Patobiología Solemne 2 PDF

Cuantificación de Proteínas Generalidades • • Las proteínas son macromoléculas compuestas por la unión repetida de aminoácidos • Tienen estructura primaria, secundaria, terciaria y, algunas proteínas, cuaternaria o Desde la estructura terciaria la proteína obtiene su función Estructura Cuaternar...

Cuantificación de Proteínas Generalidades • • Las proteínas son macromoléculas compuestas por la unión repetida de aminoácidos • Tienen estructura primaria, secundaria, terciaria y, algunas proteínas, cuaternaria o Desde la estructura terciaria la proteína obtiene su función Estructura Cuaternaria o Formada por estructuras terciarias que se conjugan, pudiendo generar subunidades iguales o distintas o Se unen mediante fuerzas diversas no covalentes Estructura del Aminoácido • Cada aminoácido está compuesto por un carbono central, un grupo amino (NH2), un grupo carboxilo (COOH), un hidrógeno libre y un radical R o cadena lateral Enlace Peptídico • Para formar un enlace peptídico, tiene que interactuar el grupo carboxilo de una proteína (COOH) con el grupo amino del siguiente (NH2), liberando una molécula de agua en el proceso o Este proceso se llama condensación • En caso de querer romper el enlace, se debe agregar una molécula de agua o Este proceso se llama hidrólisis Estructura de la Proteína • Estructura Primaria o Consta de una combinación teóricamente ilimitada de aminoácidos en línea o Se unen mediante el enlace peptídico • Estructura Secundaria o La estructura primaria adopta una forma distinta en la que se pliega sobre si misma, formando una hélice o una hoja plegada o Se unen mediante puentes de hidrógeno • Estructura Terciaria o Nuevamente se adopta una forma distinta, pudiendo generar una proteína globular o fibrosa o Se unen mediante puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, salinas y electrostáticas Clasificación de Proteínas • Naturaleza Química o Simples o Conjugadas ▪ Contiene una molécula adicional que le da su función, por ejemplo, el grupo hemo del eritrocito • Forma o Fibrosa (lineal) o Globular (circular) • Función o Enzimática o De Transporte o Contráctil/Motil o Defensa ▪ Inmunoglobulinas o Reguladora ▪ Factores de transcripción o Nutriente ▪ Albúmina o Hormona o Etc Grupos • Apolares o Son aminoácidos hidrofóbicos, es decir, que rechazan al agua debido a falta de cargas que no interactúan con el agua o Alanina, Leucina, Valina, Prolina, Triptófano, Fenilalanina, Metionina, Isoleucina • Polares no Ionizables o Son aminoácidos polares neutros o Al colocarse en una solución no son capaces de generar iones o Glicocola, Serina, Treonina, Cisteína, Tirosina, Asparragina, Glutamina • Polares Ionizables Ácidos o Aspártico, Glutámico • Polares Ionizables Básicos o Histidina, Arginina, Lisina ▪ ▪ ▪ Propiedades de las Proteínas • • • • • Depende sobre todo de los radicales R libres y que éstos sobresalgan de la molécula, por lo que puedan reaccionar con otras moléculas o Esta porción se denomina centro activo de la proteína Solubilidad o Permite desarrollar mecanismos de identificación de proteínas en solución o Las proteínas globulares poseen un elevado tamaño molecular, por lo que, al disolverse, dan lugar a disoluciones coloidales o La solubilidad de estas moléculas se debe a los radicales R que, al ionizarse, establecen puentes de hidrógeno con las moléculas de agua ▪ Así, la proteína queda cubierta de moléculas de agua que impide la unión a otras proteínas o La solubilidad depende del pH, temperatura y concentración iónica Desnaturalización y Renaturalización o Permite desarmar y armar estructuras de la proteína según la temperatura y el ambiente Especificidad o De función o De especie Capacidad Amortiguadora o Pueden aceptar o liberar H+, razón por la cual pueden mantener el pH fijo en una solución Métodos de Análisis de Proteínas • Métodos no Extractivos o Método de Kjeldahl o Método Dumas o Adsorción de Colorantes • Métodos