Recombinant DNA technologie.pdf

2 RECOMBINANT DNA TECHNOLOGIE 2.1 RESTRICTIE-ENZYMEN 2.1.1 DNA FINGERPRINTING 2.2 GELELECTROFORESE 2.3 SOUTHERN BLOTTING 2.4 CDNA 2.5 KLONEREN 2.6 KLONERINGSVECTOREN 2.6.1 PLASMIDEN ALS KLONERINGSVECTOR 2.6.2 FAGEN ALS VECTOREN 2.6.3 COSMIDEN 2.6.4 PBLUESCRIPT (PBS)-VECTOR 2.6.5 ARTIFICIËLE CHROMOSO...

2 RECOMBINANT DNA TECHNOLOGIE 2.1 RESTRICTIE-ENZYMEN 2.1.1 DNA FINGERPRINTING 2.2 GELELECTROFORESE 2.3 SOUTHERN BLOTTING 2.4 CDNA 2.5 KLONEREN 2.6 KLONERINGSVECTOREN 2.6.1 PLASMIDEN ALS KLONERINGSVECTOR 2.6.2 FAGEN ALS VECTOREN 2.6.3 COSMIDEN 2.6.4 PBLUESCRIPT (PBS)-VECTOR 2.6.5 ARTIFICIËLE CHROMOSOMEN ALS VECTOREN 2.7 EXPRESSIEVECTOREN 2.8 EUKARYOTE EXPRESSIE SYSTEMEN 2.9 GENENBANKEN OF GENENBIBLIOTHEKEN 2.9.1 PROBES 2.10 TOEPASSINGEN VAN RECOMBINANT DNA TECHNOLOGIE 2.10.1 SITE-DIRECTED MUTAGENESE 2.10.2 DNA-MICROARRAYS 2.10.3 REPORTER GENEN 2.10.4 GREEN FLUORESCENT PROTEIN 2.10.5 KNOCK-OUTS 2.10.6 MEDISCHE TOEPASSINGEN 2 3 5 8 8 10 10 11 13 18 20 21 22 23 30 33 35 37 37 39 42 42 43 46 1 2 Recombinant DNA technologie De moedwillige verandering van de genetische informatie van een organisme door de nucleotidesequentie van zijn genoom te wijzigen, noemt men genetische manipulatie. De technieken die hierbij gebruikt worden, noemt men recombinant DNA technologie. De recombinant DNA technologie is een onderdeel van het proces om genetisch gemodificeerde organismen, de zogenaamde GGO’s te bekomen. In de media wordt vooral aandacht besteed aan genetisch gemodificeerde gewassen in de landbouw, maar dit is slechts een zeer klein deel van alle GGO’s. Vele GGO’s worden uitsluitend gebruikt in het laboratorium, zoals genetisch gemodificeerde proefdieren als diermodel voor een menselijke ziekte of bacteriën, gisten of cellijnen voor de productie van recombinante geneesmiddelen. Het ontwikkelen van GGO’s stelt enkele problemen. Zo zullen cellen (prokaryoot en eukaryoot) vreemd DNA niet spontaan opnemen. Vandaar werden technieken ontwikkeld om het vreemde recombinante DNA binnen te smokkelen in allerlei cellen. Wanneer willekeurig vreemd DNA er al in slaagt binnen te geraken in een cel, dan zal het DNA na celdeling niet doorgegeven worden aan de dochtercellen. Het is met andere woorden niet stabiel: het vreemd DNA repliceert niet en integreert niet in het gastheergenoom. Vandaar moet het vreemd DNA als het ware vermomd worden in een DNA-molecule die hetzij wel repliceert, hetzij wel integreert. De eenvoudigste organismen om genetisch te modificeren zijn bacteriën. Het vreemd DNA wordt vermomd in een plasmide. Dit recombinante plasmide wordt ingebracht in bacteriën. De bacteriekloon met het gewenste recombinante plasmide wordt geselecteerd en men kan de kloon onbeperkt groeien en tenslotte het recombinante DNA eruit isoleren. Bacteriën zijn prokaryoten. Daarom gebruikt men ook vaak gistcellen (Saccharomyces cerevisiae) die eukaryoot zijn. Vaak zijn de gastheercellen gemanipuleerd zodat ze geen restricite-enzymen hebben en geen RecA. Dit zorgt ervoor dat de kans kleiner wordt dat het ingebrachte vreemde DNA afgebroken of gewijzigd wordt. 2 2.1 Restrictie-enzymen Recombinant DNA is DNA dat ontstaat door twee DNA-fragmenten van verschillende origine te combineren. Om twee DNA-moleculen te recombineren zal men het DNA knippen met restrictieenzymen en plakken met DNA ligase. Een van de belangrijkste ontdekkingen om een recombinant DNA molecule te produceren, was dus de ontdekking van restrictie-enzymen. Dit zijn bacteriële enzymen die in staat zijn om DNA te knippen. Ze dienen om de cel te beschermen tegen vreemd DNA, meestal faag-DNA. Bacteriën beschermen hun eigen DNA tegen deze enzymen door specifieke nucleotiden te methyleren. Vreemd DNA is niet op dezelfde wijze gemethyleerd en zal dus aangevallen worden door de restrictie enzymen. Restrictie-enzymen knippen DNA op welbepaalde plaatsen. Elk restrictie-enzym heeft zijn eigen restrictie-sites. Er zijn honderden verschillende restrictie-enzymen bekend en ook commercieel beschikbaar. Type I en type III restrictie-enzymen herkennen hun site maar knippen het DNA op een welbepaalde afstand van deze site. De meest gebruikte restrictie-enzymen, type II, knippen het DNA op de herkenningsplaats zelf: de restrictieplaats. Vaak zijn de DNA-sequenties van de restrictie-sites, zogenaamde palindroomsequenties. Dit wil zeggen dat de sequentie in beide richtingen hetzelfde is. Het bekendste voorbeeld is de 5’GAATTC-3’ site van EcoRI. De complementaire streng van deze sequentie is net omgekeerd. EcoRI knipt het DNA tussen G en A. Hierdoor ontstaan zogenaamde “sticky ends”. De twee fragmenten 3 kunnen eenvoudigweg terug hybridiseren met elkaar. Dus DNA-fragmenten van twee verschillende organismen die beiden geknipt werden met EcoRI, kunnen heel eenvoudig met elkaar verbonden worden. 4 Sommige restrictie-enzymen leveren echter “stompe” uiteinden op (bv. AluI en HaeIII). Elk restrictieenzym is genoemd naar de bacterie waaruit het geïsoleerd werd. 2.1.1 DNA fingerprinting Bij deze techniek maakt men gebruik van de aanwezigheid van korte nucleotidensequenties die regelmatig herhaald worden in het DNA = minisatellieten of microsatellieten. Verschillende individuen zullen verschillende repetitiepatronen hebben. Dit is dus een soort vingerafdruk (“fingerprint”). Men begint met het knippen van het DNA met behulp van restrictie-enzymen (men kiest een restrictie-enzym dat niet in de microsatelliet knipt). Vervolgens scheidt men de fragmenten door electroforese en denatureert en blot ze op een nitrocellulosemembraan. Dan incubeert men dit membraan met een gelabelde probe die complementair is met de microsatelliet. 5 6 Deze techniek kent veel toepassingen in het forensisch onderzoek. Er is echter een probleem met deze manier van fingerprinting; omdat er zoveel microsatellieten aanwezig zijn in het DNA, krijgt men vaak een ‘smeer’ in plaats van duidelijk afgescheiden bandjes. Dit komt omdat de aangekleurde bandjes veel te dicht opeen zitten. Daarom maakt men meestal gebruik van een mengeling van 4 of 5 verschillende probes die elk hybridiseren met één bepaalde locus die verschillend is voor elk individu. Op deze manier krijgt men veel minder bandjes (4 of 5) en kan men toch heel correct identificeren. Dit ziet men ook bij de ‘Restriction Fragment Length Polymorphism’ (RFLP): elk individu heeft een ander knippatroon bij het gebruik van restrictie-enzymen. 