Protein Quantification - Facultad de Ciencias de la Vida 2023 PDF

Facultad de Ciencias de la Vida Escuela de Medicina Veterinaria Cuantificación de Proteínas Patobiología Molecular Semestre II - 2023 Las proteínas son moléculas formadas por aminoácidos Cargando… Cargando… Unión Peptídica entre Aminoácidos Unión Peptídica H H N C H R O H = O = CC...

Facultad de Ciencias de la Vida Escuela de Medicina Veterinaria Cuantificación de Proteínas Patobiología Molecular Semestre II - 2023 Las proteínas son moléculas formadas por aminoácidos Cargando… Cargando… Unión Peptídica entre Aminoácidos Unión Peptídica H H N C H R O H = O = CC H N N OH H H + H2O C O = C OH R CONDENSACIÓN Los aminoácidos se unen entre sí mediante uniones peptídicas para formar cadenas lineales no ramificadas. 7 En resumen, la estructura de una proteína. Primaria Secundaria Terciaria Cuaternaria Combinación ilimitada de aminoácidos. Hélice Globular Subunidades iguales Hoja Plegada Fibrosa Subunidades distintas Unión Peptídica Puente de Hidrógeno Puente de Hidrógeno, Interacciones hidrofóbicas, salinas, electrostáticas. Secuencia Conformación Fuerzas diversas no covalentes. Asociación 8 PROPIEDADES DE LAS PROTEINAS Las propiedades de las proteínas dependen sobre todo de los radicales R libres y de que éstos sobresalgan de la molécula y, por tanto, tengan la posibilidad de reaccionar con otras moléculas. El conjunto de aminoácidos de una proteína cuyos radicales poseen la capacidad de unirse a otras moléculas y de reaccionar con éstas se denomina centro activo de la proteína. 9 Propiedades de las proteínas Solubilidad Desnaturalización y renaturalización Especificidad De función Capacidad amortiguadora De especie 10 Solubilidad ● Las proteínas globulares poseen un elevado tamaño molecular, por lo que al disolverse, dan lugar a disoluciones coloidales. ● La solubilidad de estas moléculas se debe a los radicales R que, al ionizarse, establecen puentes de hidrógeno con las moléculas de agua. Así, la proteína queda recubierta de una capa de moléculas de agua que impide que se pueda unir a otras proteínas, lo que provocaría su precipitación. ● La solubilidad depende del pH, temperatura, concentración iónica. Cargando… Capa de moléculas de agua 11 ESPECTROFOTOMETRÍA ● Definición Método de análisis óptico más usado en las investigaciones biológicas. ● El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia LUZ VISIBLE ● ● Es una región muy estrecha pero la más importante, ya que nuestra retina es sensible a las radiaciones de estas frecuencias. A su vez, se subdivide en seis intervalos que definen los colores básicos (rojo, naranja, amarillo, verde, azul y violeta). ESPECTROFOTÓMETRO ● 1. 2. 3. 4. Un espectrofotómetro típico posee cuatro componentes básicos: una fuente de radiación que tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda que cubre ( usualmente es lámpara de tungsteno para luz visible,y deuterio para ultravioleta), un compartimiento para la muestra, un monocromador que separa la banda de longitud de onda deseada del resto del espectro y la dispersa al compartimiento de la muestra, y un fotodetector, que mide cuantitativamente la radiación que pasa por la muestra. ESPECTROFOTÓMETRO Espectrofotómetro ● La luz “monocromática” atraviesa la muestra, y llega al detector. Las mediciones fotométricas se hacen en base a la relación entre la potencia de luz que alcanza al detector cuando está interpuesta la muestra (P) y cuando no lo está (P0) o cuando está interpuesto un “blanco”. Espectrometría UV/Vis Cubeta para muestra 1 cm Vidrios silicatos, plástico Vis (350 – 2000 nm) Cuarzo o sílice fundida UV (<350 nm) Transmitancia y absorbancia ● La transmitancia se define como T = P / P0 ● y la absorbancia como A = - log T = - log P / P0 Ley de Lambert - Beer ● Relaciona la absorción de luz con las propiedades del material atravesado. LEY DE LAMBERT Y BEER ● La ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la transmisión y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. A = ε·c·l Donde: A = absorbancia; = Coeficiente de extinción molar; l = longitud de la celda. COEFICIENTE DE EXTINCIÓN MOLAR ● Es una medida de la cantidad de luz absorbida por unidad de concentración. ● Un compuesto con un alto valor de coeficiente de extinción molar es muy eficiente en la absorción de luz de la longitud de onda adecuada y, por lo tanto, puede detectarse por medidas de absorción cuando se encuentra en disolución a concentraciones muy BAJAS. ) ) ) ) ¿Considerando que las proteínas están formadas por 20 aminoácidos distintos, a que longitud de onda se “leen las proteínas”? Realizar un espectro de absorción de cada aminoácido por separado en un rango del espectro de luz (UV). Graficar A v/s longitud de onda (λ, nm) Ver aquel λ donde se obtiene el mayor valor de A Usar ese λ como estándar para determinar proteínas DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS Comparación de métodos Cuantificación de Proteínas • • • • Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta: cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos. Cuantificación de Proteínas ● • • • Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, para la formación de derivados químicos, o la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes. REACCIÓN DE BIURET ● La reacción debe su nombre al Biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2). MÉTODO DE LOWRY ● 1. 2. Reacción de determinación de proteínas en dos pasos: ReacciónCargando… de Biuret. La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina. PRIMER PASO SEGUNDO PASO Enlaces peptídicos tirosina, triptófano, y en menor grado por cisteína, cistina e histidina. Reacción de Cu2+ en medio alcalino Reacción con el Folin-Cicalteau Tinción de proteínas con Azul de Coomasie ● Ensayo en tubo método de Bradford. Hacer curva patrón ● Tinción de proteínas en gel de poliacrilamida- SDS BRADFORD ● Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas. ● El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja. ● Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. ● Este método es sensible (1-15 µg), simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. ● Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas. EL AZUL DE COOMASIE Y LOS AMINOÁCIDOS QUE RECONOCE CAMBIO DE ABSORBANCIA DEL COOMASIE BLUE Coomasie libre (catiónico) Coomasie-proteína (aniónico) Ensayo BCA (Bicinchoninic Acid Protein Assay Se basa en la reducción de Cu2+ a Cu+ por las proteínas en medio ácido, el Cu+ es detectado por dos moléculas de BCA pasando de color verde a purpura. Relación directa entre la cantidad de proteína y generación de color Cómo determino la concentración de proteínas de una solución desconocida? Rol de la Curva Patrón o estándar ● Es un marco de referencia que se construye de cantidades conocidas de una sustancia: ● por ejemplo la albúmina sérica bovina Curva calibración proteínas El experimento típico…