Biologie Moléculaire BIO1101 Session Automne 2024 PDF

Biologie moléculaire BIO1101 Session automne 2024 Rim Marrakchi [email protected]  But du cours Structure et fonction des acides nucléiques et des protéines. Régulation génique c...

Biologie moléculaire BIO1101 Session automne 2024 Rim Marrakchi [email protected]  But du cours Structure et fonction des acides nucléiques et des protéines. Régulation génique chez les procaryotes et les eucaryotes. Éléments de contrôle transcriptionnel et postranscriptionnel. Technologies et applications de l'ADN recombinant. Calendrier Date Cours Théorie 4 septembre 1 La structure de l’ADN 11 septembre 2 La structure du génome 18 septembre 3 La réplication de l’ADN 25 septembre 4 Les mutations et la réparation de l’ADN 2 octobre 5 Les mutations et la réparation de l’ADN 9 octobre 6 Suite de la dernière séance, présentation du travail de recherche 16 octobre Examen intra cours 1 à 6 23 octobre - Semaine d’activité libre 30 octobre 7 La transcription d’ARN 6 novembre 8 La transcription d’ARN 13 novembre 9 La maturation d’ARNm et autres types d’ARN 20 novembre 10 La traduction des protéines 27 novembre 12 La régulation de l’expression génique chez les procaryotes et les eucaryotes 4 décembre 13 La régulation de l’expression génique chez les procaryotes et les eucaryotes 11 décembre Examen final Partiellement récapitulatif  Objectifs généraux d’apprentissage À la fin du cours l’étudiant devrait être en mesure de :  Comprendre la structure, la fonction et l'organisation des acides nucléiques.  Comprendre la structure et la fonction des protéines.  Comprendre et distinguer les mécanismes moléculaires de la transcription et de la traduction.  Comparer les mécanismes de régulation génique chez les procaryotes et chez les eucaryotes.  Connaître les éléments de contrôle transcriptionnels et postranscriptionnels.  Connaître des notions des technologies et applications de la biologie moléculaire.  Aucun manuel obligatoire Matière officielle à l’examen  Notes présentées en classe (disponibles sur Studium)  Explications Livres recommandés, non obligatoires Alberts, Johnson, Lewis, Morgan, Raff, Roberts, Walter (2017) Biologie moléculaire de la cellule, sixième édition. Lavoisier médecine-sciences, Paris, 1341 pages. Watson, Baker, Bell, Gann, Levine, Losick (2009) Biologie moléculaire du gène, Pearson Education France, Paris, 688 pages  Évaluations ÉVALUATIONS SOMMATIVES  Examen Inta 45 % et final 45 % Travail de recherche(10%)  Examens individuels (!)  Remise du travail : une seule copie par équipe sur  40 à 50 questions à choix multiples studium jusqu’à 23h59, le 11 décembre 2024  Directement sur les notions vues en classe  2 à 4 étudiants par équipe  Mesurent votre compréhension de la matière  Durée 2h45. L'examen final est partiellement récapitulatif: Dates : Intra : 16 octobre 2024 Final : 11 décembre 2024 Les examens différés seront des examens à développement courts et longs. Chapitre 1: La structure de l’ADN 1.1. Les atomes, les liaisons chimiques et les molécules a) l’ADN et l’ARN b) Les protéines c) Les lipides 1.2. La structure de l’ADN a) Le nucléotide b) La polymérisation c) Les caractéristiques de l’ADN 1.3. La dénaturation et l’hybridation 1.1. Les atomes, les liaisons chimiques et les molécules o L’atome est la plus petite unité possédant les propriétés d’un élément. Chaque élément est constitué d’un type d’atome qui lui est propre. o Chaque atome est constitué d’environ 200 particules élémentaires, mais nous ne citerons que 3: le neutron, le proton(+) et l’électron(-). Les deux premiers forment le noyau de l’atome. o Les électrons gravitent autour du noyau pratiquement à la vitesse de la lumière: 300 000 km/s Du grec atomos : a (sans) + tomie ( couper, diviser) = indivisible 1.1. Les atomes, les liaisons chimiques et les molécules o Les rangées indiquent le nombre de couches d’électrons. En générale: la couche n peut contenir jusqu’à 2n2 électrons o La dernière couche (dernier niveau énergétique) est celle de la valence et permet les interactions entre les atomes(formation de liaisons chimiques). La couche de valence peut avoir un max de 2 ou de 8 é Les éléments les plus importants pour les molécules organiques 1.1. Les atomes, les liaisons chimiques et les molécules Les propriétés d’un atome et sa capacité à former des liaisons chimiques dépendent de sa dernière couche électronique: les électrons de valence. Règle de l’octet: pour être stable, l’atome cherchera à compléter sa dernière couche avec 8 électrons (*excepté H et He) et ce en faisant des liaisons chimiques avec d’autres atomes. À l’état électriquement neutre, le nombre de protons est égal au nombre d’électrons pour un atome donné.  