7 2.2 Gelelectroforese Gelelectroforese is een techniek om moleculen van elkaar te scheiden op basis van hun grootte en hun lading. Men brengt een mengsel van moleculen van verschillende grootte aan in een kuiltje (well) aan één zijde van de gel. Vervolgens creëert men een elektrisch spanningsveld waardoor de moleculen gaan migreren naar de andere pool. DNA is negatief geladen, en zal dus migreren naar de positieve pool. Het medium waardoor ze moeten migreren is een gel. Men kan gebruik maken van agarosegels of polyacrylamide gels. De belangrijkste eigenschap van de gel is de grootte van de poriën in de gel. Hoe groter de poriën zijn, hoe sneller de moleculen er doorheen migreren, maar ook hoe slechter de resolutie. De snelheid waarmee de moleculen doorheen de gel migreren hangt immers niet alleen af van hun lading, maar ook van hun grootte. Grote moleculen zullen trager doorheen de gel migreren dan kleine moleculen. Afhankelijk van de behoefte aan een bepaalde resolutie, kan de concentratie agarose of acrylamide in de gel aangepast worden. Hoe hoger de concentratie agarose, hoe fijner de poriën, hoe nauwkeuriger de scheiding. Men kan op één gel verschillende stalen laden, in verschillende lanen. Er zal ook altijd een controleladder geladen worden. Dit is een mengsel met fragmenten van gekende lengten. Zo kan men de lengte van de gescheiden fragmenten bepalen. 2.3 Southern blotting In 1975 ontdekte Edwin Southern een manier om een specifiek DNA fragment te detecteren; namelijk Southern blotting. Het DNA van een organisme wordt eerst geknipt met restrictie-enzymen en dan worden de verkregen fragmenten gescheiden met behulp van een agarose gel electroforese. De fragmenten worden gedenatureerd (enkelstrengig gemaakt) en overgebracht op een membraan. Dit is de eigenlijke blotting. Bij Southern blotting maakt men gebruik van de capillaire kracht die ontstaat wanneer een NaOH-oplossing aangezogen wordt door een berg papieren servetten. De vloeistofstroom passeert op zijn weg de gel en vervolgens het blotpapier van nitrocellulose. De DNAfragmenten worden door de vloeistofstroom meegesleurd tot op het blotmembraan, dat doorlaatbaar is voor de vloeistof maar niet voor de DNA-fragmenten. Het membraan wordt 8 vervolgens onderworpen aan UV-straling en/of aan hoge temperaturen, waardoor het DNA echt gefixeerd wordt op het membraan. Het membraan wordt dan geïnbuceerd in een oplossing met daarin radioactieve probes. Dit zijn enkelstrengige DNA fragmenten die complementair zijn aan het gewenste fragment. De buffercondities en de temperatuur bij hybridisatie zullen bepalend zijn voor het uiteindelijke resultaat. Na enkele wasstappen waarbij alle ongebonden of aspecifiek gebonden probe weggewassen wordt, volgt de visualisatie. Voor een radio-actief gelabelde probe gebeurt dat met behulp van een autoradiogram. Eén of enkele banden zijn nu te zien uit de complexe pool van gescheiden DNA-fragmenten. Er bestaan ook niet-radioactieve probes. 9 2.4 cDNA Reeds van bij het begin van de recombinant DNA technologie, werd het duidelijk dat het kloneren van eukaryote genen in prokaryoten problematisch zou kunnen zijn. Eukaryoot DNA en pre-mRNA bevatten immers intronen, die eruit gehaald moeten worden. Prokaryoten zijn niet in staat om dit te doen. Het probleem werd opgelost met de ontdekking van het enzym reverse transcriptase (RT) uit retrovirussen. Dit enzym kan RNA omzetten in DNA. Men kan dus vertrekken van reeds gespliced eukaryoot mRNA (vrij van intronen) en dit omzetten in complementair DNA (cDNA). Dit cDNA kan men dan gebruiken om in een bacterie te kloneren of tot expressie te brengen. Bij de meeste eukaryoten heeft een mRNA een polyA-staart aan 3’. Men maakt hiervan gebruik door oligodT als primer te gebruiken voor het reverse transcriptase (RT). Het RT maakt een complementaire DNAstreng aan. Vervolgens voegt men RNase H toe: dit enzym verwijdert het RNA, maar niet volledig. De restfragmenten dienen als primers voor het DNApolymerase. 2.5 Kloneren Het aanmaken van een groot aantal identieke DNA moleculen noemt men kloneren. Een van de manieren om een gen te klonen of kloneren wordt voorgesteld in onderstaande figuur. Eerst wordt het juiste DNA-fragment of gen geïdentificeerd en geïsoleerd. Als het opgezuiverd is, wordt het in een vector gebracht om een recombinant DNA molecule of plasmide te vormen. Deze vectoren 10 worden dan in een gastheercel overgebracht. De gastheercellen worden opgekweekt, zodat je een kloon krijgt van recombinante cellen. Het gen dat je wil kloneren en in een vector brengt, noemt men het ‘insert’. 2.6 Kloneringsvectoren Een vector is een dragermolecule dat het insert in de gastheercel binnenbrengt. In de gastheercel kan de vector zich dan vermenigvuldigen, samen met het insert. Er bestaan vier types van vectoren, die gebaseerd zijn op: • • • • Plasmiden Fagen of virussen Cosmiden Artificiële chromosomen 11 Elk type heeft zijn voor- en nadelen. Een vector moet minstens de volgende eigenschappen hebben: • Een origin of replication (replicatiestartpunt): de vector kan zich autonoom repliceren in de gastheercel. Een shuttle-vector heeft twee origins of replication; één voor elke soort gastheercel (zie verder) • • Een multiple clonins site (MCS): dit zijn restrictie-sites of knipplaatsen voor restrictieenzymen zodat het insert gemakkelijk ingebouwd kan worden. Een merker: dit zorgt ervoor dat je achteraf de bacteriën die een vector met insert hebben opgenomen, gemakkelijk kan selecteren. 12 2.6.1 Plasmiden als kloneringsvector Plasmiden worden heel veel gebruikt omdat ze gemakkelijk te isoleren zijn en omdat ze zich autonoom kunnen repliceren. De eerste generatie plasmiden die ontwikkeld werden behoren tot de pBR-reeks, maar worden nu nog amper gebruikt. Ze bevatten genen die coderen voor ampicilline- en tetracyclineresistentie, een origin of replication (ori), een knipplaats voor verschillende restrictieenzymen. Het selecteren van de gewenste klonen gebeurt door replica-plating. Het pBR-plasmide 13 pBR322 als kloneringsvector: het resultaat is een kloon die resistent is tegen tetracycline en gevoelig voor ampicilline. 