Cours BCM2531 2002 - PDF

Cours BCM2531 Département de biochimie et médecine moléculaire Faculté de médecine John Pascal, PhD Le clonage : « technologie de l’ADN recombinant » L’expression de protéines recombinant 1 ...

Cours BCM2531 Département de biochimie et médecine moléculaire Faculté de médecine John Pascal, PhD Le clonage : « technologie de l’ADN recombinant » L’expression de protéines recombinant 1  John Pascal, PhD Département de biochimie et médecine moléculaire Faculté de médecine www.pascal-lab-udem.org 2  Cours BCM2531 o Enseignants Cours Théoriques BCM2531-2002 o Forum commun - StudiUM o Horaire/Salles o Evaluations cours théoriques 3  Cours BCM2531 o Enseignants Cours Théoriques BCM2531-2002 John Pascal Professeur de biochimie responsable du cours BCM2531 Patrick Lafrance responsable santé-sécurité-radioactivité UdeM 4  Cours BCM2531 o Forum commun - StudiUM 5  Cours BCM2531 o Horaire  Cours BCM2531 o Evaluations cours théoriques Date 12 novembre 2024 Heure du début 12h30 Où Pavillon André-Aisenstadt, 1409 Durée 2h Porte sur les objectifs 1–6 À développement ou choix multiples Choix multiples Récapitulatif Oui % de la note du cours 35% 7 Plan de Cours: Objectifs Spécifiques 1. Clonage 2. Hybrida2on et PCR 3. Clonage par PCR/RT-PCR 4. Expression dans un système hétérologue/SDS-PAGE 5. Analyse spécifique des protéines 6. Radioisotopes 8  Cours BCM2531 Cours 1, 2, 3, 4 et 5 Le clonage, ou technologie de l’ADN recombinant Cours 6 et 7 Expression de protéines recombinantes Cour 8 Radio-isotopes Ouvrages de référence Biologie Moléculaire de la Cellule, 3éme édition (version française) Lodish, Baltimore, Berk, Zipursky, Matsudaira, Darnell Biochemistry, 6th-8th edition (version anglaise) Biochimie 6ème ou 7ème édition (version française) Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L, Freeman WH & Co. Les sites web https://rnbio.upmc.fr/sites/default/files/animations/bio_mol/pcr/pcr.html http://genet.univ-tours.fr/angers/chap4-2.htm http://univ.ency-education.com/uploads/1/3/1/0/13102001/genetique1an- vecteurs_clonage2017.pdf 10  Projet expérimental de session BCM2531/2002 Détec&on de l’amertume: iden&fica&on des varia&ons du gène TAS2R38 entre les individus Transformation Cloner votre gène dans un vecteur Isoler un plasmide Isoler votre ADN Le transformer dans ayant votre gène en Amplifier votre gène des bactéries TAS2R38 par PCR insert Envoyer votre gène à Haplotype Vérification du séquencer phénotype Plasmides Amplification Séquençage Génotype Expression - Western Génotyper votre Expression de gène par TaqMan TAS2R38 Haplotype Immunobuvardage de type Western Génotypage  Le clonage Une multiplication à l’identique, une conservation parfaite de l'information génétique: à l’échelle cellulaire – clonage cellulaire ou à l’échelle de l’organisme entier – clonage reproductif. L’amplification d’un fragment d’ADN par des micro- organismes après son insertion dans un vecteur.  Clonage = technologie de l’ADN recombinant Isoler et amplifier à l’iden2que une séquence d’ADN d’intérêt Technologie de l’ADN recombinant, ou génie génétique: ensemble des techniques de construction d’un ADN recombinant et ses utilisations. L'ADN recombinant provient d'une combinaison entre l'ADN d'un organisme donneur et celui d’un vecteur (qui peut être d'une espèce totalement différente). Les cellules modifiées (ayant intégré un ADN recombinant) peuvent exprimer la protéine recombinante, par exemple une protéine d’une espèce différente, ou une protéine modifiée (mutée, fusionnée à une étiquette…). 