Méthodes de Clonage et de Vecteurs PDF

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Université Frères Mentouri Constantine 01 L3 Bioinformatique Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Année universitaire 2024/2025 Département de Biologie Appliquée Présenté par Dr Méziani.D.Y Chapitre IV : Techniques de génie génétique Méthodes de clonage et vecteurs I. Technologies de l'ADN recombinant (Clonage moléculaire) : Le clonage moléculaire consiste à l’insertion d’une séquence d’ADN dénommé insert dans un vecteur approprié puis son introduction dans une cellule-hôte afin d’en obtenir plusieurs copies. Consiste à isoler un fragment d’ADN et à le multiplier à l’identique. Le fragment d’ADN est au préalable introduit dans une construction que l’on appelle vecteur. Le vecteur recombiné (vecteur + insert) est ensuite introduit dans une cellule hôte. Le clonage moléculaire est différent du clonage reproductif (créer un individu génétiquement identique) ou du clonage thérapeutique (créer des tissus à partir de cellules souches pour effectuer des greffes compatibles avec le receveur). Eléments nécessaires au clonage :  Le fragment d’ADN appelé également ADN d’intérêt, ADN étranger ou ADN cible  Un vecteur de clonage (ou véhicule), capable de réplication autonome.  Une enzyme de restriction  Une ligase  Une cellule (procaryote ou eucaryote) pouvant servir d'hôte biologique : Les organismes hôtes les plus utilisé sont Escherichia coli ou la levure Saccharomyces cerevisiae ayant une capacité de multiplication et une grande vitesse de prolifération Exemple : E. coli se divise toutes les 20 minutes. Au bout de seulement 10 heures, on obtient à partir d’une seule bactérie, un milliard de bactéries portant chacune une ou plusieurs copies du vecteur recombiné. 1 II. Vecteurs de clonage : Les fragments d’ADN exogène (ADN à transférer) sont dépourvus de moyens de se répliquer (origine de réplication) et d'extrémités protégées. Il est donc nécessaire de les inclure dans une structure qui assurera leur propagation et leur protection. Ces structures sont appelées des vecteurs. On appelle donc vecteur de clonage, la molécule d'ADN dans laquelle on insère le fragment d'ADN à étudier. L'ADN inséré est appelé insert ou ADN étranger ou ADN exogène. Ces séquences nucléotidiques sont capables de s'auto-répliquer car, elles possèdent dans leur génome les signaux nécessaires à leur réplication, mais sont incapables de se multiplier seuls. Il est donc nécessaire de les introduire dans les cellules-hôtes pour réaliser une multiplication de ceux-ci. On distingue le vecteur natif lorsqu'il ne contient que son ADN propre et le vecteur recombiné lorsqu'il a intégré un fragment d'ADN étranger. 1. Usage des vecteurs :  Ils permettent le transfert, l’expression et la réplication d’un ADN étranger dans les cellules hôtes en vue d’un clonage moléculaire (L'introduction des gènes dans les cellules bactériennes (transformation) ou animales (transfections) ou dans des organismes entiers (animaux transgéniques)).  Ils permettent de conserver une molécule d’ADN donnée. 2  Couramment utilisés en vue de production de protéines recombinantes, pour le séquençage d’un gène, pour la sélection d’un gène dans une banque d’ADN.  Couramment utilisés pour l'étude des mécanismes de l'expression d'une séquence d'ADN exogène. Selon leur rôle dans la cellule hôte, on distingue deux catégories du vecteur : a. Vecteur de clonage : renferme une origine de réplication et permet de cloner un segment d’ADN ou un gène qui y est intégré et à amplifier le nombre de copies. b. Vecteur d’expression : renferme un promoteur, il est destiné à transférer un gène et le faire exprimer dans une cellule hôte qui n'est pas sa cellule d'origine. 2. Propriétés des vecteurs de clonage :  Réplication autonome et indépendante de l’ADN de la cellule hôte.  Petite taille : pour permettre l’insertion de grand fragment d’ADN étranger.  Présence de gènes de sélection : sélection des cellules hôtes qui ont intégré un vecteur.  Présence de sites de restriction localisés dans les gènes de sélection : permet de sélectionner les cellules hôtes qui ont intégré un vecteur recombinant. 