Replicación del ADN (CORTO SEMANA 11) PDF

CORTO SEMANA 11 REPLICACIÓN DEL ADN: Cada molécula de ADN que forma un cromosoma lineal debe de contener un centrómero, dos telómeros y un origen de replicación. Para formar un cromosoma funcional una molécula de ADN debe ser capaz de replicarse, y las copias deben separarse y repartirse...

CORTO SEMANA 11 REPLICACIÓN DEL ADN: Cada molécula de ADN que forma un cromosoma lineal debe de contener un centrómero, dos telómeros y un origen de replicación. Para formar un cromosoma funcional una molécula de ADN debe ser capaz de replicarse, y las copias deben separarse y repartirse de forma fiable en CÉLULAS HIJAS: CICLO CELULAR Para que un cromosoma sea funcional y pueda ser transmitido a las células hijas en la división celular, se requieren tres elementos clave en su ADN: 1. Orígenes de replicación: Son secuencias específicas donde comienza la duplicación del ADN. Los cromosomas eucariotas tienen múltiples orígenes de replicación para asegurarse de que toda la molécula de ADN pueda replicarse de manera rápida y eficiente. 2. Centrómeros: Son regiones especializadas del ADN que permiten que los cromosomas duplicados se separen correctamente durante la mitosis. Una vez replicado el ADN, las dos copias (llamadas cromátidas hermanas) permanecen unidas en el centrómero. Durante la mitosis, se forma un complejo proteico llamado cinetocoro en el centrómero, el cual se une al huso mitótico, una estructura que facilita la separación de las cromátidas hacia las células hijas. 3. Telómeros: Son secuencias repetitivas de ADN ubicadas en los extremos de los cromosomas. Tienen dos funciones importantes: primero, ayudan a que los extremos del cromosoma se repliquen completamente, y segundo, protegen al cromosoma para que la célula no los confunda con ADN dañado que necesite ser reparado. La relación entre la duplicación de los cromosomas y el ciclo celular, que incluye fases en las que los cromosomas se replican (interfase) y se separan (mitosis), asegurando que cada célula hija reciba una copia exacta de cada cromosoma. Un complejo de proteínas lectoras y escritoras puede propagar modificaciones de la cromatina a lo largo de un cromosoma La cromatina es el material compuesto por ADN y proteínas (principalmente histonas) que forma los cromosomas. Las histonas pueden ser modificadas por enzimas, lo que puede influir en cómo se empaqueta el ADN y, por lo tanto, en su accesibilidad para la transcripción genética. Estas modificaciones incluyen la metilación, acetilación y fosforilación, entre otras, y afectan directamente si una región del ADN está activa (accesible para la transcripción) o inactiva (condensada y no transcribible). ¿Cómo se propagan estas modificaciones? 1. Complejos multiproteicos de lectores y escritores: Los escritores son enzimas que añaden modificaciones a las histonas. Estas enzimas pueden ser llevadas a una región específica del ADN por proteínas de unión al ADN que reconocen secuencias específicas (como reguladores de la transcripción). Cuando un escritor añade una marca a una histona en un nucleosoma (unidad de la cromatina compuesta por ADN y proteínas), un lector dentro del mismo complejo proteico reconoce esa modificación. El  lector entonces se une a la histona modificada y activa al escritor para que añada la misma modificación al siguiente nucleosoma, y así sucesivamente. Este proceso de "lectura-escritura" se repite, permitiendo que las modificaciones se extiendan a lo largo del ADN. 2. Reacción en cadena: La propagación de estas marcas es como una reacción en cadena. El lector reconoce una modificación y activa al escritor para que modifique la siguiente histona, y así se extiende a través de grandes regiones del ADN. De esta manera, una modificación localizada en una parte pequeña del cromosoma puede expandirse a lo largo de una sección mucho más grande. 3. Remodelación de la cromatina: Los complejos de lector-escritor a menudo trabajan junto con proteínas remodeladoras de la cromatina que dependen de ATP. Estas remodeladoras pueden alterar la estructura de la cromatina, condensándola o relajándola. Si la cromatina se condensa, la transcripción de genes en esa región puede ser silenciada; si se relaja, los genes pueden activarse. 4. Eliminación de modificaciones: Así como los escritores añaden modificaciones, también existen borradores (como desmetilasas o desacetilasas) que eliminan estas marcas. Estos borradores también pueden ser reclutados por proteínas de unión al ADN, dirigiendo la eliminación de modificaciones en regiones específicas del cromosoma. 5. Implicaciones genéticas: Los estudios en organismos como la Drosophila (mosca de la fruta) han mostrado la importancia de estos procesos en la regulación de la cromatina. Se han identificado más de 100 genes que influyen en la propagación y estabilidad de la heterocromatina (forma condensada de la cromatina), muchos de los cuales codifican para subunidades de complejos de lector-escritor-remodelador. Los escritores añaden marcas a las histonas. Los lectores reconocen estas marcas y las extienden a nucleosomas vecinos. Los remodeladores de cromatina pueden condensar o relajar la estructura de la cromatina, influyendo en la activación o silenciamiento de los genes. También existen borradores que eliminan estas marcas. Este mecanismo es esencial para el control epigenético y la regulación génica, ya que afecta cómo se expresa el ADN en diferentes partes del genoma. El emparejamiento de bases es la base de la replicación y reparación del ADN El emparejamiento de bases es fundamental para la replicación y reparación del ADN, procesos clave en la preservación de la integridad genética. Replicación del ADN: 1. Plantillas de ADN: La replicación del ADN comienza con la separación de la doble hélice en dos hebras individuales que sirven como plantillas para la creación de nuevas hebras de ADN complementarias. Esto significa que cada hebra de la doble hélice actúa como un molde para la síntesis de una hebra nueva. 