Mutations du gène BRAF dans les Mélanomes PDF

Mutations du gène BRAF dans les Mélanomes Nicolas ORTONNE, département de Pathologie, hôpital H. Mondor Les diapos avec un point rouge sont à apprendre, les autres diapos servent à illustrer le propos et faciliter la compréhension Mélanomes : généralités ...

Mutations du gène BRAF dans les Mélanomes Nicolas ORTONNE, département de Pathologie, hôpital H. Mondor Les diapos avec un point rouge sont à apprendre, les autres diapos servent à illustrer le propos et faciliter la compréhension Mélanomes : généralités  MELANOMES 2005 : 7400 nouveaux cas,1440 décès Age moyen au diagnostic: 58 ans (F), 60 ans (H) FdR : - UV (enfance, exposition intense et intermittente) - Terrain : ATCD perso/familiaux Nbre de naevi Naevus géant congénital Phototype clair Albinisme Xeroderma pigmentosum Données de l’INVS  MELANOMES Classification simplifiée (Clark) Mélanome à extension Lésions pigmentées atypique Expo solaire superficielle (SSM) (ABCDE) intermittente 60% +/- Naevus associé Mélanome nodulaire Nodule tumoral +/- pigmenté, croissance - 20% rapide « Cutaneous » Mélanome de Dubreuilh Sujet âgé Expo solaire (Lentigo malin) Visage/cou chronique 10% Elastose Mélanome acro-lentigineux Zones acrales : plante/paume/ Expo solaire A part : matrice unguéale faible « Acral » Mélanomes des muqueuses Orale, génitale, digestive - « Mucosal »  MELANOMES Classification OMS 2017 9 groupes lésionnels Selon – Type d’exposition solaire – Lésion pré-existante (naevus) – Altérations génétiques: acquises/héréditaires X  MELANOMES Classification OMS 2017 Sun damage Pre-existing lesion Most freq. molecular alterations SSM (60%) Low CSD/Intermittent Possible BRAFV600E/NRAS L. maligna (10%) High CSD No BRAFV600K (non V600E)/NRAS ALM (10%) Low CSD/None No KIT/NRAS/BRAF Mucosal None No KIT/NRAS/KRAS/BRAF Spitzoid melanoma None Possible HRAS/TKR fusions Desmoplastic High CSD No NF1 M. in blue naevus None Yes GNAQ/GNA11/CYSTLR2 Uveal melanoma None M. in cong. naevus None Yes NRAS/BRAF Unclassified Nodular None No Heterogeneous SSM : superficial spreading melanoma L. maligna : lentigo maligna (mélanome de Dubreuilh) ALM : acral lentiginous melanoma (mélanome acrolentigineux) CSD : chronic sun damage  C.A.T devant une tumeur mélanocytaire Suspicion de mélanome – Biopsie-éxérèse Si naevus certain cliniquement – Abstention – Exérèse si gène fonctionnelle – Exérèse si gène esthétique  Naevus Problème principal = diagnostic différentiel du mélanome Critères cliniques de malignité des tumeurs mélanocytaires Naevus Mélanomes – Asymétrie – Bords irréguliers – Couleur inhomogène – Diamètre > 6mm – Evolutivité Naevus Mélanome superficiel extensif (SSM) Mélanome superficiel extensif (SSM) Amas de mélanocytes tumoraux Epiderme Derme Mélanome de Dubreuilh (lentigo maligna) Mélanome de Dubreuilh (lentigo maligna) Mélanocytes tumoraux Epiderme Derme Mélanome nodulaire  Mélanome nodulaire Amas de mélanocytes tumoraux Croûte (sang coagulé) Epiderme Derme Mélanome acrolentigineux/sous-ungueal (acral lentiginous melanoma) Mélanome acrolentigineux (stade in situ) Mélanocytes tumoraux Epiderme Derme Mélanomes : éléments d’oncogenèse  Mélanome, oncogenèse Anomalies moléculaire « initiales » Anomalies moléculaires secondaires… -BRAFV600E/K -KIT Perte de la sénescence réplicative… -NRAS Instabilité Kique -CDKN2A, CDK4 Mélanomes familiaux -BAP1 -Translocations (Kinases) : lésions Spitzoïdes MELANOME NAEVUS Cellule souche/progénitrice? Cellules en Mélanocyte? « sénescence réplicative » Cellules proliférantes ANOMALIES THERANOSTIQUES ANOMALIES DIAGNOSTIQUES - Diagnostic moléculaire pour la thérapeutique ciblée (BRAF) : analyse de la tumeur - Modifications secondaires d’oncogènes/gènes suppresseurs de tumeurs DEPISTAGE FAMILIAL -Parfois détectables sur tissu : FISH (ex : CCND1, MYB1, RREB1, Cen6) - Recherche de mutations germinales (sang) IHC : perte d’expression de p16  Mélanome, oncogenèse Nævus Tumeurs Melanome Mélanome Metastases “intermédiaires” in situ invasif 1. MAP-kinase pathway mutations hTERT promotor mutations 1. G1/S control mutations SWI/SNF mutations 2. G1/S control mutations 2. MAP-kinase pathway mutations 3. MAP-kinase pathway mutations TP53 mutations PTEN mutations Shain et al. NEJM 2015 ; Shain & Bastian Nature Rev Cancer 2016 Mélanomes avec mutation de BRAF… La mutation BRAF V600E est l’anomalie la plus fréquente dans le mélanome, mais existe dans d’autres cancers KIT/TKR PLCb Cell membrane CYSLTR2 RAS PKC Gq/11 DAG pTEN PiP3 Vemurafenib PI3K RAF Dabrafenib Nf1 Cobimetinib AKT1 MAP2K1/2 Trametinib mTOR MAPK1/3 NUCLEUS Target genes transcription : prolifération - survival - Cancers papillaires de la thyroïde (BRAFm: 50%) - Cancers colo-rectaux (BRAFm: 10%) - Cancers du poumon non à petites cellules (BRAFm:1-2%) - Leucémie à tricholeucocytes (BRAFm:100%) - Histiocytoses langerhansiennes (BRAFm:50%) - Etc…  MUTATIONS BRAF dans les mélanomes Existent dans les naevi bénins 50 à 70% des Mélanomes métastatiques: Age au diag (plus jeune) Localisation (tronc) G Long, J Clin Oncol 2011; 29 : 1239 Terrain Mélanome superficiel extensif / exposition UV (coups de soleil enfance +++) Mélanome de Dubreuilh : BRAFV600K Rares en zone acrale et sur les muqueuses N Thomas et al, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2007;16:991 Très majoritairement dans l’exon 15 ( + exon 11) - 80 - 90 % p.V600E (GTG GAG, valine acide glutamique) - 15 % p.V600K (GTGAAG) - Autres mutations plus rares Mutuellement exclusives avec mutations de NRAS ou KIT +/- Autres anomalies « secondaires » : PTEN, TP53… Pas de mutation de BRAF V600 dans les mélanomes en zone non exposées… Exemple des mélanomes des sinus et fosses nasales… Chraybi M, et al. Hum Pathol 2013;44:1902  MUTATIONS de BRAF… La protéine BRAF… Sérine-thréonine kinase Mutations V600 : siège dans le segment d’activation de la kinase La protéine muté BRAF V600E a une activité 500 fois supérieure à la protéine sauvage pour l’activation des protéines de la voie MAPKinase Mutations de BRAF et mélanomes Techniques de détection  Prélèvements et problématique Matériel : Tumeur primitive / métastase Pièce opératoire, biopsie, voire lames de cytologie ADN libre circulant (« cell free DNA ») Problèmes spécifiques au mélanome : – Matériel congelé rare voire exceptionnel – Cancers souvent de petite taille – Nécessité de préserver au mieux la lésion pour l’évaluation de l’épaisseur (Breslow) lors de l’échantillonnage macroscopique – Problème de la pigmentation mélanique : – Interférence avec les réactions de PCR (polymérase) – Lecture du marquage immunohistochimique plus difficile (chromogène rouge) Comme pour tout cancer Nature du fixateur : idéalement formol +++ (formol tamponné pH7) Hétérogénéité tissulaire : cellules tumorales + environnement nécessitant des techniques sensibles Techniques moléculaires  Phase « pré-analytique » Sélection de la zone d’intérêt (tumeur) sur la lame et macrodissection du bloc de paraffine Réalisation de coupes de la zone d’intérêt au microtome après nettoyage (contamination) Récupération des copeaux en tube Eppendorf pour extraction d’ADN Phase « pré-analytique » A partir de « lames blanches »  Extraction d’ADN à l’aide de kits commerciaux avec ou sans déparaffinage préalable technique manuelle ou automatisée Dosage spectrophotomètre Phase analytique : différentes techniques de PCR… N T ADN AGCTTGATG------------------------------ PCR -------------------------------TGCGATGCGT ---- ACA GTG AAA ------- ---- ACA GAG AAA ------- ---- ACA GTG AAA ------- ---- ACA GTG AAA ------- ---- ACA GAG AAA ------- ---- ACA GTG AAA ------- 1) Séquençage