3. Types de vecteurs : Plusieurs types de vecteurs sont utilisés en manipulations génétiques à savoir : Les plasmides, les phages et les chromosomes artificiels. 3.1. Les vecteurs plasmidiques : Les plasmides sont de petites molécules d'ADN bicaténaires, circulaires, extra- chromosomiques, Leur taille est nettement inférieure à celle du chromosome bactérien. Ils sont susceptibles de se répliquer de façon autonome (réplicons), Leur réplication se fait indépendamment de l’ADN chromosomique. Ils sont présents dans le cytoplasme 3 de nombreuses espèces bactériennes. Leur ADN comprend au minimum les gènes intervenant dans la réplication et la ségrégation de leur matériel génétique dans les cellules filles à chaque cycle de division cellulaire de la cellule hôte. La plupart des plasmides naturels contiennent des gènes qui confèrent à l'hôte des propriétés supplémentaires comme la résistance aux antibiotiques. Une bactérie peut posséder en même temps plusieurs plasmides différents sauf si leur cohabitation est incompatible avec la survie de la bactérie. Une bactérie peut posséder un très grand nombre de copies plasmidiques. Ils sont transférables d’une bactérie à une autre au cours de la conjugaison bactérienne et peuvent supporter jusqu’à 9 Kb d’ADN exogène.  Les plasmides possèdent :  Une origine de réplication  Un gène de résistance à un antibiotique auquel la souche hôte est sensible, ce qui permet la sélection des cellules résistantes qui survivent sur un milieu contenant l’antibiotique en question.  Un second gène marqueur phénotypique (soit un deuxième gène de résistance à un second antibiotique ou le gène lacZ) qui permet de reconnaître parmi les colonies transformées celles qui hébergent un plasmide recombinant.  Un ou plusieurs sites de restriction (polylinker) qui permettent la linéarisation du plasmide préalable à l'insertion de l'ADN exogène.  Les classes de plasmides : a. Plasmides de première génération : Ce sont les premiers à avoir été utilisés en génie génétique. Ce sont des plasmides à l’état naturel, non modifiés au laboratoire. Il s’agit des plasmides suivants : ColE1 ; RSF 2124 et pSC 101. Ces types de plasmides n'ont pas les propriétés requises pour les manipulations génétiques. 4 b. Plasmides de deuxième génération (pBR) : Ne sont pas des plasmides naturels mais résultent de plusieurs transformations : plasmides "artificiels". La série la plus importante de ces plasmides est la série pBR 312 à pBR 322. Le plus utilisé est le plasmide pBR 322 (construit à partir de pSC 101 et Pmb1) qui est constitué de 4,4 kb et possède deux gènes de résistance : un pour la tétracycline (TcR), l’autre pour l’amplicilline (ApR). Il possède, en plus, 20 sites uniques pour les endonucléases de restriction dont 11 localisés sur les deux gènes de résistance. L'insertion d'ADN étranger dans un quelconque de ces sites se traduit par la perte de la résistance à l'antibiotique. c. Plasmides de 3ème génération (pUC) : La famille pUC de 8 à 19 (plasmide of University of California) ont une taille qui voisine de 2,6 kb. Un plasmide pUC est un plasmide pBR dans lequel on a remplacé le gène de résistance à la tétracycline par un gène bactérien lacZ qui code la galactosidase. Un polylinker identique à celui du phage M13 est associé à lacZ. Les pUC (pUC8 à pUC19) ne différent que par le nombre de nucléotides et par l’emplacement du polylinker 5 3.2. Les phages : Les bactériophages ou phages sont des particules virales qui infectent les bactéries. Leur multiplication est rapide et le nombre de copies par cellule bactérienne est très important. Lorsque l’ADN du phage pénètre dans une bactérie, deux types de réponses peuvent se produire : lytique ou lysogénique.  