Extractivos o Químicos ▪ Método de Biuret ▪ Método de Lowry ▪ Método de Bradford o Físicos ▪ Absorbancia a 280 nm ▪ Fluorometría Espectrofotometría • Es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones biológicas • El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia o Componentes Fuente de Radiación Compartimiento para la Muestra Monocromador • Separa la banda de longitud de onda deseada del resto del espectro y la dispersa al compartimiento para la muestra ▪ Fotodetector • Mide cuantitativamente la radiación que pasa por la muestra • Cubeta para Muestra o Vidrios silicatos, plástico ▪ 350-2000 nm o Cuarzo o Sílice fundida ▪ <350 nm • Transmitancia o Magnitud que expresa la cantidad de energía que atraviesa un cuerpo en la unidad de tiempo • Absorbancia o Medida de la atenuación de una radiación al atravesar una sustancia, que se expresa como el logaritmo de la relación entre la intensidad saliente y la entrante o Es inversamente proporcional a la absorbancia o Se utiliza la longitud de onda donde mayor cantidad de luz es absorbida, es decir, donde se obtenga el mayor valor de absorbancia • Ley de Lambert-Beer o Relaciona la absorción de luz con las propiedades del material atravesado, es decir, si absorbe más luz, la muestra tendrá más proteínas o La ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la transmisión y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa o Su fórmula es: A = ε * c * l ▪ Donde: • A = Absorbancia • ε = Coeficiente de Extinción Molar • c = Concentración • l = Longitud de la Celda o Coeficiente de Extinción Molar ▪ Es una medida de la cantidad de luz absorbida por unidad de concentración ▪ Un compuesto con un alto valor de coeficiente de extinción es muy eficiente en la absorción de luz de la longitud de onda adecuada ▪ Puede detectarse por medidas de absorción cuando se encuentra en disolución a concentraciones muy bajas ▪ Si tiene un coeficiente alto, se podrá determinar una menor cantidad de proteínas • Método de Lowry o Reacción de determinación de proteínas en 2 pasos ▪ Reacción de Biuret ▪ Reducción del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, tirptófano, y en menor grado, cisteína, cistina e histidina • Tinción de Proteínas con Azul de Coomassie o Ensayo en tubo método de Bradford y luego se hace una curva patrón o Tinción de proteínas en gel de poliacrilamida-SDS • Método Bradford o Se basa en la unión de un colorante Coomassie Blue a las proteínas o El colorante, en solución ácida, existe en dos formas, una azul y otra naranja o Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre o Este método es sensible, simple, rápido y barato y pocas sustancias interfieren en su determinación o Entre las sustancias que interfieren, están los detergentes y las solucionas básicas o Es un método cualitativo Determinación de Proteínas • Cuantificación de Proteínas o Permite determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica o Es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta o Se utiliza para: ▪ Conocer la actividad específica de una preparación enzimática ▪ Diagnóstico de enfermedades ▪ Etc o Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas, muchos de estos métodos se basan en: ▪ La propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV ▪ Formación de derivados químicos ▪ La capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes • Reacción de Biuret o Permite determinar la presencia o ausencia de proteínas en una muestra o Se agrega urea y cobre que hace una reacción parcial, dando color azul ▪ Mientras más grupos amino, mayor coloración azul, es decir, hay más proteínas o Es un método cualitativo o La absorbancia se mide a 595 nm porque es la frecuencia a la que se absorbe el Coomassie Blue unido a proteína al hacer Bradford Ensayo BCA (Bicinchoninic Acid Protein Assay) • • • • Se basa en la reducción de Cu+2 a Cu+ por las proteínas en medio ácido El Cu+ es detectado por dos moléculas de BCA