14 Selectie van de gewenste kloon door middel van replica plating: detectie van de kloon die resistent is tegen tetracycline en gevoelig is voor ampicilline. Volgende generaties plasmiden werden ontwikkeld, oa. de pUC-reeks. Deze zijn gebaseerd op de pBR-vectoren. Ze bevatten ongeveer 40% van het DNA van de pBR-vectoren. pUC-plasmiden hebben een origin of replication waardoor ze zich autonoom kunnen vermenigvuldigen in E.coli. Ze hebben dan ook een hoog copy number. Een pUC-plasmide repliceert zich ongeveer 100 keer in één generatie. Dus E.coli heeft één chromosoom en 100 kopieën van het pUC-plasmide. Dit hoge copy number biedt veel voordelen; het vereenvoudigt de opzuivering en verhoogt de oogst van het gecloneerde gen. Daarnaast bevatten ze onder andere een ampicillineresistentie-gen, een multiple cloning site (MCS) en het lacZ’-gen (codeert voor een gedeelte van het β-galactosidase, het ander gedeelte is aanwezig in het bacteriële chromosoom). Men maakt gebruikt van de X-gal screening op een medium met ampicilline. Het merkergen lacZ’ in de vector wordt door de insertie van het insert in de multiple cloning site (MCS) geïnactiveerd. De MCS bevindt zich middenin het open reading frame (ORF) van het β-galactosidase. Insertie 15 onderbreekt het open reading frame. Transcriptie en translatie van het alternatieve ORF zorgt zelden voor een functioneel β-galactosidase. Het β-galactosidase is een enzym dat het kleurloze X-gal kan omzetten in een stabiel blauw product. Bacteriën die lege vector (zonder insert) opnamen, hebben een intact lacZ’ en zullen in staat zijn deze omzetting uit te voeren en worden zichtbaar als blauwe kolonies op de antibiotica en X-gal bevattende platen. Witte kolonies bevatten bacteriën met een geïnactiveerd β-galactosidase, zeer waarschijnlijk door insertie in de MCS. De kolonies met een vector+insert zullen dus wit zijn, degenen die een vector zonder insert dragen, zullen blauw zijn. Dit is dus veel sneller en eenvoudiger dan de replica-plating techniek. Men moet wel oppassen voor vals-positieve resultaten: dit zijn witte kolonies ZONDER insert. De oorzaak hiervan is de werking van ‘nucleases’. Dit zijn enzymen die de beide uiteinden van de vector “afknabbelen”. Het gevolg hiervan is dat de inserts niet meer opgenomen kunnen worden. Vaak is ook het lacZ’-gen aangetast waardoor er geen β-galactosidase gevormd kan worden en de kolonies dus wit zijn. Het is dus belangrijk dat je werkt met zuiver materiaal, vrij van nucleases. 16 pUC 18 en pUC 19 Een ander probleem dat vaak voorkomt, is vectoren die terug sluiten, zonder insert. Hiervoor bestaan ook oplossingen. Men kan de vectoren behandelen met alkalisch fosfatase: dit enzym verwijdert de 5’-fosfaatgroepen die nodig zijn voor de ligatie. Een andere manier om bovenstaand probleem te omzeilen is het gebruik van 2 verschillende restrictie-enzymen. Als je in de MCS knipt met twee verschillende restrictie-enzymen, heb je geen ‘sticky ends’ die terug met elkaar kunnen hybridiseren. Een bijkomend voordeel is dat je op deze manier ‘directional cloning’ kan verkrijgen. Dit is belangrijk voor het tot expressie brengen van het gekloneerde gen. Men kan immers de juiste oriëntatie van het insert verzekeren. 17 2.6.2 Fagen als vectoren Men kan ook gebruik maken van (bacterio)fagen of afgeleiden als vectoren. Het grote voordeel hiervan is dat de infectie (of het inbrengen van de vector) veel efficiënter gebeurt. Het recombinante faag-DNA wordt immers verpakt in virale capsiden en geïnjecteerd in de bacterie. Men verkrijgt een veel hogere opbrengst van het gekloneerde gen. In het lysaat vindt men duizenden faagpartikels met het gekloneerde gen. Bovendien kan zo’n faagvector grotere inserts bevatten. Dit is interessant bij het opstellen van bijvoorbeeld een genenbibliotheek. Een voorbeeld van een veelgebruikte faag is de λ-faag. De eerste gemanipuleerde faag die tot vector werd omgevormd, kreeg de naam ‘Charonfaag’. Men knipt deze faag met EcoRI waardoor men 4 18 fragmenten verkrijgt. Alleen de twee buitenste ‘armen’ zijn nodig (de linker- en de rechterarm). Tussen deze twee armen kan men het insert inbouwen. Het insert moet een welbepaalde grootte hebben. Het mag niet te klein zijn, anders zal de faag het DNA niet verpakken tijdens zijn replicatiecyclus, maar het mag ook niet te groot zijn. Ideaal is een grootte tussen de 12 en 20 kbDNA. Om zulke fragmenten te verkrijgen, moet men een onvolledige digestie van het genomisch DNA uitvoeren met EcoRI. Omdat de knipplaats van EcoRI vrij frequent voorkomt, zouden bij een volledige digestie fragmenten ontstaan van ongeveer 4kb. Bovendien zouden vele genen in fragmenten geknipt worden. Ideaal is een digestie waarbij EcoRI om de 4 à 5 knipplaatsen knipt. Op deze manier verkrijgt men fragmenten van 16kb – 20kb. Dit zijn ideale inserts. M13-fagen kunnen ook gebruikt worden als basis voor een vector. Dit zijn enkelstrengige DNA-fagen. De vectoren bevatten het β-galactosidase gen en een MCS. Omdat het ssDNA-fagen zijn, worden ze gebruikt bij de ‘site-directed mutagenese’ of bij sequencing. Tijdens zijn replicatie in E.coli zet M13 zijn ssDNA om in dsDNA. Dit noemt de Replicative Form (RF). Het is dit dsDNA dat gebruikt wordt 19 voor de aanmaak van de vector en de inbreng van het insert. Het resultaat van de replicatie zijn ssDNA moleculen. 2.6.3 Cosmiden Een andere groep van vectoren zijn de cosmiden. Dit zijn samengestelde vectoren, ze komen niet in de natuur voor. Het is eigenlijk een combinatie van plasmiden en fagen. Ze bevatten de ‘cohesive ends’ (‘cos’) van de faag en een ‘origin of replication’ van de plasmide (‘mide’). Het grote voordeel van deze vectoren is dat ze heel grote inserts kunnen bevatten omdat bijna al het DNA van de faag verwijderd is (behalve de cos-sites). Ze zijn nog wel infectieus: De faag injecteert de vector in de bacterie. In de bacterie zal de vector zich repliceren met behulp van zijn ‘origin of replication’. 20 2.6.4 pBluescript (pBS)-vector Dit is opnieuw een combinatie tussen plasmiden en fagen: een faagmide. Een bekend voorbeeld van zo’n faagmide is de pBluescript (pBS)-vector. Deze vector bevat het lacZ’-gen met een MCS en een tweede ori-segment dat afkomstig is van de ssDNA faag f1 (verwant met M13). Als men ssDNAcopiën wenst, verpakt in fagen, dan moet er in de gastheercel ook een helperfaag f1 aanwezig zijn. De replicatie gebeurt zoals bij M13, met de productie van ssDNA moleculen die verpakt worden in fagen. Deze vectoren worden vaak gebruikt als men geïnteresseerd is in het RNA-transcript. De MCS wordt geflankeerd door 2 verschillende promoters die faag- RNA –polymerase kunnen binden : T3 en T7. Door de aanwezigheid van deze promoters kan men in vitro RNA transcripten produceren. Men kan kiezen welke DNA-streng getranscribeerd wordt door ofwel gebruik te maken van T3 ofwel van T7 RNA polymerase. 