2. Emparejamiento de bases: A medida que las hebras de ADN se separan, las bases de nucleótidos expuestas (A, T, G, C) están listas para emparejarse con nucleótidos libres complementarios. Estos nucleótidos entrantes forman enlaces de hidrógeno con las bases expuestas de la hebra molde. Por  ejemplo, la adenina (A) siempre se empareja con la timina (T), y la guanina (G) siempre se empareja con la citosina (C). Este emparejamiento específico asegura que la nueva hebra que se sintetiza sea una copia exacta de la hebra original complementaria. 3. Polimerización: La ADN polimerasa, una enzima descubierta en 1957, es la encargada de agregar los nucleótidos a la cadena de ADN en crecimiento. Los nucleótidos que utiliza como sustrato son desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTPs), que son versiones activadas de los nucleótidos. La polimerasa cataliza la reacción de incorporación de estos nucleótidos en la nueva cadena de ADN, siguiendo la secuencia dictada por la hebra molde. 4. Proceso paso a paso: El mecanismo de replicación del ADN sigue una serie de pasos bien definidos, en los que la ADN polimerasa une cada nucleótido complementario al extremo 3' de la nueva cadena de ADN en crecimiento, a medida que avanza a lo largo de la hebra molde. Reparación del ADN: ○ El emparejamiento de bases también es crucial en la reparación del ADN. Cuando ocurre un daño en una hebra de ADN (debido a factores como radiación o errores de replicación), los mecanismos de reparación utilizan la hebra intacta como molde para corregir la hebra dañada. Al igual que en la replicación, las bases complementarias guían el proceso de reparación al emparejar los nucleótidos correctos en las posiciones dañadas. La replicación del ADN depende del emparejamiento de bases entre las hebras de ADN existentes y los nucleótidos libres, permitiendo la síntesis de una copia complementaria. El ADN polimerasa es la enzima clave que cataliza la adición de nucleótidos complementarios durante la replicación. Este mismo principio de emparejamiento de bases es esencial para la reparación del ADN, asegurando que las mutaciones o daños en el ADN se corrijan de manera precisa. La horquilla de replicación del ADN es asimétrica La replicación del ADN es un proceso asimétrico en el que las dos hebras de la doble hélice se copian de manera diferente debido a la naturaleza antiparalela de las hebras de ADN y la dirección en la que trabaja la ADN polimerasa. Replicación semiconservativa: ○ Durante la replicación del ADN, cada una de las dos hebras originales sirve como plantilla para la síntesis de una nueva hebra complementaria. Esto resulta en dos moléculas de ADN hijas, cada una compuesta por una hebra original y una nueva. Este proceso es conocido como replicación semiconservativa. La horquilla de replicación: ○ La replicación ocurre en una región del ADN conocida como la horquilla de replicación, que tiene una forma en Y y se mueve progresivamente a lo largo de la doble hélice de ADN parental. Aquí, un complejo multienzimático que incluye a la ADN polimerasa sintetiza las dos nuevas hebras de ADN hijas. La asimetría de la horquilla:  El ADN es antiparalelo, lo que significa que las dos hebras corren en direcciones opuestas: una en dirección 5'-3' y la otra en dirección 3'-5'. Sin embargo, la ADN polimerasa solo puede sintetizar ADN en la dirección 5'-3'. Esto plantea un problema para la replicación de la hebra que corre en dirección 3'-5'. Hebra adelantada y hebra rezagada: Hebra adelantada: La hebra líder o adelantada es la que se sintetiza de manera continua en la dirección 5'-3', siguiendo el movimiento de la horquilla de replicación. Hebra rezagada: La hebra rezagada no puede ser sintetizada de manera continua en la dirección 3'-5'. En su lugar, se sintetiza de manera discontinua en pequeños fragmentos llamados fragmentos de Okazaki (descubiertos en experimentos con bacterias). Estos fragmentos se sintetizan en dirección 5'-3', pero en segmentos cortos que luego se unen para formar una hebra continua. Fragmentos de Okazaki: ○ Los fragmentos de Okazaki son segmentos cortos de ADN que se sintetizan en la hebra rezagada. En bacterias, estos fragmentos tienen una longitud de 1000-2000 nucleótidos, mientras que en eucariotas son más cortos (100-200 nucleótidos). Una vez sintetizados, los fragmentos se unen para formar una hebra continua. Mecanismo de "backstitching": ○ La síntesis de la hebra rezagada ocurre mediante un mecanismo conocido como backstitching (puntada hacia atrás), en el que los fragmentos de Okazaki se producen en la dirección 5'-3', pero en sentido opuesto al crecimiento general de la hebra. Este mecanismo permite que la replicación del ADN dependa únicamente del ADN polimerasa que sintetiza en la dirección 5'-3', evitando la necesidad de una enzima diferente para la hebra rezagada. El ADN se replica de manera asimétrica debido a la dirección antiparalela de sus hebras. La hebra adelantada se sintetiza de forma continua en dirección 5'-3'. La hebra rezagada se sintetiza de forma discontinua en fragmentos de Okazaki. Ambos procesos son coordinados por un complejo enzimático que asegura que la replicación sea eficiente y precisa. Sólo la replicación del ADN en el sentido 5ʹ-a-3ʹ permite una corrección eficaz de los errores corrección de errores La replicación del ADN ocurre únicamente en la dirección 5'-3', lo que permite una corrección de errores eficiente durante el proceso de replicación. Direcciones de replicación del ADN: La ADN polimerasa, la enzima responsable de agregar nucleótidos durante la replicación, siempre agrega nucleótidos en la dirección 5'-3'. Esto significa que el extremo libre donde se añaden los nucleótidos es el extremo 3' de la cadena de ADN en crecimiento. ¿Por qué no se puede replicar en dirección 3'-5'?  