Classes des phages : Deux phages sont fréquemment utilisés en génie génétique. Le phage lambda (de première génération) et le phage M13 (deuxième génération). a. phage lambda (λ) : Morphologiquement, il est formé d’une tête et d’une queue pour se fixée sur la bactérie hôte. A l’intérieur de la tête se trouve renfermé l’ADN. Celui-ci est linéaire et bicaténaire et mesure 48,502 Kb environ. Les extrémités de cet ADN sont simples brins sur une longueur réduite d’environ 12 nucléotides, et complémentaires l'une de l'autre et surtout formant des extrémités cohésives, leur association donne une structure circulaire à l’ADN dans la cellule hôte. L’ADN intégré se recombine avec le chromosome bactérien. Cette intégration peut ensuite entraîner soit une réponse lysogénique, soit une réponse lytique. Lorsque la réponse lysogénique se produit, les gènes viraux responsables de la réplication virale ne sont pas exprimés. L’ADN viral est alors qualifié de prophage et se réplique avec la bactérie. Sous l’effet d’un stress, la réponse lysogénique peut devenir lytique. Quand ce phage parcourt un cycle de reproduction lytique, il peut produire environ 200 phages/bactérie. b. Le phage M13 : Le génome du phage M13 est circulaire, mesure 6,4 Kb et contient 10 gènes. Il n’infecte que les bactéries F+. Son intégration à l’intérieur d’une bactérie F- se fait avec transformation. Le phage M13 a été modifié de manière à pouvoir introduire un ADN étranger dans la forme réplicative au niveau d'un site unique de restriction. Les modifications pour en faire un vecteur sont :  L’addition d’un polylinker pour faciliter l’insertion des séquences de DNA  L’addition d’un gène lacZ pour permettre la sélection des recombinants. 6 3.3. Les cosmides : Les cosmides sont des vecteurs artificiels hybrides phage lambda-plasmides. En fait, ils se comportent comme des plasmides avec des sites de restriction permettant l'insertion d'ADN étranger. Ils renferment également un gène de résistance aux antibiotiques (ampicilline). De plus, un site COS d'un virus lambda a été inclus dans leur ADN circulaire ce qui permettra au cosmide d'être empaqueté dans la tête d'un virus lambda. Les cosmides peuvent contenir des insertions d’ADN environ trois fois plus longs que ceux portés par les phages (45 kb). Ceci est dû à ce que la majeure partie de la structure du phage a été délectée tandis que les séquences signaux responsables de l'encapsidation subsistent (les sites COS) 3.4. Les chromosomes artificiels : a. Les YAC (Yeast Artificial Chromosome) : Les YAC ou chromosome artificiel de levure permettent de cloner de 150 à 1 000 kb de fragments d’ADN. Le génome de la levure Saccharomyces cerevisiae est constitué de 16 chromosomes de taille comprise entre 100 et 1000 kb. Chez la levure, trois régions chromosomiques sont importantes pour sa réplication. Les séquences télomériques (Tel), centrosomiques (CEN), et une séquence ARS (Autonomous Replicating Sequence). On a donc construit des chromosomes artificiels contenant ces régions essentielles et de l’ADN que l’on désire cloner. La taille de l’ADN cloné peut donc atteindre 1000 kb. Les YAC n'exigent que les cellules de levures comme hôtes. On peut cependant introduire dans l’ADN cloné des séquences bactériennes pour la sélection. 7 b. Les PAC (P1 artificial chromosomes) : Chromosomes artificiels dérivés du phage P1, mise au point dans les années 1990 un vecteur dérivé du bactériophage P1. Sa réplication lytique dans la cellule hôte produit 100 à 200 particules phagiques. c. Les pYAC (P1-derived yeast artificial chromosomes) : Le vecteur pYAC permet de cloner des fragments qui ont une taille de 130 à 150 kb avec une efficacité qui est intermédiaire entre celle des cosmides et celle des YACs. Ce sont des vecteurs compatibles avec E. coli et ils ont un faible nombre de copies. Pour ces vecteurs, le maintien est stable pour l'ADN étranger. d. Les BAC (Bacterial Artificial Chromosome) : Peuvent cloner des fragments d'ADN de taille variant de 100 à 300 kb. Les BAC sont des ADN circulaires, comme un chromosome bactérien, dont l’origine de réplication est issue de l’épisome sexuel F d’E. coli (plasmide impliqué dans la conjugaison bactérienne). Les composants géniques communs d'un chromosome artificiel bactérien sont :  Ori S : origine de réplication de l’épisome F.  Les gènes parB et parA de l’épisome servent à la répartition correcte du plasmide dans les cellules filles.  Le gène repE code l’enzyme de réplication de l’épisome.  Site de clonage dans le gène lacZ  CmR d’origine plasmidique code la résistance au chloramphénicol. 8