi) est un processus post-transcriptionnel déclenché par l’introduction d’ARN double-brin (dsRNA) qui rends, de manière séquence spécifique, un gène « silencieux ». La première évidence qu’un dsRNA pouvaitr efficacement rendre un gène silencieux par RNAi a été publié par une étude au niveau du nématode Caenorhabditis elegans (Fire A. et al., 1998. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 391(6669): 806-11) Premièrement, de longs dsRNAs sont clivés par une enzyme nommée Dicer en des fragments de 21-23 nucléotides, appelés siRNAs (small interfering RNAs). Ensuite, les siRNAs sont recrutés à un complexe ribonucléase (nommé RISC pour RNA Induced Silencing Complex) qui ensuite induit le clivage de L’ARNm ciblé. 288 La thérapie génique anti-sens: siRNA 289 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 29  La thérapie génique anti-sens: siRNA 290 291 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 30  L’édition du génome à l’aide du système immunitaire bactérien ! TALENs: Transcription Activator-Like Effector Nucleases, dérivées de protéines de parasites qui peuvent reprogrammer l’expression génique chez les plantes hôtes CRISPR: Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs) and CRISPR-associated (Cas) systems (la nucléase Cas-9). Ces séquences découvertes en 1987 par un groupe Japonais mais sans fonctions biologiques connues. Les “spacers” sont des signatures d’infections virales précédentes et la fabrication de gRNA confère une résistance à la réinfection par un même virus (l’effet “mémoire”). 292 enome editing, the Royal Swedish Academy of Sciences announced on L’édition du génome à l’aide du système Wednesday. immunitaire bactérien ! Prix Nobel de chimie en 2020: la découverte des CRISPRs 293 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 31  L’édition du génome à l’aide du système immunitaire bactérien ! 294 295 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 32  CRISPR-Cas9 genome engineering Note: Voici 4 exemples de l’utilisation du CRISPR- Cas9 pour manipuler le gène Ins1 (insuline). Le système CRISPR-Cas9 modifie efficacement et spécifiquement la séquence des gènes ciblés dans un organisme, et les versions modifiées du système modifient l'expression des gènes sans changer les séquences des gènes. 296 From: Damian and Porteus, Mol. Ther. (2013; 21: 720-722) Evolution des outils conçus pour l'édition du génome. (a) le virus adéno-associé (AAV) à base d'intégration a été la première stratégie pour la modification ciblée d'un site génomique dans des cellules somatiques de mammifères d'une manière très efficace (jusqu'à 1%). Il a fourni une alternative à l'insertion imprévisible de l'intégration des systèmes viraux (par exemple, les rétrovirus, les lentivirus, virus mousseux). (b) nucléases à doigts de zinc (ZFN), des endonucléases homing, et nucléases effectrices TAL (Talens) sont des stratégies à base de protéines non virales pour induire des modifications génomiques précises par chaque extrémité non homologue mutagène rejoindre ou recombinaison homologue. Ces méthodes fournissent des fréquences plus élevées génome d'édition que l'AAV et sont entrés dans les essais cliniques. La facilité de l'ingénierie hautement actif TALENs a augmenté la popularité de la stratégie à base de protéines pour l'édition du génome. Représenté est une vue schématique d'une paire de TALENs lier à une séquence cible dans laquelle le domaine de liaison à l'ADN effecteur TAL est représenté par les cases rouges et le domaine de nuclease Fokl est marqué. (c) outils d'ARN-protéine, le système CRISPR, sont la dernière stratégie de l'ingénierie des génomes. La facilité de montage, le rendement élevé de l'édition du génome, et la capacité à être utilisé pour l'ingénierie multiplex ouvrent de nouvelles avenues intéressantes dans le domaine. crRNA, CRISPR d'ARN; pA, séquence signal de polyadénylation; PAM, motif de protospacer adjacents; rAAV, le virus recombinant adéno-associé; tracrRNA, trans-activation crRNA. 297 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 33  Ref: www.systembio.com 298 La thérapie génique anti-sens: siRNA Foie de souris avec hépatite et fibroses (saline) Exemple de thérapie génique anti-sens avec Fas 299 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 34  La thérapie génique anti-sens: siRNA Foie de souris avec hépatite et fibroses (saline) Exemple de thérapie génique anti-sens avec Fas 300 Utiliser l’ADN recombinant pour détecter directement les allèles responsables de maladies Les phénotypes mutants récessifs qui résultent de la transmission d’un seul gène sont responsable de plus de 500 maladies génétiques humaines. Une personne homozygote issue de l’union de deux hétérozygotes pour le même allèle récessif sera atteinte de la maladie. Figure: amniocentèse (14 à 16 semaines) Analyse des villosités chorioniques (CVS ou chorionic villus sampling) pour la détection plus Précoce (8 à 10 semaines). 301 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 35  Utiliser l’ADN recombinant pour détecter directement les allèles responsables de maladies La modification des sites de restriction par mutations Exemple: anémie à cellules falciformes => maladie génétique due à une modification mutationelle de l’hémoglobine (une valine remplace un acide glutamique en position 6 de la chaîne de b-globine) => Le changement de GAG en GTG supprime un site de coupure par MstII coupant la séquence CCTNAGG => il est donc possible de détecter cette mutation par analyse de type Southern en utilisant une sonde d’ADNc marquée de b-globine 302 303 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 36  Utiliser l’ADN recombinant pour détecter directement les allèles responsables de maladies Les études par PCR Un outil très efficace pour déterminer des mutations possibles dans des gènes et effectuer un diagnostic rapide d’une maladie. On utilise des amorces qui encadrent le site à l’étude, puis on peut isoler l’ADN amplifié, le cloner et le séquencer pour le comparer à une séquence de type sauvage. 304 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 37