pasando de color verde a color púrpura Hay una relación directa entre la cantidad de proteína y la generación de color Es un método cuantitativo Rol de la Curva Patrón/Estándar • • • • • • Permite determinar la concentración de proteínas de una solución desconocida Es un marco de referencia que se construye de cantidades conocidas de una sustancia Es una curva que permite cuantificar las proteínas Se utiliza una serie de tubos a la que se añaden cantidades crecientes de proteínas A medida que aumenta la concentración, la absorbancia debiera aumentar proporcionalmente a la concentración de proteína Cada vez que se cambie el lote del tubo, se debe hacer la curva de nuevo SDS-Page y Western Blot Electroforesis en Geles de Poliacrilamida • • • Separa moléculas cargadas en una solución mediante un campo eléctrico según su peso molecular, en vez de separarlas según tamaño, forma, carga, etc Geles de poliacrilamida: mezcla de acrilamida y bisacrilamida, formando largas cadenas que se entrecruzan por enlaces covalentes Sencilla y reproducible, separa proteínas 10-300 kPB Preparación de la Muestra • • • • • • Lisis o Las células o los tejidos se tratan con un tampón de lisis y seguidamente se degradan mecánicamente para liberar las proteínas o En plantas, se requiere romper la pared celular Se debe mantener las muestras en hielo o a 4°C para evitar degradación de las proteínas por proteasas Antes de realizar la lisis, se debe añadir al tampón inhibidores de proteasas Si la proteína de interés está fosforilada, se debe incluir inhibidores de fosfatasas al tampón de lisis Elegir un tampón de lisis adecuado en función de la localización celular de la proteína de interés Existen muchos mecanismos de lisis, uno de ellos es el agua (medio hipotónico), mecanismo fácil y barato que permite romper la célula, pero no el núcleo • Molienda con Perlas de Vidrio o Agitación de las células con finas perlas de vidrio o Útil para células que son más difíciles de romper (como levaduras) o Es lento y ruidoso • Shock Osmótico o Cambio de un medio osmótico alto a uno de baja osmolaridad o Es simple y económico o Solo útil para la disrupción de células con paredes menos robustas (como células animales) • Congelación y Descongelación Repetidas o Disrupción de las células mediante la formación repetidas de cristales de hielo que rompen las células, generalmente combinado con lisis enzimática o Es simple, económico, produce fragmentos de membranas grandes o Es lento, puede dañar proteínas sensibles y disociar complejos de proteínas de membrana, bajo rendimiento • Lisis Enzimática o Frecuentemente utilizada en combinación con otras técnicas, como congelación y descongelación o shock osmótico; la lizosima es comúnmente utilizada para romper las paredes celulares de las bacterias o Es suave, produce fragmentos de membrana grandes o Pero es lento y de bajo rendimiento Condiciones Reductoras y Desnaturalizantes • Métodos Comunes para Romper Células • Presión de Cizallamiento Líquido o Disminución rápida de la presión al transferir la muestra desde una cámara a alta presión a través de un orificio a una cámara de baja presión o Es rápido y eficiente, sirve para grandes volúmenes o Causa calentamiento de la muestra, por lo que se requiere enfriamiento • Ultrasonido o Disrupción de las células mediante sonido de alta frecuencia o Es un método simple o Causa calentamiento de la muestra, que puede ser difícil de controlar mediante enfriamiento. Es ruidoso, no adecuado para grandes volúmenes y es lento Las muestras son normalmente tratadas con agentes que rompen las estructuras tridimensionales de las proteínas (dímeros, estructuras terciarias) y calentar la muestra • Se toma la muestra y se coloca un buffer a pH 7 • Se utiliza un tampón de carga estándar que contiene SDS (dodecilsulfato sódico) y β-mercaptoetanol o DDT (ditiotreitol) o El SDS es un detergente que desnaturaliza la proteína en su estructura primaria y la recubre