Ce n’est pas l’équivalent d’être énergétiquement stable. Moins de mouvement = plus de stabilité o La formation d’une liaison chimique entre 2 atomes dégage de l’énergie (les 2 atomes bougent moins) o Pour briser une liaison, il faut fournir de l’énergie(les 2 atomes retournent à leur mouvement initial) Modèle de Bohr 1.1. Les atomes, les liaisons chimiques et les molécules Les liaisons chimiques: o Covalentes (≈ -80 kcal/mole) polaires et non polaires o Ioniques (-3kcal/mole) o Hydrogènes (-1 à -5 kcal/mole) o Interaction hydrophobe o Forces d’attraction Van der Waals (-0.1kcal/mole) forte a faible 1.1. Les atomes, les liaisons chimiques et les molécules La formation des chaînes carbonées s’effectue avec des liaisons covalentes non polaires. Les atomes de carbone peuvent s’associer entre eux par des liaisons simples, doubles ou triples et finissent par former des chaînes parfois longues et rectilignes, ramifiées ou cycliques. Ce sont les squelettes des macromolécules biologiques. chaînes carbonées qui vont créer les squelettes Ces chaînes carbonées peuvent-elles faire des liens avec d’autres molécules ? oui, liées avec d'autres molécules pour construire des tissus= formations de groupements fonctionnels 1.1. Les atomes, les liaisons chimiques et les molécules En plus de la disposition des C, les diverses propriétés d’une molécule organique dépendent des autres atomes qui s’y lient. Les groupements fonctionnels sont les groupements d’atomes qui participent le plus aux réactions chimiques des molécules organiques.  Ils contiennent des liaisons covalentes polaires et ils sont parfois ionisés! Quel est l’avantage de posséder des liaisons covalentes polaires, par rapport aux liaisons covalentes non polaires ? Pour l'équilibre énergétique= efficacité= stabilité entre les molécules= bon fonctionnement 1.1. Les atomes, les liaisons chimiques et les molécules Une macromolécule est une structure 3D dont la forme est déterminée par la séquence. Les différents monomères sont liés les uns aux autres par des liaisons covalentes et la structure 3D est stabilisée par des liaisons covalentes et non covalentes. La survie de la cellule dépend des nombreuses interactions entre les molécules qui la composent. En général, elles vont interagir ensemble par des liaisons non covalentes. ( formations des structures tertiaire et secondaire)  Plus les deux molécules s’assemblent bien (la complémentarité), plus elles forment des liens non covalents entre elles. .Ce sont des interactions de faible énergie, mais elles peuvent être nombreuses 1.1. Les atomes, les liaisons chimiques et les molécules En 1956, Crick décrit le dogme central (base de la biologie moléculaire) Réplication Acides nucléiques Protéines (enchainement de (enchainement des nucléotides) acides aminés) Université de Bern, Département de chimie, biochimie et pharmacie, https://molecool.ch/fr/arn-savoir/detail/rna-zentrales-molekuel-des-lebens 1.2. La structure de l’ADN Purines a) Le nucléotide = sucre + base azotée + gr. phosphate Un nucléotide peut avoir 1 à 3 P (mono, di ou triphosphate) Pyrimidines Nucléotide The three parts of a nucleotide by Anne Helmenstine, 2022, sciencesnotes, avec modification Uracile remplace la thymine dans l’ARN β-D-ribose β-D-désoxyribose différence entre ADN ET ARN réside dans le sucre 1.2. La structure de l’ADN a) Le nucléotide = sucre + base azotée + gr. phosphate C5 du sucre est utilisé pour le phosphoester C1 pour les liens 1.2. La structure de l’ADN a) Le nucléotide = sucre + base azotée + gr. phosphate Nomenclature :  La polymérisation d’ADN nécessite un apport en nucléotides (3-p) 1.2. La structure de l’ADN a) Le nucléotide = sucre + base azotée + gr. phosphate Fonctions des nucléotides o Source d’énergie chimique via la liaison entre les groupements phosphate facilement hydrolysable. Exemple : ATP Liaisons phosphoanhydrides o Association avec différents groupements chimiques pour former des coenzymes. Exemple : Coenzyme A (CoA) o Molécules de signalisation intracellulaire ou second messager. Exemple : AMP cyclique 1.2. La structure de l’ADN a) Le nucléotide = sucre + base azotée + gr. phosphate L’hydrolyse de l’ATP (hydrolyse = briser un lien en ajoutant l’eau) donne-7.3 kcal/mol à pH7.  