21 Door de aanwezigheid van het lacZ’ gen, kan men de gewenste kolonies (+vector +insert) selecteren. Om de transcriptie te stimuleren, voegt men IPTG als inducer toe. Dit IPTG bindt de repressor van het lac-operon en de transcriptie kan dus plaatsvinden. Om lekkage van het operon te voorkomen, is er op de vector ook nog een lacI-gen aanwezig. Dit gen codeert voor de repressor. Er is dus zeker repressie van het lacZ’gen (of het insert) in afwezigheid van de inducer (IPTG). Het is vaak belangrijk om de expressie van eukaryote eiwitten in de bacterie strikt te reguleren (zie verder). 2.6.5 Artificiële chromosomen als vectoren Dit zijn onder andere YAC (Yeast Artificial Chromosome), BAC (Bacterial Artificial Chromosome) en PAC (P 1 Artificial Chromosomes): deze kunnen grote inserts bevatten en werden gebruikt bij het Humaan Genoom Project om het volledige menselijke genoom in kaart te brengen. Net zoals natuurlijke chromosomen, repliceren artificiële chromosomen zich slechts één keer per celcyclus. YACs werden het eerst ontwikkeld en zij bevatten gist telomeren (TEL) aan elk uiteinde en een centromeer (CEN), een gist origin of replication (ARS; autonomously replicating sequence), een merkergen zoals URA3 en een MCS. YACs werden ontwikkeld om zeer grote inserts te kunnen kloneren (tot 1000kb). Omdat ze vaak instabiel waren en er recombineerden met de chromosomen van de gistcel, werden BACs ontwikkeld. BACs bevatten kleinere inserts (tot 300kb), maar ze zijn veel 22 stabieler. BACs zijn gebaseerd op de F-factor van E.coli. Ze bevatten genen die ervoor zorgen dat er een replicatiecomplex gevormd kan worden (repE), genen die ervoor zorgen dat elke dochtercel netjes een kopie meekrijgt (sopA, B en C) en genen die men bij andere plasmiden terugvindt, zoals een MCS in het lacZ gen en een merkergen (CmR). 2.7 Expressievectoren Deze vectoren zijn geschikt om genen effectief tot expressie te brengen in hun gastheercel. De gastheercellen zijn vaak bacteriën. Dit kan problemen geven als men eukaryote eiwitten tot expressie wil laten brengen. Expressievectoren moeten in het bezit zijn van de juiste promotoren die bijvoorbeeld door bacteriële enzymen herkend en gebonden kunnen worden. Een aantal vectoren die we hierboven hebben besproken, kunnen ook gebruikt worden voor expressie; bijvoorbeeld pUC en pBS. Zij zijn immers in het bezit van de lac-promotor. Ondertussen zijn er betere en meer gespecialiseerde expressievectoren ontwikkeld. Zij bevatten een sterke promotor en een goeie ribosoom-bindingsplaats. Vaak werkt men met induceerbare expressievectoren. De expressie van eukaryote eiwitten in een bacterie moet gecontroleerd gebeuren omdat eukaryote eiwitten toxisch kunnen zijn voor bacteriën. Bovendien kan bij de gastheerbacterie bij continue expressie van het vreemde eiwit, zijn eigen groei en vermenigvuldiging onderdrukt worden. Dit zorgt dan ook voor een kleinere ‘oogst’. Een ander voorkomend fenomeen is de vorming van ‘inclusion bodies’. Dit zijn plaatsen in het cytoplasma van de bacterie waar de eukaryote eiwitten neerslaan. Een voorbeeld van een van de eerste medische toepassingen van recombinant DNA technologie, is de productie van het menselijk groeihormoon somatostatine. Het gen voor somatostatine wordt 23 chemisch aangemaakt en bevat naast de 42 coderende basen ook nog een codon voor methionine aan het 5’ einde en twee stopcodons aan het andere uiteinde. Dit kuntstmatige gen wordt ingebouwd in een plasmide vector. Dit doet men door aan aan de uiteinden van het gen complementaire sequenties met de sticky ends van EcoRI en BamHI te plakken. De expressievector wordt dan ook met deze RE geknipt en het insert kan gemakkelijk ingebouwd worden. Het insert bevindt zich in het midden van het β-galactosidasegen; stroomafwaarts van de promotor, operator en ribosoom bindingsplaats. Men brengt deze vector men insert in de gastheerbacterie in en de bacterie produceert een fusie-eiwit. Dit bestaat uit het somatostatinepolypeptide, gekoppeld aan een stuk van het β-galactosidase via een methionine residue. Behandeling met cyanogeenbromide zal de twee peptiden losknippen van elkaar ter hoogte van het methionine residue. Eens het somatostatine polypeptide vrij is, kan het zich op de juiste manier plooien en geïsoleerd worden. Men kan de expressie van somatostatine reguleren omdat het onder controle staat van de lacpromotor. 24 Een probleem bij het gebruik van de lac-promotor is het feit dat het lac-operon “lekt”. Ook als er geen inducer is (IPTG) en de repressor in principe het operon onderdrukt, zal het operon toch licht actief zijn en treedt er een minimale expressie op. Dit geldt dan ook voor het insert. Als men zeker de expressie van het insert wil blokkeren (of juist stimuleren), maakt men meestal gebruik van een vector die zelf ook een lacI-gen bevat. Dit lacI-gen codeert zoals eerder al een paar keer vermeld, voor de repressor van het lac-operon. De expressie zal pas op gang komen na toevoegen van IPTG als inducer. Een andere promotor die men kan gebruiken is de trc-promotor. Dit is een combinatie tussen een sterke trp-promotor en de induceerbaarheid van de lac-promotor. Deze promotor bevat namelijk de -35 box van de trp-promotor en de -10 box van de lac-promotor, alsook de lac- operator. Nog een voorbeeld is de promotor van het arabinose-operon (P BAD ). Deze zal men gebruiken als men een zeer gevoelige en fijne controle van expressie wenst. De inducer is in dit geval arabinose. De promotor reageert heel snel en gevoelig op een stijgende concentratie arabinose. 25 De λ-faag promotor kan men gebruiken in gastheercellen met een temperatuurgevoelig λrepressorgen. Bij “lage” temperaturen (32°C) is de repressor actief en is er dus geen expressie. Bij “hoge” temperaturen (42°C) is de repressor inactief en is er wel expressie. Een ander voorbeeld van een virale promotor is de T7-faag promotor. Deze wordt gebruikt in gastheercellen met een strikt gereguleerd gen voor T7 -RNA polymerase. Dit laatste gen kan bijvoorbeeld onder controle staan van een lac-promotor in een cel die ook het lacI-gen bevat. Er is dus een sterke repressie van T7-RNA polymerase zonder inducer (IPTG) en dus ook van het doel-gen want er is geen T7-polymerase dat op de promotor kan binden. Van zodra de lac-inducer (IPTG) wordt toegevoegd, zal de expressie van T7 polymerase enorm stijgen en vervolgens dus ook van het doel-gen. De meeste expressie-vectoren produceren “fusie-eiwitten”. Op het eerste zicht lijkt dit nadelig: er zitten namelijk extra AZ vast aan het eigenlijke eiwit. Maar juist deze extra AZ kunnen helpen bij het opzuiveren van de eiwiten. 