Técnicas De Desnaturalización Y Recombinación Del ADN PDF

TÉCNICAS DESCRIPCIÓN DESNATURALIZACIÓN ADN nativo bicatenario → A medida que se aumenta la energía calórica, se desnaturaliza ya que DEL ADN se desestabilizan las uniones PdH que mantienen las hebras unidas → A medida que se separan...

TÉCNICAS DESCRIPCIÓN DESNATURALIZACIÓN ADN nativo bicatenario → A medida que se aumenta la energía calórica, se desnaturaliza ya que DEL ADN se desestabilizan las uniones PdH que mantienen las hebras unidas → A medida que se separan ambas cadenas, se exponen las bases que absorben a 260nm (a temperaturas muy altas, la ABS aumenta rápidamente y a 90°C hay máxima absorción) → Si se baja la temperatura → las dos cadenas de ADN monocatenario vuelven a interaccionar por complementariedad de bases → se forma el ADN renaturalizado. Si al ADN nativo bicatenario se lo desnaturaliza y se lo pone en contacto con moléculas formadas por desoxirribonucleótidos con secuencias complementarias, cuando baje la T, el ADN desnaturalizado puede interaccionar por complementariedad con esas moléculas → Este mecanismo se llama HIBRIDACIÓN. ADN RECOMBINANTE Es cualquier molécula de ADN que fue obtenida in vitro por la combinación de fragmentos de ADN que tiene distinto origen (un ADN que proviene de un organismo y un ADN que proviene de @Chemiistrygram otro) → Lo que permite esta unión son los enlaces covalentes. Para obtener los fragmentos de ADN de distintos orígenes se utilizan enzimas de restricción: Las enzimas de restricción son endonucleasas de origen bacteriano que son capaces de cortar el ADN en el interior de la molécula. En las bacterias, restringen el ingreso de ADN viral al citosol. ¿Por que estas enzimas no degradan el ADN de la bacteria? Estas enzimas pueden modificar el ADN introduciendo un CH3 dentro de los propios sitios de corte en su ADN, por lo que la enzima reconoce la presencia del CH3 del ADN y no lo corta. Reconocen secuencias de 4 a 8 pares de bases llamadas secuencias PALINDRÓMICAS (cuando se lee la secuencia de 5’ a 3’, se lee igual para ambas hebras, ej 5’GAATTC y en su cadena complementaria CTTAAG5’) → la secuencia palindrómica donde corta la enzima de restricción se llama SITIO DE RESTRICCIÓN. Cada enzima de restricción corta un sitio de restricción específico, en base de la forma del sitio activo que tenga la enzima. Ejemplo: a. La HAE III corta de manera lineal entre las uniones CG b. EcoRI y Hind III, las cuales cortan de manera escalonada GA y AA respectivamente. Por lo tanto se obtienen fragmentos escalonados o de extremos cohesivos (ya que si se los ponen juntos interaccionarían por complementariedad de bases) ---------------------------------------------------- Ejemplo de obtención de ADN recombinante: Se necesita ADN de distintos orígenes → El ADN del primer organismo (ADN1) se obtiene mediante la enzima de restricción E1 y el segundo ADN (ADN2) mediante por ejemplo E1, E2 y E3 → Para que se unan los ADN, deben tener los mismos extremos cohesivos, por lo que es necesario cortarlos con la misma enzima de restricción → Por lo tanto el ADN1 cortado por la E1, interacciona con el ADN2 cortado por la E1 → Las bases complementarias interaccionan a través de los extremos cohesivos → pero NO se forma la unión covalente → para que se forme la unión  covalente entre la OH de una base y el fosfato de la otra → es necesaria la enzima ADN T4 LIGASA, que genera condensación, liberación de agua y consecuente unión covalente. ↓ Si tengo la unión en un tubo de ensayo, se tendrá ADN 1, los distintos fragmentos de ADN2 y el fragmento recombinado → únicamente se quiere obtener ADN recombinante (que contiene a los fragmentos unidos covalentemente) → Se realiza Electroforesis en Gel de Agarosa (no se necesita SDS porque las moléculas ya están cargadas negativamente ya que provienen de ácidos nucleicos) → Se van a separar de acuerdo a su tamaño (Los fragmentos de ADN1 y ADN2 van a quedar abajo y el fragmento recombinado más arriba). → se colorea con bromuro de etidio → se