La formation d’une liaison chimique entre 2 atomes dégage de l’énergie (les 2 atomes bougent moins)  Pour briser une liaison, il faut fournir de l’énergie(les 2 atomes retournent à leur mouvement initial). Les liaisons covalentes ne sont pas égales entre elles en termes d’énergie. Flèches bleues: investissement d’énergie Flèche rouge: gain d’énergie, dont un surplus de 7.3 kcal/mol par rapport à l’investissement 1.2. La structure de l’ADN b) La polymérisation L’ADN est un polymère de nucléotides. La polymérisation se fait grâce à la formation du lien phosphodiester qui relie les deux sucres de deux nucléotides différents via le groupement phosphate. Le processus de polymérisation requiert : o une enzyme, polymérase o un apport en nucléotides triphosphates.  Chaque nouveau nucléotide est ajouté sur le carbone 3’(sucre) du nucléotide précédant et une molécule du pyrophosphate est libérée.  La polymérisation se déroule du 5’ vers 3’ (flèche verte). La charge négative à pH neutre sur le gr. p. confère - une charge globale négative à l’ADN une fois la molécule polymérisée. pyrophosphate polymérisation perdu deux phosphates qui va être libéré = charge négative de l'adn 1.2. La structure de l’ADN b) La polymérisation Les liaisons phosphodiesters entre les nucléotides assurent la polymérisation de la charpente sucre-phosphate d’un brin d’ADN. Vocabulaire : o dNTP: désoxyribonucléotides triphosphate, sans information sur la base azotée. o Brin: chaîne de désoxyribonucléotides. o ADN monocaténaire (simple brin): une seule chaîne de désoxyribonucléotides. o ADN bicaténaire(double brin): association de 2 brins liaison avec les deux sucres complémentaires. o Nature antiparallèle = polarité inversée des 2 brins complémentaires. 1.2. La structure de l’ADN b) La polymérisation Les chaînes de nucléotides ont à leurs extrémités un groupe phosphate (C5’) et un groupe hydroxyle libre (C3’) à partir duquel l’élongation peut se poursuivre. Comme les sucres sont identiques, mais les bases diffèrent, la séquence est identifiée avec les bases, du 5’ vers3’. Adénine – thymine (A-T) : 2 liens H Cytosine- Guanine (C-G) : 3 liens H Les liaisons hydrogènes assurent la formation de la structure secondaire bicaténaire de l’ADN. Liaisons H sont faibles, mais leur grand nombre donne beaucoup de stabilité à l’ensemble. La complémentarité des bases azotées est essentielle à la réplication de l’ADN. 1.2. La structure de l’ADN b) La polymérisation Les règles de Chargaff sur la composition en nucléotides de l'ADN (avant le modèle de l’ADN de Watson et Crick) 1ère règle : Peu importe la source, la composition de l'ADN comporte une égalité entre les résidus adénine (A) et les résidus thymine (T), ainsi qu’entre les résidus guanine (G) et les résidus cytosine (C): %A = %T et %G = %C. 2ème règle : Le rapport de purines sur pyrimidines est toujours ~ 1. Règle (G+C)%: Le % de guanine et de cytosine sur le total des bases d’un génome dépend de l’espèce. Mais, dans un même génome, ce % demeure constant. D’après ChargaffE. et al. 1949. J. Biol. Chem. 177: 405. (Watson et al. 2009)_ 1.2. La structure de l’ADN c) Les caractéristiques de l’ADN 3’ 5’ La complémentarité et l’effet antiparallèle Pour former des ponts H entre les nucléotides (leurs bases) : o Il faut avoir un couple compatible: A ne peut lier que T (avec 2 liens H), et G ne peut lier que C (avec 3 liens H) o Même dans les couples compatibles, les liens H ne se forment que si l’orientation des deux nucléotides est antiparallèle (c’est à dire C5’ de l’un en face du C3’ de l’autre). La complémentarité est aussi au niveau de la forme: le couple A-T a la même géométrie que le couple G-C (la charpente sucre-P demeure stable) 5’ 3’ 1.2. La structure de l’ADN c) Les caractéristiques de l’ADN Chaines hélicoïdales o Les bases sont situées vers l’intérieur de la molécule d’ADN. o Tous les gènes ont la même forme générale 3D. o Le nombre et l’ordre précis de bases constituent l’information génétique  Pour lire la séquence d’un gène, il faut donc avoir accès aux bases. Ouverture de la double hélice d’ADN:  Durant la réplication de l’ADN(et la transcription), il est nécessaire d’ouvrir la molécule en brisant les liens H entre les bases. Sans l’ouverture de la double hélice l’ADN:  La présence de la charpente Sucre+P, ne permet aux protéines de reconnaitre la séquence qu’à travers des sillions: majeur et mineur. 