26 Een voorbeeld is de oligohistidine-expressievector (pTrcHis). Deze vector zorgt dat er een eiwit geëxpresseerd wordt met 6 extra Histidines eraan gehecht. Dit helpt bij het opzuiveren tijdens affiniteitschromatografie. Deze histidine-residuen hebben namelijk een hoge affiniteit voor divalente metaalionen zoals bijvoorbeeld nikkel (Ni2+). Men kan het gevormde eiwit gemakkelijk opzuiveren met behulp van nikkel-affiniteits-chromatografie. Het eiwit met de histidines aan wordt tegengehouden op de kolom terwijl de andere eiwitten erdoor lopen. Daarna wordt het eiwit geëlueerd met behulp van histidines. Hoe kan men dan achteraf de histidines verwijderen? De onderzoekers die deze vector hebben ontwikkeld, hebben tussen de codons van histidine en de plaats van het insert, codons geplaatst die coderen voor een AZ-sequentie die herkend wordt door het ‘enterokinase’. Dit is een protease, geen 27 kinase! Dit enterokinase knipt het eiwit los. Men kan dit eiwit dan scheiden van de histidines door een tweede scheiding op de Ni-kolom. Een ander voorbeeld is de λgt11-vector. Hier is weeral de λ-faag de basis. In deze vector zit ook nog een lac-promotor, operon en het lacZ’ met een MCS. Het resultaat van expressie is een fusie-eiwit dat bestaat uit een gedeelte van het β-galactosidase en het doel-eiwit. Het β-galactosidase-gedeelte helpt bij de stabilisatie van het eukaryote eiwit in de bacterie en kan ook helpen bij de opzuivering. Men gebruikt hiervoor affiniteitschromatografie op een kolom met anti-β-galactosidase antilichamen. 28 Deze vectoren worden vaak gebruikt bij het screenen van cDNA-bibliotheken. Men zal λ-fagen met verschillende DNA-inserts uitplaten. De eiwitten die elke kloon geproduceerd heeft, worden overgebracht op een nitrocellulose-membraan. Vervolgens incubeert men met specifieke AL die binden op het gezochte peptide. De detectie gebeurt met behulp van gelabeld proteïne A (afkomstig van S.aureus). Dit proteïne A bindt zeer sterk aan antilichamen. 29 2.8 Eukaryote expressie systemen Zoals gezegd, bestaan er een aantal problemen als men eukaryote eiwitten tot expressie brengt in bacteriën. Naast het feit dat ze soms toxisch kunnen zijn, kunnen ze ook afgebroken worden door de bacterie. Bovendien is een bacterie niet in het bezit van de enzymen en het apparaat dat nodig is om ‘posttranslatie-modificaties’ aan te brengen aan eukaryote eiwitten. Ook de correcte vouwing vindt vaak niet plaats. Dit zorgt er allemaal mee voor dat deze eiwitten worden neergeslagen in de zogenaamde ‘inclusion bodies’. Men kan deze problemen omzeilen door gebruik te maken van eukaryote gastheercellen. Hiervoor maakt men meestal gebruik van bakkersgist. Deze combineert de voordelen van bacteriën (eenvoudig en snel te kweken) met het feit dat het een eukaryoot organisme is en dus de meeste noodzakelijke eukaryote enzymen enzovoort heeft. Meestal zal men de initiële klonering uitvoeren in E.coli met behulp van een shuttle-vector. Een shuttle-vector kan in verschillende gastheercellen gebruikt worden: bijvoorbeeld in een bacterie en in een gistcel. Hij werkt dus als een soort “shuttle” tussen twee gastheercellen; voor de klonering een bacterie, voor de expressie een gistcel. Een voorbeeld van zo’n shuttle-vector is gebaseerd op het 2-micron-plasmide dat van nature aanwezig is in gistcellen: YEp24. Men heeft in dit plasmide een pBR-origin of replication aangebracht. Met behulp van deze laatste sequentie kan de vector zich dus vermenigvuldigen in E.coli. Daarnaast bevat de 30 vector ook nog merkergenen zoals ampR en URA3. Dit laatste codeert voor een eiwit dat essentieel is voor de biosynthese van uracil in S.cerevisiae. Vandaar dat men moet werken met uracil auxotrofen van S.cerevisiae. De meeste van deze vectoren zijn zo gemaakt dat het insert ‘vasthangt’ aan een gen dat codeert voor een export-signaal-peptide. Dit vergemakkelijkt de ‘oogst’ sterk, men kan het eiwit gewoon uit het medium halen omdat de gistcel het zal secreteren. Een ander voorbeeld is het baculovirus. Dit virus infecteert de rups. Het virus bevat een groot circulair dsDNA genoom (+/- 130 kb). Het belangrijkste eiwit dat gecodeerd wordt is ‘polyhedrine’. Dit eiwit komt in enorme hoeveelheden voor in geïnfecteerde cellen. Dit polyhedrine-gen is dus blijkbaar een zeer actief gen en bezit dus ook een zeer sterke promotor. Eerst en vooral construeert men een transfervector: deze bevat een polyhedrinepromotor, een gen nodig voor virus-replicatie, een BamHI-knipplaats, bacteriële vectorsequenties en uiteraard het doelgen (dat men tot expressie wil brengen). De BamHI-knipplaats is vlak naast de krachtige promotor. Deze transfervector mengt men dan met wild-type viraal DNA waaruit de genen voor replicatie en polyhedrine verwijderd zijn. Men transfecteert de insecten met dit mengsel. In de geïnfecteerde cellen zal nu recombinatie optreden waarbij het gecloneerde gen overgebracht wordt in het viraal DNA. Zo ontstaat een recombinant virus. Met dit virus worden de cellen geïnfecteerd. Het eiwit kan dan uit deze cellen worden geoogst. Uit cellen met WT-virussen wordt niks geoogst, deze virussen kunnen zich niet vermenigvuldigen. 31 Gen voor virale replicatie Insert Bacteriële vectorgenen Het T i -plasmide wordt gebruikt bij de genetische manipulatie van planten. Dit plasmide is afkomstig van de bacterie Agrobacterium tumefaciens. Dit is een plantenpathogeen die tumoren kan induceren. De bacterie is immers in het bezit van een groot conjugatief plasmide (T i : tumor inducing) dat genen bevat die de celdeling van de plant stimuleren. Het meest interessante is echter dat het zich stabiel kan integreren in de chromosomen van de plant. Dit plasmide is dus zeer geschikt om te gebruiken als basis voor de genetische manipulatie van planten. 32 2.9 Genenbanken of genenbibliotheken Er zijn verschillende manieren waarop men een gewenst DNA-fragment of gen kan bekomen. Men kan het aanmaken met behulp van PCR of detecteren dmv Southern blotting. PCR vereist echter kennis van de nucleotidesequenties of toch tenminste die van de flankerende sequenties en ook voor Southern blotting moet men een goeie probe kunnen aanmaken. Wat moet er nu gebeuren als de wetenschapper geen idee heeft van de nucleotidesequentie? Hij of zij kan dan een genenbank opstellen en screenen. 