13 Applica7ons de la technologie d’ADN recombinant - Analyser l’ADN génomique, le séquençage de l’ADN - Analyser la structure et l’expression d’ARNm - Expression de protéines recombinantes (bactéries, système mammifère, modèle animal) 1. Étudier la fonction, la signalisation 2. Étudier les interactions protéine-protéine 3. Déterminer la structure des protéines 4. Produire des antigènes pour générer des anticorps 5. Générer des vaccins et médicaments recombinants Synthèse d'insuline humaine par génie génétique https://americanhistory.si.edu 15 Les plantes transgéniques 16 Les applications de la technologie d’ADN recombinant 17  Principes de base de l’ADN recombinant Lʼenvironnement géné,que des organismes peut être modifié grâce à un nombre restreint de techniques inspirées de l’étude de l’ADN, l’ARN, des bactéries et des virus. En se basant sur: L’enzymologie des acides nucléiques La complémentarité des bases La possibilité d’introduire de l’ADN dans des organismes 18  Les outils du clonage 1. Les vecteurs de clonage 2. Les cellules hôtes 3. Les enzymes pour manipuler l'ADN 4. Les techniques reliées au clonage et à l'analyse  Les outils du clonage 1. Les vecteurs de clonage On appelle vecteur l'ADN dans lequel on insère le fragment d'ADN à étudier. L'ADN inséré est appelé insert ou ADN étranger ou ADN exogène. Les vecteurs sont donc des ADN dans lesquels on insère un fragment d'ADN que l'on veut étudier. Ces petits ADN sont généralement des plasmides ou des bactériophages. Il est nécessaire d'introduire ces bactériophages ou plasmides dans les bactéries pour réaliser une multiplication de ceux-ci. 1. Les vecteurs de clonage: Définition: Un vecteur est une séquence d’ADN permettant la propagation, la sélection, la modification d’une séquence d’ADN d’intérêt. En bref l’étude et la manipulation d’une séquence d’ADN isolée. 1. Les plasmides (< ~10 kb) Les plasmides sont des petits fragments d'ADN circulaire présents dans la cellule bactérienne et indépendants du génome bactérien. Ils sont capables de se répliquer de façon autonome dans un organisme. 2. Les phages (25 à 100 kb) Les phages sont des virus qui infectent les bactéries. Le bactériophage M13 par exemple a été modifié pour en faire un vecteur, il présente la particularité de posséder un génome à ADN simple brin. Après infection, un brin complémentaire est synthétisé, il se comporte donc comme un plasmide à l'intérieur de la bactérie et pourra être manipulé comme tel. 3. Les cosmides (~45 kb) Un cosmide est un vecteur artificiel constitué d'un plasmide hybride contenant la séquence cos du phage lambda. Les cosmides combinent les avantages de clonage des plasmides et augmentent la taille d'insertion possible dans les phages lambda jusqu'à, une quarantaine de kilo paires de bases. 4. Et d’autres types de vecteurs: BAC (chromosome bactérien artificiel; 300 kb), YAC (chromosome de levure artificiel; 1000 kb), HAC (chromosome humain artificiel; 6-10 Mb). h[p://genet.univ-tours.fr/ 1. Les vecteurs de clonage: 1. Les plasmides (< ~10 kb) Les plasmides sont des petits fragments d'ADN circulaire présents dans la cellule bactérienne et indépendants du génome bactérien. Ils sont capable de se répliquer de façon autonome dans un organisme. 