de cargas negativas o El β-mercaptoetanol y el DDT son agentes reductores que rompen los puentes disulfuro o Todo ello permite que las proteínas se separen en función del peso molecular mediante SDS-Page, todas las proteínas quedarán en forma fibrilar, con carga negativa y sin subunidades o La reducción y desnaturalización permiten además la accesibilidad del anticuerpo a su sitio de unión Geles Discontinuos • Gel de Poliacrilamida • El gel de acrilamida genera una matriz densa que es ideal para la separación de proteínas debido a que genera poros más pequeños que la agarosa o El tamaño del poro se controla según la concentración de acrilamida • Permite separar proteínas más pequeñas que el ADN cromosómico • Es una reacción de polimerización de la acrilamida formada por largas cadenas de poliacrilamida entrecruzada con bisacrilamida utilizando la amina TEMED Migración de las Proteínas • • • • Proteínas con cargas negativas se mueven hacia el polo positivo La migración es proporcional a la carga total de las proteínas e inversamente proporcional al tamaño de la proteína Las proteínas pequeñas se mueven más rápido hacia el polo positivo mientras que las proteínas grandes se quedarán en el polo positivo Mediante este método, las proteínas se separarán solo por tamaño Luego de tratar la muestra con SDS y β-mercaptoetanol, se realiza una electroforesis y finalmente se tiñe con Azul de Coomassie para visualizar la muestra • Para realizar la electroforesis, se requiere hacer un gel discontinuo compuesto por 2 fases o Gel “Stacking” (Empaquetador) ▪ Contiene menor concentración de acrilamida, por lo que el tamaño del poro es mayor ▪ Acumula las proteínas a la entrada del gel separador para que salgan al mismo tiempo o Gel “Running” (Separador) ▪ Mayor concentración de acrilamida, por lo que el tamaño del poro es menor ▪ Su función es separar las proteínas Mientras mayor sea el grosor de la banda habrá mayor concentración de dicha proteína La ausencia de otras bandas indica que la proteína es pura, pero no diferencia entre 2 proteínas del mismo tamaño • • La migración depende de la concentración de acrilamida Cuando es necesario separar proteínas de distintos tamaños, se pueden hacer geles con gradientes de concentración para separar proteínas de mayor tamaño y menor tamaño al mismo tiempo, evitando hacer más de un gel para la misma muestra SDS-PAGE • • • • Permite determinar las características físicas como el peso molecular o número de subunidades Diferencias entre las proteínas de distintas fuentes Evalúa la pureza de la proteína Si además se utiliza un Western Blot, permite reconocer una proteína específica Western Blot • • • Geles en Condiciones no Desnaturalizantes Corresponde a una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una célula, tejido, órgano o fluido corporal Es dependiente de la reacción de un anticuerpo con una proteína que está inmovilizada en una membrana Es usada para identificar una proteína blanco en una mezcla compleja de proteínas y además medir sus niveles de expresión • Es un tipo de gel en las condiciones más “naturales” posibles, sin agregar SDS, β-mercaptoetanol o DDT, sino solo buffer • Ventajas o Separa las proteínas en estado nativo o Las proteínas separadas siguen siendo funcionales o Permite separar complejos proteicos o proteínas multiméricas como una unidad o Es una excelente herramienta para detectar cualquier proceso que altere la carga o la conformación de una proteína • Desventajas o Muchas proteínas no migran por no tener carga neta o por poseer carga neta positiva o El proceso de separación es muy lento debido a la debilidad de la carga neta de la proteínas o El proceso de separación no sólo está afectado por el tamaño, sino también por la forma de la proteína, por lo que no diferencia subunidades El Western-Blot comienza luego de la Electroforesis • Transferencia del Gel a la Membrana o Consta en transferir el resultado obtenido en el gel