33 Het doel van het opstellen van een genenbank is om te beschikken over het volledige genoom van een organisme door het in fragmenten op te splitsen en in verschillende vectoren te brengen en te kloneren. De som van de verschillende fragmenten moeten het volledige genoom bestrijken. Men begint dus met het knippen van het genoom met behulp van restrictie-enyzmen. De fragmenten kunnen dan geïnsereerd worden in vectoren en vervolgens gekloneerd in micro-organismen of verpakt worden in fagen waarmee men de micro-organismen infecteert. In elk geval worden duizenden verschillende klonen gecreëerd. Deze kan men gemakkelijk bewaren. Om nu de kloon met het gewenste fragment te selecteren, moet men wel iets weten over het gen of het fragment. Als het genoom gecloneerd werd in micro-organismen die het tot expressie kunnen brengen, kan men op zoek gaan naar een specifiek eiwit of fenotype. Voorbeeld: men onderzoekt een nieuwe bacterie die uit de grond geïsoleerd is en men is op zoek naar het gen dat codeert voor een enzym voor de biosynthese van alanine. Men kan de genenbank dan tot expressie laten komen in E.coli of B.subtilis auxotrofen voor alanine. De klonen die kunnen groeien op een medium zonder alanine, zijn goede kandidaten om dat gen te bevatten. Deze techniek noemt men ‘fenotypische rescue’. 34 Veel genenbanken worden opgesteld door gebruik te maken van fagen om het genoom te kloneren. De resulterende plaques bevatten dan faagpartikels met de gekloneerde DNA-fragmenten. De plaques kunnen gescreend worden met behulp van gelabelde probes, net zoals in de Southern blotting techniek. Het verschil is wel dat het DNA in dit geval direct van de petriplaat overgebracht wordt op een membraan. Dit membraan wordt dan geïncubeerd met de gelabelde probe. Men spreekt dan van ‘plaque hybridisation’. Als men een genenbank van een eukaryoot organisme wil opstellen om een bepaald gen te isoleren, zal men een cDNA bank opstellen. Het grote voordeel is dat er dan geen intronen meer aanwezig zijn. Enkel de eiwit-coderende regio’s van het genoom zullen gekloneerd worden. cDNA wordt aangemaakt en in een geschikte vector gekloneerd. Men kan dan via fenotypische rescue of gelabelde probes op zoek gaan naar het gewenste gen. 2.9.1 Probes Er zijn twee soorten probes die men kan gebruiken om genenbanken te screenen op bepaalde genen. Er zijn enerzijnds poly- of oligonucleotiden en anderzijds antilichamen. We gaan even dieper in op de eerste soort: de poly- of oligonucleotide probes. 35 Als men op zoek wil gaan naar een kloon die een bepaald gen draagt, kan men als probe een homoloog gen uit een ander organisme gebruiken. Men gaat ervan uit dat gelijkaardige genen gelijkaardige sequenties zullen hebben. Meestal klopt dit wel, maar nooit 100%. Men zal dus de hybridisatiecondities minder streng moeten maken zodat ook minder homologe sequenties kunnen hybridiseren. Dit kan men doen door bijvoorbeeld de temperatuur te laten zakken tijdens de hybridisatie, of de concentratie organische solventen of zout te wijzigen. Dit zijn immers parameters die van belang zijn voor een hybridisatie of denaturatie. Stel dat men een gedeelte van de aminozuur-sequentie van het eiwit (genproduct) waarin men geïnteresseerd is, kent, dan kan men vrij gemakkelijk de nucleotidensequentie van het DNA achterhalen. Het probleem is wel dat er een degeneratie is van de genetische code; dit wil zeggen dat één aminozuur gecodeerd kan worden door meer dan één codon (soms tot 6 verschillende codons!). Men zal dus een mengeling moeten maken van verschillende mogelijke oligonucleotides om als probe te dienen. Voorbeeld: ricine (toxine): trp-met-phe-lys-asn-glu Als men gaat kijken naar de genetische code voor deze AZ-sequentie, dan kan men snel zien dat men een mengeling van 8 17-base-oligonucleotiden (17-meren) nodig heeft. UGG AUG Trp Met UUC U Phe AAA G Lys AAC U Asn GA Glu De eerste twee AZ hebben slechts één codon, de volgende drie hebben telkens twee mogelijke codons. Het zesde geeft ons twee extra basen omdat de degeneratie enkel het laatste base betreft. We moeten dus een mengsel van 8 combinaties (17-meren) maken als probe. Oefening: Dit is de AZ-sequentie van een hypothetisch eiwit waarvan het gen je wil klonen: Arg – Leu – Met – Glu – Trp – Ile – Cys – Pro – Met – Leu a) Welke sequentie van 5 AZ zou een 17-meer-probe opleveren met de minste degeneratie? b) Hoeveel verschillende combinaties van 17-meren zou je moeten synthetiseren om er zeker van te zijn dat je probe hybridiseert met de juiste sequentie van je gewenste gen? c) Als je zou vertrekken met je probe twee codons verder dan je optimale vertrekplaats (zie a), hoeveel verschillende 17-meren zou je dan moeten maken? Oplossing: a) Start met het raadplegen van de genetische code om de degeneratie van elk AZ na te gaan. Dit geeft dan: Arg (6) – Leu (6) – Met (1) – Glu (2) – Trp (1) – Ile (3) – Cys (2) – Pro (4) – Met (1) – Leu (6) Een snelle inspectie maakt duidelijk dat de combinatie Met-Glu-Trp-Ile-Cys het beste resultaat geeft. b) Vermenigvuldig de degeneraties met elkaar om te weten te komen hoeveel verschillende combinaties je moet maken: voor de vijf gekozen AZ geeft dit: 1x2x1x3x2 = 12 36 Merk op dat je de eerste twee basen (CC) van proline kan gebruiken zonder degeneratieproblemen. Je probe kan dus 17 basen lang zijn ((5x3=15) + 2 = 17) c) Als je twee AZ verder naar rechts begint (bij Trp dus), krijg je hetvolgende resultaat: 1x3x2x4x1=24. In dit geval zou je 24 verschillende probes moeten maken in plaats van 12. 2.10 Toepassingen van recombinant DNA technologie Genetische manipulatie en biotechnologie zullen in de toekomst steeds belangrijker worden in de geneeskunde, de industrie, de landbouw en de research. 2.10.1 Site-directed mutagenese Ontwikkelingen in DNA-synthese-technieken hebben een grote invloed gehad op de studie van eiwitfuncties. Een van de toepassingen in deze context is “site-directed-mutagenese”. Dit is een techniek om als het ware “micro-chirurgie” op eiwitten uit te voeren. Men kan met behulp van deze techniek immers welbepaalde puntmutatie(s) aanbrengen in het gen en kijken welk effect deze mutatie heeft op eiwit-niveau. Men kan hiervoor gebruik maken van de M13faag als vector omdat deze een enkelstrengige DNA faag is. Het gen dat men wil muteren bouwt men in in deze vector en men laat dit hybridiseren met een synthetisch oligonucleotide met daarin de gewenste mutatie. Vervolgens voegt men DNA polymerase en dNTPs toe en de enkelstrengige vector wordt dubbelstrengig gemaakt. Men denatureert vervolgens het dsDNA en het resultaat zijn twee vectoren; één WT en één mutant. Men kan deze mutant dan in E.coli tot expressie laten brengen om te kijken wat het effect van de mutatie is op eiwitniveau. 