Si la ADN polimerasa añadiera nucleótidos en la dirección 3'-5', se producirían serios problemas en la corrección de errores. En este caso, la cadena de ADN en crecimiento tendría un extremo 5' libre, que necesitaría proporcionar el trifosfato (el grupo fosfato activador) necesario para la reacción de enlace covalente al siguiente nucleótido. Problema de la replicación en 3'-5': Si hubiera un error en la adición de un nucleótido, la hidrolización del nucleótido incorrecto no sería posible de manera eficiente. Esto se debe a que el extremo 5' de la cadena no tendría el trifosfato necesario para continuar la replicación. Si se elimina un nucleótido incorrecto, la síntesis de ADN se detendría inmediatamente porque el extremo 5' recién expuesto no podría soportar la adición de otro nucleótido. Esto haría imposible corregir los errores de manera eficiente. Corrección de errores en la dirección 5'-3': Cuando la ADN polimerasa agrega nucleótidos en la dirección 5'-3', el extremo 3' de la cadena en crecimiento es el que recibe los nuevos nucleótidos, cada uno de los cuales trae su propio trifosfato activador. Si se comete un error (por ejemplo, si se incorpora un nucleótido incorrecto), la enzima puede hidrolizar el nucleótido erróneo en el extremo 3', eliminarlo y luego agregar el nucleótido correcto sin detener la síntesis de ADN. Este proceso es llamado prueba de lectura exonucleolítica. Mecanismo de backstitching y la dirección 5'-3': Aunque el mecanismo de replicación discontinua (con fragmentos de Okazaki) en la hebra rezagada puede parecer complicado, sigue manteniendo la dirección de síntesis 5'-3', lo que es crucial para asegurar que la corrección de errores funcione correctamente. Reparación de desajustes: A pesar de los mecanismos de corrección de errores de la ADN polimerasa, todavía ocurren errores ocasionalmente. Sin embargo, las células tienen una segunda oportunidad para corregir errores mediante un proceso conocido como reparación de desajustes dirigida por hebras, que se discute más adelante en el texto. La replicación en la dirección 5'-3' es esencial para una corrección de errores eficiente. Si la replicación ocurriera en la dirección 3'-5', la corrección de errores no sería posible sin detener la replicación. La prueba de lectura exonucleolítica permite eliminar nucleótidos incorrectos y continuar la replicación de manera precisa. Las células tienen mecanismos adicionales, como la reparación de desajustes, para corregir errores que puedan pasar desapercibidos durante la replicación. Una enzima especial polimerizadora de nucleótidos sintetiza moléculas de cebador de ARN en la cadena rezagada Diferencias entre la hebra líder y la hebra rezagada: Hebra líder: La síntesis de ADN en esta hebra es continua porque la ADN polimerasa puede agregar nucleótidos sin detenerse a lo largo de la hebra molde en la dirección 5’-3’. Solo se necesita un cebador de ARN al inicio. Hebra rezagada: La síntesis de esta hebra es discontinua debido a que la polimerasa solo puede agregar nucleótidos en dirección 5’-3’. A medida que la horquilla de replicación avanza, se necesitan múltiples cebadores de ARN para iniciar la síntesis de nuevos fragmentos cortos de ADN (fragmentos de Okazaki). Síntesis de cebadores de ARN: Para que la ADN polimerasa comience a sintetizar un nuevo fragmento de Okazaki, necesita un extremo 3’-OH libre al que añadir nucleótidos. Este extremo es proporcionado por un cebador (primer) de ARN que es sintetizado por la ADN primasa. ADN primasa: Es una enzima que sintetiza los cebadores de ARN cortos, generalmente de unos 10 nucleótidos en eucariotas, utilizando ribonucleótidos en lugar de desoxirribonucleótidos. Estos cebadores se crean cada 100-200 nucleótidos a lo largo de la hebra rezagada. ADN-ARN híbrido: El cebador de ARN es capaz de formar pares de bases con la hebra molde de ADN, creando un doble hélice híbrida de ADN-ARN. Función del cebador (primer) de ARN: El cebador de ARN proporciona el extremo 3’-OH necesario para que la ADN polimerasa pueda elongar la cadena de ADN y sintetizar el siguiente fragmento de Okazaki. Cuando la polimerasa alcanza el extremo 5' de un fragmento previo, choca con el cebador (primer) de ARN de ese fragmento, deteniendo la síntesis. Eliminación del cebador de ARN: Para convertir los múltiples fragmentos de Okazaki en una cadena de ADN continua, se activa un sistema de reparación del ADN que elimina el cebador de ARN y lo reemplaza por ADN. Finalmente, una enzima llamada ADN ligasa une el extremo 3' del nuevo fragmento de ADN con el extremo 5' del fragmento previo. ¿Por qué ARN y no ADN como cebador? Menor precisión de la primasa: La primasa no es tan precisa como la ADN polimerasa, lo que significa que el cebador de ARN puede contener errores. Marcado para ser eliminado: Al usar ribonucleótidos (ARN) en lugar de desoxirribonucleótidos (ADN), estos fragmentos se "marcan" automáticamente como copias inexactas o "sospechosas" que deben ser eliminadas y reemplazadas. Si se  utilizara ADN como cebador y se cometieran errores, estos podrían pasar desapercibidos y aumentar significativamente la tasa de mutación. En la hebra rezagada, la síntesis de ADN requiere cebadores de ARN producidos por la ADN primasa. Estos cebadores son esenciales para que la ADN polimerasa pueda comenzar a sintetizar fragmentos de Okazaki. Los cebadores de ARN se eliminan y reemplazan por ADN, y la ADN ligasa une los fragmentos para formar una hebra continua. El uso de ARN como cebador facilita la corrección de errores al marcar estos fragmentos para su posterior eliminación, evitando que errores en la replicación pasen inadvertidos. Unas proteínas especiales ayudan a abrir la doble hélice del ADN delante de la horquilla de replicación de la horquilla de replicación