de poliacrilamida a una membrana mediante electroforesis o Para una buena transferencia, la membrana debe ser del mismo tamaño que el gel y se debe colocar sin imperfecciones o Transferencia Húmeda ▪ El gel y la membrana se ponen en forma de “sándwich” entre dos papeles filtro mojados con buffer y sumergido en buffer de transferencia, luego se aplica electroforesis o Transferencia Semi-Seca ▪ El gel y la membrana se ponen en forma de “sándwich” horizontalmente entre dos papeles filtro mojados con buffer, los cuales están en contacto directo con dos placas sólidas de electrodos que están muy cerca una de la otra • Inmunodetección e Interpretación de los Resultados o Bloqueo de la Membrana ▪ Evita que los anticuerpos y otras proteínas involucradas en la detección se unan inespecíficamente a la membrana, con el riesgo asociado de tener un elevado Background o falsos positivos ▪ Implica saturar el sistema con proteínas no específicas ▪ Se suele usar PBS, leche, BSA o suero de caballo como agente bloqueante ▪ 30 min a temperatura ambiente o 4°C toda la noche o Inmunodetección con el Anticuerpo Primario ▪ Es obtenido luego de inyectar la molécula de interés a un animal, luego éstos producen anticuerpos contra esta molécula y finalmente son purificados ▪ El anticuerpo primario se une a la proteína de interés ▪ Generalmente son de ratón, conejo, cabra, etc o Lavado PBS (TBST) ▪ Permite eliminar el anticuerpo primario no unido o Incubación con Anticuerpo Secundario/Conjugado ▪ Son obtenidos de la misma forma que el anticuerpo primario, solo que se inyecta el anticuerpo primario a un animal en vez de una molécula de interés ▪ Reconoce de forma específica una región concreta del anticuerpo primario y están marcados para ser detectables ▪ El anticuerpo secundario es conjugado con una enzima o a un substrato colorimétrico como un fluoróforo o Lavado PBS (TBST) ▪ Permite eliminar el exceso de anticuerpo o Detección ▪ Directa • Se detecta la proteína mediante un anticuerpo primario ▪ Indirecta • Se detecta la proteína mediante un anticuerpo secundario asociado a uno primario que, a su vez, está asociado a la proteína Controles de Carga • • Los controles de carga son anticuerpos usados para asegurar que la carga de proteínas en cada carril del gel SDS-PAGE sea constante Un anticuerpo control de carga directa detecta una proteína altamente conservada y presente en cantidades similares, independientemente del tipo de muestra Aplicaciones del Western Blot • • • • • Investigación Diagnóstico Prueba de VIH Se emplea como prueba definitiva de la encefalopatía espongiforme bovina o “enfermedad de las vacas locas” En veterinaria, ocasionalmente se emplea para confirmar la presencia del FIV Alteraciones de los Resultados • Ausencia o Debilidad de Bandas o Puede ser causado por ▪ Incompatibilidad con el anticuerpo secundario, ▪ Cantidad insuficiente de proteínas/anticuerpos que produzcan la señal ▪ Incubación corta ▪ No transferencia de la proteína ▪ Etc • Alto Ruido de Fondo o Puede ser causado por ▪ Membrana bloqueada incorrectamente ▪ Membrana no óptima ▪ Degradación de la proteína ▪ Exceso de anticuerpos • Esto causa uniones inespecíficas ▪ Etc • • Buffer Bloqueador Óptimo o Se debe buscas el agente bloqueador que produzca el mejor resultado, es decir, que solo se vea la banda de interés o En este caso, el mejor agente es la leche Burbujas, Lavado Precario, Trasferencia Incompleta 1 2 3 o Se observan alteraciones causadas por ▪ Contacto incompleto ente el gel y la membrana (1) ▪ Presencia de burbujas de aire (2) ▪ Lavado precario (3) Ensayo ELISA Principio de la Tecnología • • Tipos de ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay El antígeno se inmoviliza en una superficie sólida. Esto se puede realizar de manera directa o usando un anticuerpo de captura inmovilizado en dicha superficie ELISA Directo Equipo Básico • • • Lector de placas de pocillos Microplacas de poliestireno de pocillos