avec ddNTP fluorescents (« Sanger ») ADN ddNTP : PCR Frederick Sanger Résidu « désoxy en 3’ 1918-2013 Produit de PCR Impossibilité d’ajouter une 1980 : Nobel nouvelle base… Purification Réaction de séquence = PCR avec ddNTP fluorescents Purification Electrophorèse capillaire Analyse des données (electrophoregramme)  c.1799T>A, p.Val600Glu Pb : Les mutations ne sont pas toujours détectées  Autres tests plus sensibles 2) Recherche de mutation par pyroséquençage Réaction de PCR Incorporation base par base en présence de : - ATP sulfurylase - Luciférine+luciferase - Apyrase (dégradation des dNTP non incorporés) 1) pyrophosphate (PPi) > ATP 2) ATP + luciferine > oxyluciférine + signal lumineux Analyse des données (Pyrogramme) Sensibilité ≈ 5% d’allèle muté Quantification précise des allèles Nécessite équipement spécifique 3) PCR avec amorces spécifiques d’allèles Tetra-primer ARMS – PCR (amplification refractory mutation system) Taille des fragments Ye S. et al. Nucl. Acids Res. 2001  3) PCR avec sondes spécifiques d’allèles Utilisation de sondes Taqman WT ADN V600E - PCR avec sondes Taqman spécifiques d’allèles Fluorescence Analyse des données de fluorescence acquises pendant la PCR Q = « quencher », R = « reporter », WT = wild type  3) PCR avec sondes spécifiques d’allèles PCR en temps réel (Génotypage à l’aide de sondes Taqman) WT WT V600E Sensibilité ≈ 1% d’allèle muté 1 mutation détectée par test (amorces / sondes spécifiques)  3) PCR avec sondes spécifiques d’allèles Génotypage par automatie fermé : Idylla (Biocartis) Sensibilité ≈ 1% d’allèle muté 1 à 2 mutation détectée par test (amorces / sondes spécifiques)  Séquençage haut débit en profondeur Next Generation Sequencing (NGS) Principes : Etendue : nombre de séquences Profondeurs : nombre de « reads » Capacité d’étudier plusieurs échantillons en même temps Trois étapes principales: Préparation des banques Amplification clonale en émulsion ou sur support solide Séquençage (pyroséquençage/ion torrent/illumina) Séquençage haut débit en profondeur New Generation Sequencing (NGS)  Séquençage haut débit en profondeur New Generation Sequencing (NGS) Oncomine Solid Tumor DNA assay 22 gènes d’intérêt Immunohistochimie  BRAFV600E Marquage immunohistochimique spécifique Anticorps monoclonal murin anti-BRAF muté V600E (clone VE1) Sensibilité : 97%, spécificité : 98% En pratique : Technique classique sur coupe de 3mm Témoins externe muté sur la même lame Long GV, et al. Am J Surg Pathol 2013;37:61  BRAFV600E Marquage immunohistochimique spécifique Capsule ganglionnaire Métastase ganglionnaire de mélanome muté BRAFV600E Lymphocytes Mélanome muté BRAFV600E  BRAFV600E Marquage immunohistochimique spécifique Métastase ganglionnaire de mélanome muté BRAFV600E  BRAFV600E Marquage immunohistochimique spécifique Mélanome sur naevus (mutés BRAF V600E) Naevus Mélanome Melan-A (MART-1) BRAFV600E Stratégie « théranostique »: non standardisée Probablement à terme: 1) Recours à l’immunohistochimie en première intention, surtout dans les mélanomes survenant en zones photo-exposées Etude moléculaire si marquage négatif ou douteux pour : - Recherche de mutation V600 plus rare (V600K) - Recherche d’autres anomalies oncogéniques : NRAS, KIT Stratégie encore à valider (INCa) 2) Analyse par techniques de « NGS (new generation sequencing)» Possibilité d’étudier un panel de gène important en une seule fois Intérêt de la profondeur de lecture (« reads ») dans les tumeurs très hétérogènes 2) Intérêt de l’analyse de l’ADN circulant (« biopsie liquide »?) Bonne sensibilité : >75% des mélanomes métastatiques mBRAFV600 Santiago-Walker A, et al. Clin Cancer Res 2015;22567 Mutations de BRAF et mélanomes Thérapeutique ciblée avec inhibiteurs chimiques  Stratégie de thérapeutique ciblée Mélanome métastatique/non résecable Adjuvant si