1.2. La structure de l’ADN c) Les caractéristiques de l’ADN Chaines hélicoïdales Les sillons majeurs et mineurs sont formés à cause de l’angle entre 2 liens glycosidiques d’un couple de nucléotides.  Les sucres ressortent de la molécule à l’angle de 120˚ d’un côté et à 240˚ de l’autre. L’empilement des couples de nucléotides(un par-dessus l’autre) produit les sillons.  Le côté120˚ correspond au sillon mineur et le côté240˚ au sillon majeur.  La molécule d’ADN tourne en double hélice et cela provoque la périodicité de 2 sillons. permettent de formés des liens entre les nucléotides = formations d'hélice 1.2. La structure de l’ADN c) Les caractéristiques de l’ADN Chaines hélicoïdales En observant les groupes chimiques qui sont exposés dans chaque sillon, dans chaque paire de nucléotides:  Le sillon mineur permet de distinguer entre les paires AT (AHA) et CG (ADA).  Le sillon majeur permet de distinguer entre les paires AT (ADAM), TA (MADA), CG (HDAA) et GC (AADH). selon les groupements majeurs et mineurs certains vont accepter le lien H et d'autre vont le donner et d'autres qui ne vont pas former de liaisons Légende: A: gr. Accepteur du lien H (charge partielle-) D: gr Donneur du lien H (charge partielle+) H: gr non polaire M: gr méthyl (non polaire également) 1.2. La structure de l’ADN c) Les caractéristiques de l’ADN Chaines hélicoïdales “lire” l’information sans ouvrir la double hélice d’ADN:  Une protéine a plus d’espace pour approcher l’ADN et lier les bases azotées dans le sillon majeur. Elle y obtient plus d’information aussi. 1.3. La dénaturation et l’hybridation Dénaturation: perte de la structure quaternaire, tertiaire ou secondaire présente dans la forme «native» de la molécule. 1.3. La dénaturation et l’hybridation o les nucléotides sont assemblés par des liens covalents phosphodiesters forts o les chaînes antiparallèles sont maintenues ensemble par des liens H faibles Si on chauffe(ou applique un traitement alcalin) une molécule d’ADN double brin(bicaténaire): on brise les liens H et on obtient 2 chaînes à un brin(monocaténaire) ayant leurs liens phosphodiesters intacts  la dénaturation. Lorsque la température redescend, les brins se réassocient selon la complémentarité de leurs bases  l’hybridation (renaturation) reformation des liens H 1.3. La dénaturation et l’hybridation L’hybridation peut se faire entre les deux brins initiaux OU, avec d’autres molécules monocaténaires d’ADN ou d’ARN ajoutées dans la solution :  l’hybridation est possible entre un brin de départ et un brin ajouté. Cette propriété permet de détecter la présence d’une séquence spécifique dans un échantillon : o Production d’ une « sonde », c’est à dire une séquence d’ADN monocaténaire(ou d’ARN) complémentaire à la séquence recherchée. o Hybridation de cette séquence avec l’ADN de l’échantillon o Un résultat positif indique que la séquence d’intérêt est présente. 1.3. La dénaturation et l’hybridation On doit pouvoir visualiser l’interaction! (détecter la présence de l’hybride formé) 1.3. La dénaturation et l’hybridation SPÉCIFICITÉ: le degré de complémentarité entre deux molécules. Lorsque deux molécules se reconnaissent et se lient ensemble, la spécificité de l’union dépend de la complémentarité de formes et du nombre de liens chimiques formés (plus de liens permettent une spécificité plus grande) La spécificité de l’hybride est régie par la température d’hybridation: plus la température est élevée(donc proche de la température de la dénaturation) plus l’hybride est spécifique. 1.3. La dénaturation et l’hybridation Estimation de la diversité bactérienne in situ (FISH) Techniques d’hybridation in situ Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) sur chromosomes condensés. Sonde complémentaire au gène recherché. Puis, hybridation de cette sonde avec l’ADN de l’échantillon  un résultat positif indique que la séquence d’intérêt est présente. 