Durante la replicación del ADN, la doble hélice debe abrirse para que las nuevas cadenas de ADN puedan ser sintetizadas utilizando las hebras originales como molde. Sin embargo, el ADN es muy estable y las dos hebras están fuertemente unidas por enlaces de hidrógeno, lo que hace que separarlas requiera mucha energía. Para superar este obstáculo, dos tipos de proteínas especializadas, las helicasas y las proteínas de unión a ADN monocatenario (SSB), juegan un papel clave. Función de las helicasas: Las helicasas son proteínas que se desplazan a lo largo de una hebra de ADN utilizando energía obtenida de la hidrolisis de ATP. A medida que avanzan, rompen los enlaces de hidrógeno entre las dos hebras de ADN, separándolas y "abriendo" la doble hélice en la horquilla de replicación. Pueden moverse en direcciones 5'-3' o 3'-5', dependiendo de la hebra sobre la que actúen. En los sistemas de replicación bacteriana, la helicasa que se mueve en dirección 5'-3' a lo largo de la hebra rezagada es la que tiene el papel más importante. La velocidad a la que las helicasas desenrollan la doble hélice es impresionante, llegando a 1000 pares de nucleótidos por segundo. Función de las proteínas SSB (proteínas de unión a ADN monocatenario): Después de que las helicasas separan las dos hebras de ADN, las proteínas SSB se unen de manera cooperativa a las hebras simples de ADN para evitar que se vuelvan a unir o que se formen estructuras secundarias, como los bucles de horquilla (o "hairpin loops"). Estos bucles podrían dificultar el proceso de replicación al obstaculizar el avance de la ADN polimerasa. Las SSB no cubren las bases nitrogenadas del ADN, lo que permite que sigan siendo accesibles como molde para que la ADN polimerasa pueda agregar nucleótidos.  Importancia del trabajo conjunto de helicasas y SSB: Helicasas: Separan las dos hebras de ADN, creando el espacio necesario para que las nuevas cadenas de ADN puedan ser sintetizadas. SSB: Mantienen las hebras simples de ADN en una conformación estable y accesible, evitando que se formen estructuras que impidan la replicación eficiente. El proceso de apertura de la doble hélice del ADN en la horquilla de replicación es esencial para la replicación del ADN. Las helicasas descomponen los enlaces entre las hebras y las proteínas SSB estabilizan las hebras individuales, permitiendo que la replicación avance sin interrupciones. Este trabajo conjunto asegura que las hebras simples de ADN estén disponibles como plantillas para la síntesis de nuevas cadenas. Las proteínas de una horquilla de replicación cooperan para formar una máquina de replicación En el proceso de replicación del ADN, las proteínas no actúan de manera aislada, sino que forman un complejo multienzimático organizado, conocido como la máquina de replicación. Este conjunto de proteínas trabaja de manera altamente coordinada para asegurar que la replicación del ADN sea rápida y eficiente. Función de la máquina de replicación: Estructura del complejo: El complejo de replicación puede ser comparado con una pequeña máquina de coser, donde las proteínas trabajan de manera conjunta y no individual. En lugar de moverse a lo largo del ADN, la máquina de replicación permanece estacionaria mientras el ADN se "hila" a través de ella, lo que asegura una replicación continua y eficaz. Componentes principales: ○ Helicasa: Está ubicada al frente de la horquilla de replicación, abriendo la doble hélice del ADN para permitir el acceso de las otras proteínas. ○ ADN polimerasa: Dos moléculas de ADN polimerasa trabajan simultáneamente en la horquilla, una en la hebra líder (que se sintetiza de manera continua) y otra en la hebra rezagada (que se sintetiza de manera discontinua a través de fragmentos de Okazaki). ○ Primasa: En la hebra rezagada, una primasa produce pequeños fragmentos de ARN que actúan como cebadores (primers) para que la ADN polimerasa pueda comenzar a sintetizar nuevos fragmentos de ADN. Coordinación en la síntesis: Hebra líder: La ADN polimerasa en la hebra líder trabaja de manera continua, agregando nucleótidos sin interrupciones. Hebra rezagada: En la hebra rezagada, la ADN polimerasa debe trabajar de manera discontinua, sintetizando pequeños fragmentos de ADN llamados fragmentos de Okazaki. Estos fragmentos requieren que la hebra rezagada se "pliegue" sobre sí misma para que la polimerasa pueda trabajar de forma coordinada con la síntesis en la hebra líder.  Cierre de fragmentos: Después de la síntesis de los fragmentos de Okazaki, la máquina de replicación deja detrás fragmentos sin unir y con cebadores de ARN en sus extremos 5'. Este ARN debe ser removido y reemplazado por ADN, un proceso realizado por enzimas de reparación de ADN que actúan después de la horquilla de replicación, sellando finalmente los fragmentos. Importancia del complejo: Este diseño asegura que la replicación ocurra de manera rápida y eficiente en ambas hebras de ADN. La coordinación y la proximidad de las distintas proteínas dentro de la máquina de replicación facilitan el proceso, evitando errores y maximizando la velocidad de replicación. Además, el mecanismo de carga de la abrazadera asegura que la ADN polimerasa se mantenga en su lugar, aumentando la eficiencia en la síntesis de ADN en la hebra rezagada. Los cromosomas bacterianos suelen tener un único origen de ADN Replicación En las bacterias, como E. coli, los cromosomas suelen tener un único origen de replicación donde comienza el proceso de duplicación del ADN. Este origen de replicación es una secuencia específica en el ADN bacteriano donde las proteínas necesarias para la replicación se ensamblan para iniciar la duplicación. Características de la replicación en E. coli: Cromosoma circular: El ADN de E. coli es una molécula circular compuesta por unos 4.6 millones de pares de nucleótidos. Esto significa que, a diferencia de los organismos