37 Voorbeeld: onderzoek naar het belang van de fenol-groep voor de functie van een welbepaald eiwit. Hiervoor zal men een tyrosine moeten vervangen door een phenylalanine. Op DNA-niveau betekent dit een mutatie van TAC (tyr) naar TTC (phe). Meestal is het DNA gemethyleerd op 5’-GATC-3’ plaats. Dit is een herkenningsplaats voor het restrictie-enzym DpnI. Als er geen methylatie is, kan het enzym niet knippen. Het gen dat men wil wijzigen kloneert men eerst in een vector. Men denatureert vervolgens deze vector zodat het enkelstrengig DNA wordt. Men laat deze dan hybridiseren met gemuteerde primers (AAG en TTC). Vervolgens voert men een PCR uit, maar slechts enkele cycli om andere toevallige mutaties te vermijden die kunnen optreden tijdens PCR. Men zal ook gebruik maken van Pfupolymerase omdat dit zeer nauwkeurig werkt. Om het gemuteerde DNA dan op te zuiveren, zal men knippen met DpnI. Dit enzym zal enkel het WT DNA afbreken omdat het (gemuteerde) DNA aangemaakt in vitro (PCR) niet gemethyleerd is en dus ongevoelig voor restrictie door DpnI. Men kan dan E.coli transformeren met dit gemuteerde DNA en gaan kijken wat het effect is van de mutatie. 38 2.10.2 DNA-microarrays Een belangrijke toepassing van hybridasitietechnieken (werken met probes) zijn de DNA-microarrays of DNA-chips. Als een gen tot expressie komt, wordt het DNA omgezet in mRNA. Men kan de hoeveelheid mRNA in een cel bepalen met behulp van verschillende methoden: Northern blot of microarrays. Met behulp van DNA microarrays (gen-chips) kunnen wetenschappers de mate van expressie van verschillende genen tegelijk opvolgen. DNA-chips zijn vaste dragers (glas of silica) waarop ssDNA vastgehecht is volgens een welbepaald patroon. Elke spot DNA, of probe, vertegenwoordigt een gen. Men weet exact welke spot welk gen vertegenwoordigt. Er zijn verschillende manieren om DNA-chips te maken. De probes kunnen bijvoorbeeld een PCR-product zijn, een cDNA-fragment of een DNA-fragment. Het zijn in elk geval oligonucleotiden. Wanneer eukaryote organismen onderzocht worden, noemt men deze oligonucleotiden “expressed sequence tags” (ESTs) omdat ze afgeleid zijn van cDNA, een product van een geëxpresseerd gen. Men kan zelf chips op maat samenstellen door het kiezen van welbepaalde ESTs. Er bestaan ook “commerciële” chips of microarrays. Deze worden meestal gemaakt met behulp van een techniek die men “fotolithografie” noemt. Bij deze techniek wordt er een soort “maskers” (plaatjes met gaatjes op bepaalde plaatsen) op de chip gelegd en worden er met behulp van 39 lichtstralen oligonucleotiden opgebouwd. Men kan op deze manier chips ontwerpen met 1000den verschillende probes. Er zijn chips beschikbaar met probes voor alle genen van een heleboel microorganismen zoals E.coli (ongeveer 4200 ORFs), H.pylori (1590 ORFs), S.cerevisiae (6600 ORFs),… Genexpressie wordt opgevolgd door de hybridisatie van mRNA of cDNA (targets) met de probes op de chip. De targets worden fluorescent gelabeld en geïncubeerd onder optimale omstandigheden 40 zodat er een goeie hybridisatie kan ontstaan met de complementaire probes. Ongebonden target wordt daarna weggewassen en de chip wordt gescand met laserstralen. Als een spot fluoresceert, wil dit zeggen dat er complementair mRNA of cDNA op de probe gebonden is en na analyse van de kleur en de intensiteit van de fluorescerende spots, kan men achterhalen welke genen tot expressie gekomen zijn. Deze techniek kan men gebruiken bij het bepalen welke genen geëxpresseerd worden in een cel op een welbepaald ogenblik onder welbepaalde omstandigheden. Men kan bijvoorbeeld nagaan hoe de genexpressie verandert als antwoord op veranderingen in de omgeving. In dit geval kan men werken met twee verschillende fluorochromen. De pathogene bacterie H.pylori leeft in de maag waar ze maagzweren kan veroorzaken. Het is interessant om te weten welke genen deze bacterie expresseert of juist represseert onder zure omstandigheden. Om dit te achterhalen, isoleert men het mRNA uit een bacterie die opgekweekt werd in neutrale omstandigheden en labelt dit mRNAmet een groen fluorochroom. Dit groene mRNA dient als controle of referentie. mRNA dat men isoleert uit een bacterie uit een zure omgeving, zal men rood labelen. Het groene en het rode mRNA wordt gemengd en gebracht op dezelfde chip waar het eventueel kan hybridiseren. Nadat het ongebonden mRNA weggewassen is, wordt de chip gescand en geanalyseerd met behulp van de computer. Een gele spot wijst op gelijke binding van groen en rood mRNA, dus dit gen kent geen wijziging in expressie. Als een spot rood gekleurd is, werd er meer rood mRNA (uit de “zure bacterie”) gebonden en wijst dit dus op een verhoogde expressie van dat gen. Als de spot daarentegen groen kleurt, wordt het betreffende gen blijkbaar gerepresseerd (of onderdrukt) in zure omstandigheden. Nauwkeurige analyse van de beelden is vereist om de relatieve intensiteiten van de spots te vergelijken, want dit weerspiegelt de mate van expressie. Deze onderzoeken kunnen ook helpen bij het onderzoek naar de functie van een heel aantal nog onbekende genen. 41 2.10.3 Reporter genen In de moleculaire biologie worden reportergenen of kortweg reporters gebruikt om de expressie van bepaalde genen in cellen op te volgen. Het reportergen wordt gekoppeld aan de regulatorische sequentie (bv promotorsequentie) van een ander gen (het gen wiens expressie je wilt opvolgen). De reporter produceert een gemakkelijk detecteerbaar product zodat de onderzoeker het proces gemakkelijk kan opvolgen. Om een reportergen in een organisme te introduceren, moet men eerst een DNA-constructie of vector maken die de regulatorische sequentie van het te onderzoeken gen en het reportergen bevat. Deze vector brengt men dan in de cellen (bacteriën, dierlijke of plantaardige cellen,…). Het is natuurlijk belangrijk dat het reportergen van nature niet voorkomt in de gastheercellen. Zo kan je gemakkelijk detecteren of je cel wel degelijk het reportergen opgenomen heeft. De meeste reportergenen produceren fluorescerende of luminiscerende eiwitten zoals het luciferase-enzym of GFP (green fluorescent protein). Als men de activiteit van een promotor van een bepaald gen wil onderzoeken mbv een luciferaseassay, moet men altijd vergelijken met de expressie van een referentie gen (gen dat altijd tot expressie komt). In bacteriën maakt men vaak gebruik van het lacZ-reportersysteem (zie hoger). 