méta. ganglionnaire 1) Inhibiteurs de BRAF si mutation V600 détectée  Association avec anti-MEK 2) Immunothérapie en seconde intention ou si absence de mutation ou si maladie lentement évolutive  Efficacité similaire aux anti-BRAF  Anti-PD1 ou anti-PD1 + anti-CTLA4  Principes d’immunothérapie dans le mélanome Mélanome de type SSM avec régression inflammatoire débutante… Cellules tumorales mélanocytaires Lymphocytes réagissant contre la tumeur (« TIL ») Melan-A (MART-1) Principes d’immunothérapie dans le mélanome… Anti-CTLA4 = levée de freins à Ipilimumab (Yervoy®) : ATU de cohorte en 2011 l’activation Anti-PD1/CD278 lymphocytaire Nivolumab (Opdivo®), AMM 2014 Pembrolizumab (Keytruda®), AMM 2014 Co-stimulation… T Cell CD28 CTLA4 ?? ICOS TCR PD-1 Antigène Platelet, endohelial cells mélanocytaire osteoclast… Schawn cells AVβ3 integrin B7-2 ICOS-L MHC (B7-H2) PD-L1 B7-1 (CD86) PD-L2 (B7-H1) (CD80) (B7-DC) ICOS-L (B7-H2) APC Principes d’immunothérapie dans le mélanome… Cellules tumorales mélanocytaires TIL Melan-A (MART-1) Lymphocyte T « épuisé » (exhausted) Lymphocyte T ré-activé TIL Mélanome CpAg PD1 PDL1 Anticorps anti-PD1  Inhibiteurs chimiques de la voie des MAPK  Vémurafenib (Zelboraf®), Roche AMM en février 2012 Mélanome métastatique  Dabrafenib (Tafinlar®), GSK BRAFm AMM en août 2013 Mélanome métastatique et non résecable  Cobimetinib (Cotellic®), Roche  Trametinib (Mekinist®), Novartis MEK Extension d’AMM en 2015 Association anti-BRAF en 1ère intention  Inhibiteurs de BRAFm : efficacité démontrée Essais de phase I & II Réponse > 50% des pts Survie sans progression médiane 6 à 8 mois P Chapman et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N Engl J Med 2011;364:2507  June 14, 2011 Volume 8 / Number 12 New Therapies Offer Much-Needed Options for Patients with Melanoma Before and after images of two patients treated for 2 weeks with vemurafenib (Images courtesy of Plexxikon) Pet Scan : “positrons emission Tomography” (tomographie par emission de positrons)  Inhibiteurs de MEK Preuve de concept de l’efficacité des anti-MEK (trametinib) Patients avec mutation BRAF V600E/K Seulement 3 avec antériorité de ttt anti-BRAFm Falchook GS, et al. Lancet Oncol 2012;13:782  Inhibiteurs de BRAFm + MEK Essai de phase III - Vemurafenib + placebo :  Survie sans progression médiane 7.2 mois  EI graves : 28% - Vemurafenib + Cobimetinib :  Survie sans progression médiane 12.3 mois  EI graves : 37% PA Ascierto et al. Cobimetinib combined with vemurafenib in advanced BRAF(V600)-mutant melanoma (coBRIM): updated efficacy results from a randomised, double-blind, phase 3 trial. Lancet Oncol 2016;17:1248-60 Inhibiteurs de BRAFm : effets secondaires… Effets secondaires : 20% des patients présentent des tumeurs cutanées bénignes / malignes (kérato-acanthomes, carcinomes épidermoïdes) Rmq : Attention aux effets « paradoxaux » du vemurafenib L’inhibition de BRAF peut induire l’activation de la voie MAP-Kinase de façon dépendante de RAS, dans les cellules NON MUTEES BRAF AVultur, J Villanueva, M Herlyn, Clin Cancer Res 2011, 17:1658  CONCLUSION BRAF est un oncogène fréquemment muté dans les tumeurs BRAF est un effecteur de la voie de MAPKinases Environ 50% des mélanomes ont une mutation de BRAF Le plus souvent la mutation V600E de l’exon 15, activatrice Mélanomes superficiel extensif (exposition solaire) Cette mutation est un évènement précoce, driver, également présente dans des tumeurs bénignes (naevus) Mutuellement exclusives avec les autres « driver » (NRAS ou KIT) Différentes techniques de détection +/- sensibles Biologie moléculaire Possibilité d’identifier la mutation V600E par IHC Intérêt de la recherche surtout « théranostique » Indication de thérapie ciblée Mélanomes métastatiques et en adjuvant si atteinte ganglionnaire Association à un traitement anti-MEK