con ADN lineal (como los eucariotas), la replicación en bacterias es continua a lo largo de una sola molécula de ADN circular. Origen único de replicación: Inicio en un solo punto: La replicación del ADN comienza en un único origen de replicación en el cromosoma bacteriano. Desde allí, se forman dos horquillas de replicación que se mueven en direcciones opuestas, avanzando alrededor del cromosoma hasta encontrarse en el lado opuesto. Velocidad y control del proceso: Velocidad de replicación: Las horquillas de replicación avanzan a una velocidad de 1000 nucleótidos por segundo en E. coli, lo que asegura que el proceso de replicación ocurra de manera eficiente. Control de la replicación: La única forma de controlar el proceso de replicación en E. coli es en la iniciación. Una vez que las horquillas de replicación se han ensamblado en el origen, la replicación progresa a una velocidad constante hasta que se completa. Por ello, la iniciación de la replicación está altamente regulada para asegurar que solo ocurra cuando las condiciones sean favorables.  Proceso de iniciación: 1. Proteínas iniciadoras: El proceso comienza cuando proteínas iniciadoras (en su forma unida a ATP) se unen en múltiples copias a secuencias específicas en el origen de replicación. Estas proteínas forman un complejo proteína-ADN que envuelve al ADN y desestabiliza la doble hélice, comenzando a separarla. 2. Helicasas y cargadores: El complejo atrae dos helicasas, cada una unida a una cargadora de helicasa. Estas helicasas se colocan en las hebras simples de ADN expuestas y se activan para desenrollar la doble hélice. 3. Primasa: Una vez que las helicasas están en su lugar, comienzan a desenrollar el ADN, exponiendo suficiente ADN de cadena simple para que la primasa sintetice los primeros cebadores de ARN. 4. Formación de las horquillas de replicación: Después de que los cebadores se han formado, se ensamblan las proteínas restantes del complejo de replicación, formando dos horquillas de replicación que se mueven en direcciones opuestas desde el origen y continúan replicando el ADN hasta que toda la molécula ha sido copiada. Regulación de la iniciación: Control del inicio: En E. coli, la iniciación de la replicación solo ocurre cuando hay suficientes nutrientes disponibles para que la bacteria complete una ronda de replicación. Esto asegura que la replicación solo se inicie en condiciones óptimas. Periodo refractario: Después de que la replicación ha comenzado, el origen de replicación entra en un periodo refractario, donde no puede volver a iniciar la replicación inmediatamente. Esto se debe a que las adeninas (A) en el origen de replicación recién replicado no están metiladas. La replicación no puede reiniciarse hasta que estas adeninas sean metiladas y las proteínas iniciadoras se reactiven. Los cromosomas eucarióticos contienen múltiples orígenes de replicación A diferencia de las bacterias, cuyos cromosomas circulares contienen un único origen de replicación, los cromosomas eucariotas, debido a su gran tamaño, requieren múltiples orígenes de replicación para completar el proceso de duplicación de ADN de manera eficiente y en un tiempo razonable. Replicación en cromosomas eucariotas: 1. Orígenes múltiples: Los cromosomas eucariotas contienen muchos orígenes de replicación, de manera que varias burbujas de replicación se forman simultáneamente a lo largo de los cromosomas. A medida que las horquillas de replicación avanzan desde estos orígenes, eventualmente se encuentran con otras horquillas, lo que asegura que todo el ADN del cromosoma sea replicado en paralelo. 2. Tamaño y complejidad: ○ Los cromosomas eucariotas son mucho más grandes que los cromosomas bacterianos. Por ejemplo, un cromosoma humano promedio tiene aproximadamente 150 millones de pares de nucleótidos.  ○ Si solo hubiera un origen de replicación en estos grandes cromosomas y la horquilla de replicación se moviera a la velocidad observada en eucariotas (aproximadamente 50 nucleótidos por segundo), tardaría unos 35 días en completarse la replicación. Esto sería ineficiente, por lo que los múltiples orígenes permiten la replicación simultánea en muchos puntos del cromosoma, lo que reduce el tiempo total a unas pocas horas. 3. Velocidad de replicación: ○ En eucariotas, la velocidad de las horquillas de replicación es aproximadamente 20 veces más lenta que en bacterias, lo que puede atribuirse a la estructura del ADN empaquetado en cromatina (ADN enrollado alrededor de proteínas llamadas histonas), lo que hace que el proceso sea más complejo y lento. ○ Las horquillas avanzan a aproximadamente 50 nucleótidos por segundo, comparado con los 1000 nucleótidos por segundo que se replican en bacterias. 4. Seguimiento del proceso: ○ En la década de 1960, se desarrolló una técnica llamada autorradiografía para estudiar el patrón de replicación de los cromosomas eucariotas. Esta técnica permite observar las burbujas de replicación mediante el uso de 3H-timidina radiactiva, que se incorpora al ADN recién sintetizado, y luego se detecta visualmente como granos de plata que indican las regiones replicadas. ○ Hoy en día, se usan métodos más avanzados como los microarreglos de ADN (microarrays), que permiten un seguimiento preciso de la replicación a nivel del genoma completo. Esto permite identificar los orígenes activos de replicación en distintas células. 