2. Les phages (25 à 100 kb) Les phages sont des virus qui infectent les bactéries. Le bactériophage M13 par exemple a été modifié pour en faire un vecteur, il présente la particularité de posséder un génome à ADN simple brin. Après infection, un brin complémentaire est synthétisé, il se comporte donc comme un plasmide à l'intérieur de la bactérie et pourra être manipulé comme tel. 3. Les cosmide (~45 kb) Un cosmide est un vecteur artificiel constitué d'un plasmide hybride contenant la séquence cos du phage lambda. Les cosmides combinent les avantages de clonage des plasmides et augmentent la taille d'insertion possible dans les phages lambda jusqu'à, une quarantaine de kilo paires de bases. 4. Et d’autres types de vecteurs: BAC (chromosome bactérien artificiel; 300 kb), YAC (chromosome de levure artificiel; 1000 kb), HAC (chromosome humain artificiel; 6-10 Mb). seulement l'ADN nécessaire à la L'ADN d'intérêt/étranger prend la place replicagon/réparggon/stabilité cellulaire. des éléments non essentiels éliminagon des éléments non essengels Cosmide (cos – cohesive ends + plasmide)  BAC (chromosome bactérien artificiel) F plasmide (facteur de fertilité) conjugaison – transfert de genes entre bactéries les gènes par – répartir l'ADN entre les cellules filles Génome humaine: 3 milliards de bases d’ADN Nombre de plasmides: 300 000 Nombre de cosmides: 66 700 Nombre de BAC: 10 000  Les outils du clonage 1. Les vecteurs de clonage 2. Les cellules hôtes 3. Les enzymes pour manipuler l'ADN 4. Les techniques reliées au clonage et à l'analyse 2. Les cellules hôtes Défini&on: Cellule hébergeant un matériel géné&que étranger apporté par un virus, un plasmide, un ADN recombiné in vitro, ou une cellule en&ère. 1. Les Bactéries, p.ex. E. coli premier hôte uglisé, nombreux vecteurs plasmidique connus et uglisables, culture en masse dans les fermenteurs, taux d’expression élevés MAIS secrètent mal les protéines: éclatement des bactéries, pas de modificagons post- traducgonnelles 2. Les Levures, p.ex. Saccharomyces cerevisiae modificagons post traducgonnelles MAIS sécrégon des protéines est difficile, moins bon rendement 3. Les cellules des mammifère, p.ex. cellules CHO (chinese hamster ovary) Culture de masse en bioréacteurs, protéines complexes MAIS cher et rendement plus faible. 4. Et d’autres, cellules d’insectes http://genet.univ-tours.fr/ http://univ.ency-education.com/uploads/1/3/1/0/13102001/genetique1an-vecteurs_clonage2017.pdf Les bactéries permettent l’amplification à l’identique de séquences d’ADN sous forme de plasmide Les bactéries possèdent deux types d’ADN: - l’ADN chromosomique - l’ADN circulaire plasmidique L'ADN chromosomique circulaire L'ADN plasmidique circulaire (4 millions de paires de bases) (plusieurs milliers de paires de bases chacun) Des plasmides « artificiels » peuvent être générés et introduits dans les bactéries où ils pourront se répliquer 28  Les outils du clonage 1. Les vecteurs de clonage 2. Les cellules hôtes 3. Les enzymes pour manipuler l'ADN 4. Les techniques reliées au clonage et à l'analyse  La boîtes à ouCls de génie généCque Copier (5’→ 3’) Coller L’ADN polymérase L’ADN ligase L’ARN polymérase L’ARN ligase topoisomerase Couper recombinase 5’→ 3’ exonucléase Modifier 3’ → 5’ exonucléase phosphatase endonuclease topoisomerase phosphokinase terminal transferase recombinase  La boîtes à outils de génie génétique Copier (5’→ 3’) Coller L’ADN polymérase L’ADN ligase L’ARN polymérase L’ARN ligase topoisomerase Couper recombinase 5’→ 3’ exonucléase Modifier 3’ → 5’ exonucléase phosphatase endonuclease topoisomerase phosphokinase terminal transferase recombinase  La boîtes à outils de génie génétique Copier (5’→ 3’) Coller L’ADN polymérase L’ADN ligase L’ARN polymérase L’ARN ligase topoisomerase Couper