observa con fluorescencia. ¿Cómo podría diferenciar las bandas que corresponden a ADN1 y ADN2? A través de hibridación HIBRIDACIÓN o a través de secuenciación. @Chemiistrygram La hibridación significa que se tiene un fragmento pequeño de desoxirribonucleótidos (denominado SONDA o PROBE) → este fragmento debe tener una secuencia complementaria al ADN que se desea encontrar, es decir, debe tener nucleótidos que se sepa que están presentes en la secuencia a evidenciar (se dice que la SONDA es altamente específica porque interacciona cuando todos sus nucleótidos reconozcan a sus nucleótidos complementarios en el ADN o ARN desnaturalizado) Siguiendo con el ejemplo anterior: Al gel se lo pone en contacto con una membrana → Los fragmentos de ADN pasan del gel a la membrana → sobre la membrana se realiza una reacción de determinación específica para evaluar la presencia del ADN en estudio → Se pone en contacto la membrana con una solución que contenga la sonda → la sonda interacciona con el ADN que se busca y se podrá identificar la banda (si en la membrana no está presente el ADN que se busca, la sonda no se une y no se obtiene ninguna banda) → para visualizar la banda, se le introduce a la sonda un fosfato radioactivo o fluorescente y se puede ver mediante microscopio de fluorescencia o electroforesis. Cuando la mezcla de ADN es revelada por las sondas correspondientes, el resultado del ensayo se denomina SOUTHERN BLOT Cuando la mezcla de ARN es revelada por las sondas correspondientes, el resultado del ensayo se denomina NORTHERN BLOT SECUENCIACIÓN Es otra manera de identificación, se utiliza para corroborar una secuencia larga de pares de bases (no se utiliza la sonda porque posee como mucho 50 pares de bases, si se desea corroborar por ejemplo 500 pares de bases se utiliza secuenciación → para saber exactamente cual es la secuencia de nucleótidos que hay en la cadena, existen varios métodos para obtener dicha secuencia de ADN: 1. Método SANGER se basa en la incorporación de didesoxinucleótidos (durante la replicación in vitro) que no tienen OH en la posición 3’ y por lo tanto, sin el OH en esa posición, la cadena no puede seguir sintetizando → la síntesis se corta en donde entra el didesoxinucleótido → si se puede visualizar dicho didesoxinucleótido, se puede saber en @Chemiistrygram esa posición de la cadena molde que nucleótido (A, C, G o T) entró y se podrá comenzar con la secuencia. Ejemplo: Se tiene 4 tubos ependdorf con la misma mezcla → ADN desnaturalizado, un cebador, ADN polimerasa y los 4 nucleótidos trifosfato en exceso (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) → En cada tubo se pone un didesoxinucleótido diferente (en uno se pone ddATP, en otro ddGTP, en otro  ddTTP y en el otro ddCTP) → cuando se comienza a sintetizar las cadenas complementarias, a la síntesis de cada uno de los nucleótidos defectuosos (didesoxinucleótido), se detendrá la síntesis → cada eppendorf se pone en el pocillo de la electroforesis en gel de agarosa → se separa mediante el tamaño → en base del tamaño de la cadena sintetizada, se podrá deducir la secuencia del fragmento de ADN @Chemiistrygram que se tenía. Resultados: En el tubo rojo → se tiene ddATP, si el ATP entra en la primera base que tiene que sintetizar, se corta la síntesis, por lo que al ser la molécula más pequeña, corre primero en el gel de agarosa y se concluye que la A es la primera base de la secuencia. SE PODRÁ IR DEDUCIENDO EN BASE A QUIÉN CORRIÓ MÁS CERCA DEL FRENTE DE CORRIDA CUAL ES LA SECUENCIA DE LA MUESTRA. 2. Métodos avanzados de secuenciación: EL DIDESOXINUCLEÓTIDO TIENE UNIDO UN FLUOROCROMO → el cual será detectado por un detector y se podrá obtener una imagen donde una máquina indica la secuencia de la muestra que se introdujo. CLONACIÓN La clonación es obtener muchas copias idénticas de secuencias de ADN → se obtienen in vitro a través de técnicas como PCR y tecnología de ADN recombinante. La finalidad de la clonación es hacer un análisis de secuencia para hacer un diagnóstico o para estudiar la función de un gen; para obtener proteínas recombinantes o para tener organismos @Chemiistrygram genéticamente modificados. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa La PCR se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas: 1. DESNATURALIZACIÓN: En esta técnica se desnaturaliza al ADN a altas temperaturas 2. HIBRIDACIÓN: Luego, se pone cebadores o primers que necesita la ADN polimerasa para extender la cadena (para que los cebadores hibriden en el lugar correcto se debe bajar la temperatura) 3. ELONGACIÓN: Se agrega la ADN polimerasa y la mezcla de desoxirribonucleótidos → para que la ADN polimerasa, a partir del Primers adecuado, elongue la cadena y se obtenga la cadena hija. La ADN polimerasa elonga a 72°C y como la ADN polimerasa de mamíferos no resiste estas temperaturas, se usa la ADN polimerasa de una bacteria, denominada TAQ POLIMERASA. Estos tres pasos constituyen un 1er ciclo de reacción y se lleva a cabo en un Termociclador. Se tiene una región de DNA bicatenario que se desea amplificar → se desnaturaliza, separando las cadenas → se unen cebadores y la ADN polimerasa elongará cada molécula separada. Al final del primer ciclo, se dispone de 2 copias de la muestra original → Se repite el ciclo y al final del segundo ciclo se tendrá 4 copias de la muestra original y así sucesivamente.  Si se desea separar el gen clonado de toda la mezcla de reacción → Se realiza una electroforesis de gel de agarosa → Luego si se desea identificar nucleótido a nucleótido, se procede a una secuenciación o se lo debe hibridar con una sonda específica para la secuencia a través de un Southerns Blot. @Chemiistrygram Si de una muestra se obtiene ARN y no ADN, este no puede ser clonado, por lo que se debe transformar el ARN en su complementario ADN (ADNc) y luego amplificar el ADN por PCR → este proceso se conoce como RT PCR Ejemplo de RT PCR: primero se hace una retrotranscripción y luego el PCR: Se tiene muestra de ARNm → se utiliza un cebador formado solo por timinas (ya que el ARNm tiene una cola poliA) denominado cebador poli T (oligoDT) → se pone el ARNm purificado en presencia de oligoDT y de una enzima llamada TRANSCRIPTASA REVERSA, la cual va a copiar una cadena de ADN complementaria a partir del ARN → luego la molécula de RNA se degrada con la misma transcriptasa reversa, ya que posee actividad nucleasa → Luego la enzima copia la molécula complementaria a la del ADN para obtener una molécula de ADN doble cadena → AHORA PODRÍA REALIZARSE LA REACCIÓN DE PCR A PARTIR DEL cDNA. PCR CUANTITATIVA (Q) RT-qPCR → se refiere a haber hecho primero una retrotranscripción y luego una PCR que permite cuantificar. CRISPR-CAP Corresponde al sistema de defensa de bacterias. Habla de memoria genómica para el sistema de defensa de bacterias. Presenta espaciadores de las secuencias palindrómicas y cada espaciador corresponde a secuencias de ADN de diferentes virus. Las secuencias CRISPR corresponden a las secuencias espaciadoras que separan las secuencias @Chemiistrygram palindrómicas en el genoma de la bacteria. Las proteínas asociadas a las secuencias CRISPR son las CASP. ►Mecanismo: En una primera instancia, la bacteria es infectada por un virus → las enzimas de restricción que posee la bacteria degradan al genoma viral de ADN → el cual se inserta en el genoma bacteriano separando las secuencias palindrómicas repetidas. (en otras palabras, la bacteria degrada el genoma del virus y lo inserta en su genoma, generando un sistema de memoria) Cuando el genoma de la bacteria es transcripto → se transcriben las secuencias de las proteínas asociadas a la secuencia CRISPR, las secuencias palindrómicas y las secuencias espaciadoras. Cuando el virus vuelve a infectar a la bacteria → el ADN viral es desnaturalizado → la secuencia espaciadora se une al ADN viral desnaturalizado y una vez que la secuencia ARN espaciadora interacciona con el ADN del virus → se activa la proteína CASP → degrada el ARN → la bacteria se deshace de todo el genoma del virus.