5. Regulación y redundancia de los orígenes: ○ Cada vez que una célula humana se divide, se activan entre 30,000 y 50,000 orígenes de replicación. ○ El genoma humano posee un número aún mayor de orígenes potenciales (alrededor de diez veces más), lo que proporciona redundancia en caso de que un origen primario falle. Esta flexibilidad también permite a la célula coordinar la replicación del ADN con otras actividades celulares, como la expresión génica. ○ Las horquillas de replicación se mueven en pares y forman una burbuja de replicación, moviéndose en direcciones opuestas desde un punto de origen común. Las horquillas se detienen cuando chocan con otra horquilla o cuando llegan al extremo de un cromosoma, completando así el proceso de replicación. Los cromosomas eucariotas utilizan múltiples orígenes de replicación para facilitar la duplicación de grandes cantidades de ADN de manera rápida y coordinada, permitiendo la división celular eficiente. Un gran complejo multisubunidad se une a los orígenes eucarióticos de la replicación En los eucariotas, el proceso de replicación del ADN es más complejo que en las bacterias, debido a la gran cantidad de orígenes de replicación que se activan en distintos momentos de la fase S del ciclo celular. Estos orígenes son regulados  cuidadosamente para garantizar que el ADN se duplique una sola vez por ciclo celular. Complejo ORC (Origin Recognition Complex) y los orígenes de replicación: 1. Identificación de los orígenes de replicación : ○ En bacterias, los orígenes de replicación están bien definidos como secuencias específicas de ADN que atraen a las proteínas iniciadoras, las cuales ensamblan la maquinaria de replicación. ○ En eucariotas, aunque los orígenes de replicación no son tan uniformes, sí se ha logrado identificar estos orígenes en organismos como la levadura de gemación ( S. cerevisiae ). En este organismo, se conocen las ubicaciones exactas de los orígenes de replicación en todos sus cromosomas. ○ Por ejemplo, el cromosoma III de S. cerevisiae , que es relativamente pequeño, tiene orígenes espaciados aproximadamente 30.000 pares de nucleótidos entre sí, y solo un subconjunto de estos orígenes se utiliza en cada célula. A pesar de esto, el cromosoma se puede replicar en solo 15 minutos. 2. Secuencias esenciales para la replicación en S. cerevisiae : ○ Para que una secuencia de ADN funcione como un origen de replicación en levaduras, debe contener: 1. Sitio de unión para el complejo de reconocimiento de origen (ORC) , una proteína de múltiples subunidades que se une al ADN y marca el origen. 2. Región rica en adeninas (A) y timinas (T) , lo que facilita la apertura de la doble hélice de ADN, ya que los enlaces entre A y T son más fáciles de romper. 3. Sitio de unión para otras proteínas , que ayudan a ORC ajustando la estructura de la cromatina para que la replicación pueda comenzar. Problema de regulación en eucariotas: Una de las mayores dificultades para los eucariotas es regular los Múltiples puntos de inicio de la replicación. Dado que cada cromosoma tiene muchos orígenes, ¿cómo asegurar que todo el ADN se copie una sola vez en cada ciclo celular? 3. Solución: Carga y activación secuencial de la helicasa replicativa : ○ La clave para la regulación de este proceso es que la helicasa replicativa , que desenrolla la doble hélice de ADN, se carga y se activa en momentos distintos del ciclo celular: Durante la fase G1 , cuando la célula se prepara para la replicación, la helicasa se carga en el ADN junto al complejo ORC, formando un complejo prerreplicativo. Este complejo está listo, pero aún no se ha activado. Al pasar de G1 a la fase S (fase de replicación), unas enzimas llamadas quinasas activan las helicasas. Esto provoca la apertura de  la doble hélice y el reclutamiento de otras proteínas de la replicación, como las ADN polimerasas. 4. Prevención de duplicación múltiple : ○ Las quinasas no solo activan las helicasas, sino que también impiden que se formen nuevos complejos prerreplicativos al fosforilar el complejo ORC , lo que lo inhabilita para aceptar nuevas helicasas. ○ Este mecanismo asegura que los orígenes de replicación solo se activan una vez durante el ciclo celular. La fosforilación del ORC se revierte en la fase M (mitosis), lo que restablece el ciclo para la siguiente ronda de replicación. En eucariotas, la replicación del ADN está cuidadosamente regulada por el complejo ORC, que se uno a los orígenes de replicación y coordina la carga y activación de las helicasas en momentos específicos del ciclo celular. La replicación se inicia solo en la fase S, y la regulación de la fosforilación de ORC previene que los orígenes de replicación se activen más de una vez por ciclo, garantizando la correcta duplicación del ADN. Nuevos nucleosomas se ensamblan detrás de la horquilla de replicación Durante la replicación del ADN en eucariotas, no solo se copia el ADN, sino que también se deben ensamblar nuevamente las proteínas que forman los nucleosomas, las unidades básicas de la cromatina. La cromatina está compuesta de ADN y proteínas, principalmente histonas. Este proceso es clave para mantener la estructura del ADN dentro del núcleo. Ensamblaje de nuevos nucleosomas: 1. Síntesis de histonas: ○ Las histonas son proteínas que empaquetan el ADN para formar los nucleosomas. Debido a la cantidad de ADN que se replica durante la fase S del ciclo celular, la célula también necesita una cantidad proporcional de nuevas histonas. ○ Para cumplir con esta demanda, los organismos eucariotas tienen múltiples copias de los genes de histonas. En las células de vertebrados, hay alrededor de 20 conjuntos de genes que codifican las cinco histonas principales (H1, H2A, H2B, H3 y H4). ○ La producción de histonas está altamente regulada: se sintetizan principalmente durante la fase S, cuando los niveles de ARNm de histonas aumentan unas 50 veces. Esto se debe tanto al aumento en la transcripción de estos genes como a la disminución en la degradación de sus ARNm. 2. Transporte de histonas durante la replicación: ○ A medida que la horquilla de replicación avanza a lo largo del ADN, esta debe atravesar la cromatina, que está formada por nucleosomas. Los complejos de remodelación de cromatina ayudan a desestabilizar la interacción entre el ADN y las histonas para permitir que la horquilla avance, incluso a través de áreas de cromatina altamente condensada. ○ Histonas antiguas y nuevas: cuando una horquilla de replicación pasa por un nucleosoma, este se descompone en subunidades más pequeñas:  1. El octámero de histonas (el núcleo del nucleosoma) se divide en un tetrámero de H3-H4 y dos dímeros de H2A-H2B. 2. El tetrámero H3-H4 permanece unido de manera débil al ADN y se distribuye al azar entre las dos hebras hijas del ADN. 3. Los dímeros H2A-H2B, por su parte, se liberan completamente del ADN, y luego se añaden dímeros nuevos y antiguos a las hebras de ADN recién replicadas. 