recombinase 5’→ 3’ exonucléase Modifier 3’ → 5’ exonucléase phosphatase endonuclease topoisomerase phosphokinase terminal transferase recombinase Réplication de l’ADN Réparation de l’ADN  La boîtes à outils de génie génétique Copier (5’→ 3’) Coller L’ADN polymérase L’ADN ligase L’ARN polymérase L’ARN ligase topoisomerase Couper recombinase 5’→ 3’ exonucléase Modifier 3’ → 5’ exonucléase phosphatase endonuclease topoisomerase phosphokinase terminal transferase recombinase Réplica:on de l’ADN  Les outils du clonage 1. Les vecteurs de clonage 2. Les cellules hôtes 3. Les enzymes pour manipuler l'ADN 4. Les techniques reliées au clonage et à l'analyse  Les ou;ls du clonage 4. Les techniques reliées au clonage et à l'analyse Extraction et quantification d'ADN Polymerase Chain Reaction (PCR) pour amplifier et modifier un gène d’intérêt Construction et modification d'une vecteur Transformation pour insérer un plasmide dans E. coli Gel d'agarose pour analyser des fragments d'ADN Carte de réstriction d'un plasmide Séquençage d'ADN Hybridization (Northern blot)  Le clonage de l’ADN dans un plasmide ou vecteur vecteur ou plasmide marqueur de sélection polylinker, site de clonage un plasmide recombinant origine de réplication L’ADN/gène d’interet, ou insert  Comment obtenir l’ADN à cloner/sous-cloner ? Ø À partir de l’ADN génomique (cellules, tissus) Ø À partir d’un autre plasmide ou vecteur. Ø Par amplification (Polymérase Chain reaction – PCR) si la quantité de matériel est présente en quantité limitée ou si l’on souhaite obtenir un fragment spécifique. Ø Par synthèse d’acides nucléiques (synthèse in silico) de séquence connue 37 38  ADN dʼintérêt: Insert ADN Bactérie ETAPE 2: recombinant TRANSFORMATION, Plasmide SELÉCTION ET AMPLIFICATION ETAPE 1: DIGESTION- LIGATION ETAPE 3: PURIFICATION DE LʼADN RECOMBINANT ETAPE 4: ANALYSE 39 Révision sur la structure de l’ADN (images de Biologie Moléculaire de la Cellule) 40 La structure de l'ADN polymérase ressemble à une main droite Site actif de la polymérase 1 323 928 ADN pol I d’E. coli (324-928) “Klenow” polymérase 5′→3′ et exonuclease 3′→5′ ADN pol I d’E. coli (1-323) exonucléase 5′→3′ amorce (nouvel ADN) matrice (ADN copié) 3′→5′ exonucléase site actif Trois activités: 1. Polymérase 5ʹ à 3ʹ 2. Exonucléase, 3ʹ à 5ʹ 3. Exonucléase, 5ʹ à 3ʹ  pouce amorce doigts paume matrice POLYMÉRISATION ÉDITION  L’ADN polymérase Catalyse la synthèse d'un nouveau brin complémentaire à partir d'une matrice d'ADN simple brin et de dNTPs Attaque nucléophile du 3′-OH naissant sur l'a-phosphate du dNTP entrant Synthèse de l’ADN dans le sens 5′ à 3′ 5′ 3′ 3′ a g b 5′  Le mécanisme cataly8que depend de deux Mg2+ (A et B) Métal A (amorce) établi un pont entre le 3’OH et aPO42- Active le 3’OH Métal B orient le dNTP lié protège les charges negatives de dNTP stabilise l’état de transition L’ADN Polymérase: Activité Exonucléase 3ʹ→5ʹ Hydrolyse la liaison entre O3′ et P pour laisser un 3′-OH à l'extrémité du brin d’ADN Révision des erreurs de polymérase bases non appariées ciseaux : site d'hydrolyse L’ADN Polymérase: Activité Exonucléase 5ʹ→3ʹ Hydrolyse la liaison entre O3′ et P pour laisser un 3′-OH à l'extrémité Supprime un nucléotide à la fois de l'extrémité 5' Déplacement d’un site de coupure; synthèse du brin rétardé de l’ADN; réparation de l’ADN ciseaux : site d'hydrolyse * rupture de simple brin  Cours BCM2531 Département de biochimie et médecine moléculaire Faculté de médecine John Pascal, PhD Le clonage : « technologie de l’ADN recombinant » 47