2.10.3.1 Green fluorescent protein Dit eiwit, dat geïsoleerd werd uit een kwal, wordt gebruikt bij de visualisering van genexpressie en de localisatie van eiwitten in levende cellen. GFP wordt gecodeerd door een enkel gen dat eens het getransleerd is, een sterke groene fluorescentie geeft. Het kan gemakkelijk gekloond en geëxpresseerd worden in verschillende organismen. Site-directed mutagenese van het GFP-gen, heeft bovendien een heel gamma aan eiwitten opgeleverd, die fluoresceren doorheen het blauwgroen-gele spectrum. Een van de meest voorkomende toepassingen is het aanhechten van dit GFP aan bepaalde eiwitten waarvan men de intracellulaire localisatie wil kennen. Men kan de fluorescentie gemakkelijk zien met behulp van een lichtmicroscoop. Vroeger moest men een electronenmicroscoop gebruiken om eiwitten te visualiseren. Hiervoor moest men de cellen behandelen met verschillende solventen waardoor de cellulaire structuren beschadigd geraakten en artefacten gevormd werden. Als een eiwit vastgehecht wordt aan GFP, kan men de timing van de expressie en de localisatie van het eiwit opvolgen in de levende cel. Men kan deze vasthechting verkrijgen door het gen voor het eiwit genetisch te koppelen aan het GFP-gen. Het resultaat is een 42 chimeer eiwit dat bestaat uit twee delen: het te onderzoeken eiwit en het GFP. Men moet er natuurlijk wel op letten dat de functie van het eiwit niet verstoord wordt door het GFP dat eraan hangt. 2.10.4 Knock-outs Dit is een techniek om te achterhalen welke functie een bepaald gen heeft in een organisme. Men zal dus een bepaald gen verwijderen of ‘knock-out’ slaan en dan kijken wat het effect daarvan is in de cel of op het organisme. De meest gebruikte organismen zijn muizen. Men zal dus een bepaald gen ‘uitschakelen’ in de knock-out muis. Men vertrekt van het gekloneerde gen dat men KO wil. Dit gen wordt verstoord door de inbouw van een resistentiegen tegen neomycine. Men introduceert eveneens het thymidine kinase (tk) gen. Dit dient om achteraf te gaan selecteren. Vervolgens mengt men dit gemanipuleerd DNA met stamcellen van de bruine muis. In een klein percentage van de stamcellen, zal het verstoorde gen de kern bereiken en treedt er een stabiele recombinatie op met het intacte gen. Het KO-gen wordt dus ingebouwd in het DNA ter vervanging van het oorspronkelijke intacte gen. Het tk-gen wordt niet ingebouwd. In een groot deel van de stamcellen treedt er ofwel geen recombinatie op ofwel nonspecifieke recombinatie (dit wil zeggen dat het KO-gen elders in het DNA ingebouwd wordt, dus dat het intacte gen behouden blijft). Het is dan de bedoeling dat we enkel verder werken met de KO-stamcellen, dus de andere “mislukte” stamcellen moeten geëlimineerd worden. Dit kan men bereiken door de stamcellen over te brengen in een medium met G418: enkel cellen met het resistentie-gen tegen neomycine kunnen overleven, dus de cellen die geen recombinatie hebben ondergaan, sterven af. Om de cellen met non-specifieke recombinatie te elimineren, zal men gangcyclovir toedienen. Deze stof is giftig voor cellen met een tk-gen. Cellen die non-specifieke recombinatie hebben ondergaan zijn in het bezit van dit gen en sterven af. Enkel de cellen met een specifieke recombinatie (dus de KO-cellen) zullen overleven omdat zij 1) in het bezit zijn van het neomycine-resistentie—gen en 2) geen tk-gen bezitten. 43 Men zal het KO-gen nu introduceren in een muis. Dit doet men via infectie van gemanipuleerde stamcellen in een muizen-blastocyst van een zwarte muis. Een blastocyst is een zeer vroeg embryonaal stadium. Dit gemanipuleerde embryo brengt men 44 in een moedermuis die chimere muizen zal produceren. Dit zijn zwarte muizen met bruine vlekken. De bruine vlekken zijn afkomstig van de gemanipuleerde stamcellen. Dit is echter nog geen echte heterozygote muis! Hoe krijgen we nu echte heterozygote muizen in plaats van chimere muizen? Men zal een mannelijke chimere muis kruisen met een vrouwelijke zwarte muis. Aangezien het bruine allel dominant is over het zwarte, zullen sommige nakomelingen bruin zijn. De zwarte muizen negeert men, deze zijn afkomstig van WT-blastocystcellen. Men zal dan twee bruine muizen, die in het bezit zijn van het KO-gen (aangetoond via Southern Blotting) kruisen en hun nakomelingen checken op homozygoten voor het KO-gen. Deze homozygote KO-muizen kan men dan onderzoeken en nakijken of er fenotypische veranderingen zijn. 45 2.10.5 Medische toepassingen De productie van medisch interessante eiwitten zoals somatostatine, insuline, humaan groei hormoon en andere hormonen en interferonen zijn voorbeelden van praktische toepassingen van recombinant DNA technologie. Dit is zeer belangrijk want een groot deel van deze moleculen kon vroeger alleen bekomen worden van menselijke weefsels. Het humaan groei hormoon kon vroeger bijvoorbeeld enkel verkregen worden via autopsie en was dus maar zeer beperkt voorradig. Naast bacteriën worden ook planten en muizen genetisch gemanipuleerd om humane geneesmiddelen, antilichamen en vaccins te produceren. Genetische manipulatie levert niet enkel recombinante moleculen op, maar kan nog veel meer bijdragen aan de geneeskunde. Men kan mensen nu screenen voor mutante genen, dit kan belangrijk zijn in prenatale testen. Een ander steeds groeiend domein, is de gentherapie. Met behulp van gentherapie probeert men slecht functionerende of mutante genen te vervangen door ‘goede’ of WT-genen. Meestal gebruikt men virussen om het gewenste gen in de cel binnen te brengen. Dit brengt natuurlijk een hoop risico’s met zich mee. Er bestaat dan ook een behoorlijke controverse rondom gentherapie. Dit is zeker zo als men gentherapie toepast op embryonale cellen of stamcellen. Als men gameten of bevruchte eicellen genetisch manipuleert, worden de veranderingen ook doorgegeven aan de volgende generaties. Men zou op die manier ‘designer baby’s’ kunnen creëren. Aan de andere kant biedt het de enige kans op overleven voor een aantal zeer ernstige erfelijke ziektes, zoals de ziekte van Tay Sach; een neurodegeneratieve ziekte met 100% mortaliteit tegen de leeftijd van 5 jaar. Dus ondanks de ethische dillema’s, blijven veel wetenschappers toch nog verder onderzoek doen naar gentherapie. In het volgende hoofdstuk gaan we dieper in op gentherapie. 46