1.3. La dénaturation et l’hybridation Techniques d’hybridation in situ Caryotype Le gène A se trouve normalement sur le chromosome 1. Il est donc possible d’utiliser sa séquence (qui est connue, peut être produite synthétiquement et marquée par fluorochromes) comme «sonde» pour identifier le chromosome 1 dans un caryotype. 1.3. La dénaturation et l’hybridation Techniques d’hybridation sur membrane ( immobilisée ): L’électrophorèse d’ADN: visualisation des fragments L’ADN est chargé (-) et migre vers le pôle (+) dans un champ électrique. Cette migration est effectuée sur un gel d’agarose (substance poreuse): les petites molécules migrent plus vite que les grosses et ainsi les différents fragments d’ADN se séparent selon leur taille. Le bromure d’éthidium est une molécule fluorescente sous les UV et qui s’intercale entre les pb. 1.3. La dénaturation et l’hybridation Techniques d’hybridation sur membrane ( immobilisée ): Southern (ADN) et Northern (ARN) La procédure pour faire un Southernou un Northern L’ADN(d’un individu ou d’une population) est isolé et coupé en petits fragments par les nucléases. Il est également dénaturé. Dans le cas de l’ARN cette étape est omise ( chaine courte et en 1 seul brin). Puis, le matériel est déposé sur un gel d’agarose. De plus, toujours ajouter échantillon connu qui sert d’échelle de grandeur (quelques fragments d’acides nucléiques dont la taille est connue). Les échantillons sont ensuite soumis à un courant électrique pour séparer les acides nucléiques. électrophorèse de la borne négative vers la borne positive. Les fragments plus courts se déplacent plus vite à travers la matrice du gel. Après 40 min , l’ADN ou l’ARN est séparé selon sa taille : les segments longs se trouvent plus haut et les segments courts sont plus bas. Il est possible d’estimer la taille en comparant la position d’un segment(une bande) à l’échelle. Après l’électrophorèse, le gel est couvert par une membrane de de nitrocellulose et placé dans un tampon. Toutes les bandes sont transférées sur la membrane par capillarité en suivant le mouvement d’eau et en gardant leur position respective. Maintenant on peut vérifier la présence de l’ADN ou l’ARN d’intérêt. Exemple Southern blot : les poissons (échantillon A),les chats(échantillon B) et les chiens (échantillon C) possèdent le gène d’actine dont la séquence est connue (5’-ATCG3’), donc synthèse de la séquence complémentaire avec un «colorant»(3’-TAGC-5’- colorant). Le colorant peut être une molécule radioactive ou fluorescente. La sonde est incubée avec la membrane. Si le gène d’actine est présent dans les échantillons A-B-C, la sonde va s’y coller par la complémentarité des bases azotées et produire un hybride ADN-sonde double brin. Pis détection de la présence de la sonde sur la membrane , si elle est là (par exemple une bande fluorescente dans le cas d’une sonde fluorescente) alors le gène d’actine est présent dans l’échantillon. Si les 3 échantillons comportent une bande fluorescente, ils ont tous les 3, le gène recherché. Maintenant, on peut vérifier s’ils l’utilisent : le même protocole mais avec l’ARN, un Northern. La sonde est une séquence complémentaire à l’ARNm d’actine. Si à la fin la présence de la sonde est détectée, alors l’ARNm d’actine est produit par les poissons, les chats et les chiens et donc ils utilisent leur gène d’actine (ils le transcrivent de l’ADN en ARNm pour éventuellement le traduire en protéine). 1.3. La dénaturation et l’hybridation Techniques d’hybridation sur membrane ( immobilisée ): Southern (ADN) et Northern (ARN) Southern Northern A= tissu nerveux B= tissu musculaire Gène = FI axonaux o L’ADN provenant de 2 tissus humains différents est soumis à une sonde complémentaire à un gène donné o L’ARN provenant de 2 tissus précédant est soumis à une sonde complémentaire à l’ARNm correspondant au gène recherché durant le Southern. 1.3. La dénaturation et l’hybridation Techniques d’hybridation sur membrane ( immobilisée ): Southern (ADN) et Northern (ARN) chat tissu nerveux poisson rouge, tissu musculaire chat tissu musculaire