Lavador de placas de pocillos ELISA Indirecto Pasos Generales de un ELISA • • • • • • • • • • Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo Adición de la Muestra Problema con la mezcla de antígenos/anticuerpos (Ag/Ac) Unión del Antígeno o Anticuerpo específico al Ag/Ac tapizado en el pocillo Lavado del pocillo para eliminar el exceso de Ag/Ac no unido Adición del Anticuerpo secundario marcado con la enzima (conjugado) Unión del Anticuerpo secundario al Ag/Ac Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida Adición del Sustrato Unión del sustrato a la enzima (obtención del producto) Desarrollo de Color El antígeno es inmovilizado a la superficie y es detectado con un Ac específico para dicho Ag. El anticuerpo está directamente conjugado El Ag es inmovilizado a la superficie y es reconocido por un Ac primario, seguido por la unión de un Ac que reconoce al Ac inmovilizado ELISA Directo • Ventajas o Simple y Rápido ▪ Solo se requiere 1 Ac y el flujo de trabajo consiste en pocos pasos o Menos propenso a errores ▪ Número relativamente pequeño de etapas de pipeteo debido al requisito de 1 solo Ac • Desventajas o Sensibilidad Limitada ▪ No hay paso de amplificación de señal o Desarrollo Costoso del Ensayo ▪ Cada diana de ensayo requiere al Ac conjugado específico, lo que hace caro al ensayo o Riesgo de Reactividad Limitada del Anticuerpo ▪ La unión de la enzima al Ac puede limitar la disponibilidad espacial de sitios en el Ac que deberían unirse al Ag ELISA Indirecto • • Ventajas o Flexibilidad ▪ El Ac secundario se puede usar siempre que coincida con la especie huésped del Ac primario o Sensibilidad ▪ Más de una molécula del Ac marcado puede unirse al Ac primario ya que contiene varios epítopos o Inmunorreactividad Máxima ▪ Ninguna etiqueta interfiere con los sitios en el anticuerpo primario o Económico ▪ Se requieren menos Ac marcados • Desventajas o Flujo de Trabajo Complejo ▪ Se requiere una etapa de incubación adicional para el Ac secundario o Potencial de Reactividad Cruzada ▪ Señal no específica debido a la reactividad cruzada con el Ac secundario ELISA Sándwich Formato de mayor uso. Requiere 2 Ac específicos para diferentes epítopos del mismo Ag- Uno de ellos recubre la superficie del pocillo y sirve como anticuerpo de captura del Ag. El otro Ac está conjugado, facilitando la detección del Ag ELISA Competitivo Mide la concentración de un Ag por la detección de interferencia de la señal. Se usa un Ag de referencia que competirá con el Ag de la muestra por unirse al Ac primario ELISA Competitivo • Ventajas o Máxima Flexibilidad ▪ Puede usarse en un formato ELISA directo, indirecto o tipo sándwich o Mayor Especificidad ▪ El Ag se captura y detecta específicamente o Muy Robusto ▪ Minimiza los efectos de la dilución de la muestra y los efectos de la matriz • Desventajas o Consume Mucho Tiempo ▪ Protocolo largo y complejo ▪ Se aplican las desventajas del formato de detección seleccionado Tipos de Enzimas y Sustratos • Enzima o Peroxidasa de rábano o Β-Galactosidasa o Fosfatasa Alcalina • Sustrato o Peroxido de Hidrógeno o O-nitrofenil-Beta-D-Galactopiranósido o P-nitrofenilfosfato Interferencias • • ELISA Sándwich • Ventajas o Flexibilidad y Sensibilidad ▪ Se pueden utilizar métodos de detección directa e indirecta o Alta Especificidad ▪ Se utilizan 2 Ac para detectar el Ag o Adecuado para Muestras Complejas ▪ No se requiere purificación del Ag antes de la medición Desventajas o Flujo de Trabajo Complejo ▪ Requiere más pasos de incubación que otros formatos ELISA o Requiere Más Optimización ▪ Se debe verificar la reactividad cruzada entre los diferentes anticuerpos utilizados • • • Presencia de enzima marcadora en la muestra, sustrato o producto Puede haber lípidos, hemoglobina o bilirrubina (deben ser corregidos por el blanco) Temperatura Contaminaciones por arrastre en el momento de lavado Otros Citometría de Flujo Generalidades • • • La citometría de flujo es una técnica