3. Histonas chaperonas y ensamblaje de nucleosomas: ○ La reconstitución de nucleosomas detrás de la horquilla de replicación se realiza de forma ordenada. Este proceso involucra proteínas llamadas chaperonas de histonas (o factores de ensamblaje de cromatina). ○ Estas chaperonas son complejos que se encargan de: 1. Unir las histonas (que son altamente básicas debido a su carga positiva) y evitar que se unan al ADN de forma inadecuada. 2. Liberar las histonas solo en el contexto adecuado, es decir, sobre el ADN recién replicado. ○ Las chaperonas de histonas interactúan con una abrazadera deslizante de eucariotas llamada PCNA (Antígeno Nuclear de Proliferación Celular), que permanece asociada con el ADN después de que la horquilla de replicación ha pasado. Esto garantiza que las chaperonas depositen correctamente las histonas sobre el ADN replicado. 4. Relación entre los nucleosomas y los fragmentos de Okazaki: ○ El proceso de ensamblaje de nucleosomas afecta la síntesis de la cadena rezagada durante la replicación. Las polimerasas que sintetizan el ADN en fragmentos de Okazaki se detienen cuando encuentran un nucleosoma recién formado, lo que determina la longitud de estos fragmentos (alrededor de 200 nucleótidos en eucariotas). Esto coincide con la longitud de repetición de los nucleosomas. Durante la replicación del ADN eucariota, las histonas deben ser sintetizadas y ensambladas de nuevo detrás de la horquilla de replicación para formar nuevos nucleosomas. Las histonas H3-H4 son parcialmente conservadas y redistribuidas, mientras que H2A-H2B se reemplazan en parte por nuevas histonas. El proceso es mediado por chaperonas de histonas que interactúan con la proteína PCNA para asegurar que las nuevas histonas se integren correctamente en el ADN replicado, manteniendo así la estructura de la cromatina. La telomerasa replica los extremos de los cromosomas La replicación de los extremos de los cromosomas en eucariotas presenta un desafío especial debido a la naturaleza del mecanismo de replicación de ADN. En particular, el problema de replicación de los extremos surge en la cadena rezagada, que se sintetiza de forma discontinua utilizando fragmentos cortos de ADN llamados fragmentos de Okazaki. Esto deja un extremo final sin replicar, ya que el último cebador de ARN no puede ser reemplazado por ADN debido a la falta de un extremo 3’-OH necesario para que la polimerasa reparadora complete la síntesis. Solución en eucariotas: Los telómeros y la telomerasa  1. Telómeros: ○ Los eucariotas resuelven este problema utilizando secuencias especializadas llamadas telómeros, que se encuentran en los extremos de los cromosomas lineales. ○ Los telómeros consisten en múltiples repeticiones de una secuencia corta de nucleótidos. En los humanos, por ejemplo, la secuencia repetida es GGGTTA, y esta repetición se repite alrededor de mil veces en cada telómero. ○ Estas secuencias repetitivas actúan como "amortiguadores" protectores que evitan la pérdida de material genético crítico cada vez que la célula se divide. 2. Telomerasa: ○ La enzima telomerasa es responsable de extender los telómeros para asegurar que no se pierda ADN valioso durante la división celular. ○ La telomerasa es una enzima única que incluye tanto una proteína con actividad enzimática como una plantilla de ARN dentro de la enzima misma. Esta plantilla de ARN es complementaria a la secuencia repetitiva de los telómeros. ○ La telomerasa reconoce el extremo del telómero existente y lo extiende en la dirección 5'-3', utilizando su plantilla de ARN para sintetizar más repeticiones de la secuencia telomérica en la hebra parental de ADN. En esencia, la telomerasa agrega copias adicionales de la secuencia repetida al extremo del cromosoma. 3. Proceso de extensión y replicación final: ○ Una vez que la telomerasa ha extendido el extremo parental de ADN, las polimerasas convencionales pueden completar la replicación de la hebra rezagada usando las extensiones teloméricas como plantilla. ○ Así, el problema de replicación de los extremos se resuelve y se asegura que los cromosomas no pierdan material genético en cada ciclo de división celular. Importancia biológica: Los telómeros y la telomerasa son esenciales para mantener la integridad genética durante la división celular. Sin telomerasa, los telómeros se acortarían con cada división celular, lo que eventualmente podría llevar a la pérdida de genes importantes. En muchos organismos, la actividad de la telomerasa es limitada en la mayoría de las células somáticas, lo que está relacionado con el envejecimiento celular. En contraste, las células germinales, las células madre y muchas células cancerosas mantienen alta actividad de telomerasa, lo que les permite dividirse indefinidamente sin perder material genético. La telomerasa extiende los telómeros en los extremos de los cromosomas eucariotas para resolver el problema de replicación de los extremos, asegurando que no se pierda ADN en cada ciclo de división celular. Sin reparación del ADN, el daño espontáneo del ADN cambiaría secuencias de ADN  El ADN, aunque es una molécula muy estable, es vulnerable a sufrir daños espontáneos que podrían alterar la secuencia genética si no se reparan. Estos daños pueden ocurrir de manera natural dentro de las células y, si no se corrigen, podrían resultar en mutaciones que se transmitirían a las generaciones celulares posteriores. Tipos de daño espontáneo al ADN 1. Depurinación: ○ Este es un tipo de daño en el que se pierden las bases purinas (adenina o guanina) del ADN. Esta pérdida ocurre porque el enlace N-glucosídico que une la base a la desoxirribosa se hidroliza espontáneamente. ○ En un ser humano, cada célula puede perder alrededor de 18,000 bases purinas por día. Si este daño no es reparado, podría provocar la eliminación de pares de bases durante la replicación, lo que resultaría en mutaciones. 2. Desaminación: ○ La desaminación es la conversión espontánea de una base de ADN en otra. Un ejemplo común es la desaminación de la citosina, que se convierte en uracilo. ○ En promedio, esto ocurre en 100 bases por célula por día. Si el uracilo no se elimina y se reemplaza con citosina, podría provocar un cambio en la secuencia del ADN durante la replicación. 3. Daños inducidos por agentes metabólicos y ambientales: ○ Metabolitos reactivos dentro de la célula, como formas reactivas del oxígeno o el donador de metilo de alta energía S-adenosilmetionina, pueden dañar el ADN al modificar sus bases. ○ Radiación ultravioleta (UV) del sol puede causar la formación de dímeros de timina, en los que dos bases pirimidínicas (como la timina) se unen covalentemente. Estos dímeros interfieren con la replicación y transcripción del ADN si no se corrigen. Consecuencias si el daño no se repara Si estos daños espontáneos no son corregidos por los sistemas de reparación de ADN: Deleciones de pares de bases: Por ejemplo, la depurinación puede llevar a la eliminación de una o más bases cuando el ADN se replica, lo que genera mutaciones de deleción. Sustituciones de pares de bases: Si la citosina desaminada se convierte en uracilo y no se corrige, puede emparejarse incorrectamente durante la replicación, causando una sustitución de base. Propagación de mutaciones: Si no se repara, los errores en la secuencia de ADN pueden pasarse a todas las células hijas, lo que podría tener efectos desastrosos para el organismo a largo plazo, como el desarrollo de enfermedades como el cáncer. Importancia de la reparación del ADN El daño espontáneo al ADN ocurre con frecuencia, pero afortunadamente, existen sistemas eficientes de reparación del ADN que corrigen estos errores antes de que se conviertan en mutaciones permanentes. Sin estos sistemas de reparación, los cambios aleatorios en las secuencias de ADN serían demasiado frecuentes y provocarían consecuencias graves, como la pérdida de funciones celulares o el desarrollo de enfermedades. El daño en el ADN puede eliminarse por más de una vía El ADN puede sufrir varios tipos de daño, y las células disponen de múltiples vías de reparación que utilizan diferentes enzimas para solucionar estos daños. 1. Reparación por escisión de bases (BER - Base Excision Repair) Este mecanismo se encarga de corregir daños menores en las bases de ADN, como las modificaciones causadas por desaminación, oxidación o alquilación. El proceso involucra varios pasos: Enzimas DNA glicosilasas: Cada una de estas enzimas identifica un tipo específico de base alterada en el ADN (por ejemplo, citosina desaminada o bases oxidadas). Para ello, “examinan” las bases a través de un proceso llamado "volteo de bases" ("flipping-out"), donde la base afectada es sacada temporalmente de la hélice del ADN para su inspección. Eliminación de la base dañada: Una vez que la glicosilasa reconoce la base dañada, la elimina de su esqueleto de azúcar. Esto deja un espacio vacío, conocido como "diente faltante", en el sitio de la base eliminada. AP endonucleasa: Esta enzima detecta el sitio donde falta la base y corta la columna fosfodiéster del ADN en ese punto. Reparación del hueco: El hueco resultante es llenado por la ADN polimerasa, que utiliza la cadena opuesta como plantilla, y la ADN ligasa sella el corte, restaurando la integridad del ADN. 2. Reparación por escisión de nucleótidos (NER - Nucleotide Excision Repair) Este proceso se encarga de reparar lesiones más grandes que distorsionan la estructura de la hélice del ADN, como los dímeros de pirimidina (causados por radiación UV) o los daños provocados por carcinógenos (como el benzopireno, presente en el humo del tabaco). Detección de distorsiones: Un complejo multienzimático escanea el ADN en busca de deformaciones en la hélice en lugar de buscar un cambio específico en una base. Corte y eliminación del segmento dañado: Cuando se identifica una lesión, el complejo corta el esqueleto fosfodiéster a ambos lados del daño y una ADN helicasa separa la hebra afectada, eliminando el fragmento dañado. Reparación del hueco: Al igual que en BER, la ADN polimerasa rellena el hueco con bases correctas y la ADN ligasa sella el esqueleto de ADN.  3. Reparación por reversión química directa Este mecanismo es una alternativa a los procesos de excisión, y se emplea para reparar ciertos daños de manera directa sin cortar o reemplazar nucleótidos. Reparación de metilación en guanina: En el caso de la O6-metilguanina, un tipo de lesión muy mutagénica, una proteína repara el daño transfiriendo el grupo metilo de la base dañada a un residuo de cisteína en la proteína, lo que destruye la proteína reparadora en el proceso. Demetilación de bases: En otros casos, como en la 1-metiladenina o 3-metilcitosina, una enzima dependiente de hierro elimina el grupo metilo quemándolo, liberando formaldehído y restaurando la base original. En todas estas vías, la célula emplea un mecanismo similar: el daño es reconocido y eliminado, la secuencia de ADN original se restaura utilizando la hebra complementaria como plantilla, y las roturas en la doble hélice son selladas por una ADN ligasa. Estas vías de reparación son cruciales para mantener la estabilidad genética y prevenir mutaciones que podrían provocar enfermedades.