basada en un láser de uso común que se emplea para contar, clasificar y fenotipar células en una suspensión unicelular Analiza un elevado número de eventos (1000-100000 células) en un corto período de tiempo Realiza medidas, tanto cualitativas como cuantitativas de más de 15 parámetros de forma simultánea en cualquier tipo celular en suspensión Citómetros • • Dispersión de la Luz • Se recogen dos tipos de dispersión o Dispersión Frontal (FSC, Forward Scatter) o Dispersión Lateral (SSC, Side Scatter) • Al atravesar el rayo de luz, las células interaccionan con éste, causando dispersión de la luz, basándose en la difracción de la luz o La dispersión en sentido frontal evalúa el tamaño de las células que pasan o La dispersión en sentido lateral evalúa la granularidad o complejidad de las células Son instrumentos en los que se hace pasar una suspensión de células o partículas alineadas y, de una en una, por delante de un láser focalizado El impacto en cada célula produce señales que son recogidas por distintos detectores que las convierten en señales eléctricas, que posteriormente serán digitalizadas y analizadas Funcionamiento y Selección de Células • • Las células (unidas a anticuerpos) que pasan por el citómetro, atraviesan un detector laser FSC y un detector fluorescente o de granularidad SSC al mismo tiempo, dividiendo a las células de la muestra en positivo o negativo Estructura o Sistema Hidráulico ▪ Con una sección neumática y otra de fluidos o Sistema Óptico ▪ Una sección de excitación (lases), lentes y prismas ▪ Una sección colectora que genera y recoge las señales o Sistema Electroinformático ▪ Convierte las señales ópticas lumínicas en señales electrónicas y las digitaliza para su análisis o Formación de Pulso Control Negativo Prueba Positiva Escategrama • • También llamado dot plot Es un gráfico de puntos donde se enfrentan 2 parámetros o Cada punto representa una célula según sus medidas asociadas o Puede relacionarse de esta forma cualquier pareja de parámetros o A medida que se van poniendo puntos, aparece una población • Hay varios tipos de Plots o Gráfico de Contorno (Contour Plot) o Gráfico de Densidad (Density Plot) o Gráfico en Tres Dimensiones • Gráfico FL1/FL2 o Cada evento con sus medidas está representado por un punto o Rodamina o Rojo Texas o Cianinas • El más utilizado para marcar proteínas es isoticianato de fluoresceína, donde el grupo isoticianato reacciona con los grupos amino de los residuos de lisina Fluorocromos de Unión no Covalente • • Aplicaciones • • • Gráfico FS/SC Normal Señales de Fluorescencia • • Los citómetros de flujo detectan señales de fluorescencia procedentes de complejos Ag/Ac marcados con un fluorocromo La señal de fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de componentes fluorescentes de la partícula Fluorocromos de Unión Covalente • Las moléculas orgánicas pequeñas (FITC, biotina) forman una unión covalente con grupos amino libres en anticuerpos • Hay varios de este tipo como: o Isoticianato de Fluoresceina o Phicoeritrina Se unen no covalentemente a estructuras dentro de la célula Son, por ejemplo: Hoechst, DAPI, Naranja de Acrimina, Yoduro de Propidio, entre otros Determinar poblaciones linfocitarias sanguíneas Evaluación de la viabilidad de espermatozoides mediante microscopía de fluorescencia o Verde: Vivo, Acrosoma + o Rojo: Célula Muerta o Verde/Rojo: Muerto, Acrosoma + o Sin Marca: Vivo, Acrosoma – Alteraciones • Fluorescencia Débil – Ausencia de Fluorescencia o Degradación o expiración de Ac o La fluorescencia o fluorocromo se destiñeron o Concentración de Ac muy baja para reconocerla o La expresión del Ag es muy baja • Ruido de Fondo – Marcas no Específicas o Exceso o presencia de anticuerpos no unidos o Dirigido a células no específicas o Auto fluorescencia alta o Presencia de células muertas • Pérdida de Epítopo o Exceso de paraformaldehido o La muestra no se mantuvo en hielo o La muestra se fijó por mucho tiempo