UNIDAD 3 Extracción-Purificación Acidos Nucleicos PDF

UNIDAD 3 EXTRACCIÓN – PURIFICACIÓN ÁCIDOS NUCLEICOS Índice 01. Pretratamiento 02. Extracción 03. Purificación Precipitación Rehidratación 04. Calidad 05. Almacenamiento 06. ARN La extracción de ácidos nucleicos es el proceso de aislar y purificar el ADN y/o el ARN de una m...

UNIDAD 3 EXTRACCIÓN – PURIFICACIÓN ÁCIDOS NUCLEICOS Índice 01. Pretratamiento 02. Extracción 03. Purificación Precipitación Rehidratación 04. Calidad 05. Almacenamiento 06. ARN La extracción de ácidos nucleicos es el proceso de aislar y purificar el ADN y/o el ARN de una muestra biológica para su posterior uso en análisis moleculares. Este proceso es crucial en la investigación genética, la medicina personalizada y la biología molecular. Existen varios métodos de extracción de ácidos nucleicos, pero en general, el proceso se lleva a cabo siguiendo los siguientes pasos: 1. Preparación de la muestra: La muestra biológica debe ser preparada para la extracción, lo que puede incluir la trituración o molienda de los tejidos, la lisis celular para romper la membrana celular y la liberación de los ácidos nucleicos en el medio de extracción 2. Separación de las proteínas: Es necesario eliminar las proteínas y otros componentes celulares de la muestra para obtener ácidos nucleicos de alta pureza. Este paso se logra mediante la adición de soluciones de lisis y agentes químicos que desnaturalizan y precipitan las proteínas. 3. Purificación de los ácidos nucleicos: Después de la separación de las proteínas, los ácidos nucleicos se purifican mediante la eliminación de contaminantes y otros componentes celulares no deseados. La purificación se puede realizar mediante la precipitación con etanol, columnas de intercambio iónico, columnas de gel de sílice, entre otros. 4. Cuantificación y evaluación de la calidad: Es necesario medir la cantidad y calidad del ADN o ARN aislado para determinar su viabilidad y uso posterior en los análisis moleculares. Esto se logra mediante la cuantificación espectrofotométrica, la electroforesis en gel, la PCR y otros ensayos de amplificación. La elección del método de extracción de ácidos nucleicos depende del tipo de muestra biológica, la cantidad y calidad del material genético requerido y el propósito del análisis posterior. Es importante tener en cuenta que una buena extracción de ácidos nucleicos es crucial para el éxito de los análisis posteriores y la obtención de resultados precisos y reproducibles  Técnicas de extracción de ADN Protocolo general para la obtención de ácidos nucleicos: 01. Pretratamiento de la muestra → para la obtención de suspensiones celulares de las que se extraerán los ácidos nucleicos. 02. Extracción de los ácidos nucleicos → para que los ácidos nucleicos estén accesibles a reactivos y enzimas de las diferentes técnicas. 03. Purificación de los ácidos nucleicos → eliminación de aquellos elementos que puedan interferir en las técnicas a desarrollar. ¿Con qué muestras se trabaja en biología molecular? ❑Sangre ❑Cultivos celulares ❑Tejidos animales y vegetales en fresco ❑Tejidos fijados en formol o incluidos en parafina ❑Células en suspensión ❑Microorganismos 01.1 SANGRE. Pretratamiento: 5 días en refrigeración a 4ºC Si no se extraen los ADN en 24hr Sangre total con EDTA (anticoagulante) También puede ser citrato o heparina aunque la cantidad y calidad es baja Southern blot MÁXIMO 3 días en refrigeración a 4ºC  LISIS DE LOS HEMATÍES Sangre : Solución de lisis 1:3 CUIDADO: Hemoglobina Grupo Hemo inhibe PCR CENTRIFUGAR Células sanguíneas: Hematíes Leucocitos ELIMINACIÓN SOBRENADANTE Plaquetas Pellet o sedimento → LEUCOCITOS  Lisis Hematíes: Fenómenos osmóticos: - Cloruro Amónico (NH4Cl) 150 mM - Bicarbonato Potásico (KHCO3) - EDTA 1mM Detergentes: - Tris-HCl 10nM, pH8 - Triton X-100, 1% - Sacarosa 11%  Centrifugación en Gradiente de Densidad: Ficoll-Paque Más para ARN PBMC (peripheral blood mononuclear cell) 01.2 CULTIVOS CELULARES. Pretratamiento. Cultivo celular: forma de obtención de células in vitro mediante siembras controladas en medios específicos. Recolección. Cultivos en suspensión Cultivos en monocapa Recolectar en un tubo 1.- Realizar la extracción en el mismo frasco. Retirar el medio Lavar con tampón o solución salina Extracción Centrifugar: eliminar medio de cultivo. 2.- Despegar la monocapa con raspador (mecánica) o mediante enzimas (tripsina) Pasar las células a un tubo Lavar con tampón o suero Lavar Extracción 01.3 TEJIDOS EN FRESCO. Pretratamiento. Homogeneización: Proceso para liberar las células que componen el tejido.  MECÁNICA: QUÍMICA: Someter al tejido a una acción Acción de proteasas y abrasiva o trituradora. detergentes que degradan el tejido. AUTOMATIZADA: Se pueden liberar proteasas y nucleasas. Conviene que sea en frio y rápido o añadir inhibidores enzimáticos MANUAL CON MORTERO: Trituración/pulverización previa congelación con nitrógeno líquido Homogeneización mecánica automática 01.4 TEJIDOS FIJADOS EN FORMOL E INCLUIDOS EN PARAFINA. Pretratamiento. Son muestras de ADN de menor calidad que el obtenido de tejidos en fresco. La fijación fragmenta el ADN y degrada parcialmente el ARN. MICROTOMO (5-10µm) DESPARAFINAR REHIDRATAR EXTRACCIÓN 5-10mg de cortes en tubo Etanoles en CENTRIFUGAR HOMOGENIZACION Eppendorf concentración creciente hasta agua destilada Descartar Añadir XILOL sobrenadante 01.5 OTRAS MUESTRAS. Pretratamiento. Cultivos de bacterias y Medio líquido: Centrifugar → Resuspender en el levaduras tampón Tampón GTE Colonias: Recoger con asa de siembra → Resuspender (TRIS, EDTA. Glucosa) en el tampón Raspado con torunda o cepillo. KIT Células de la mucosa oral Enjuague con solución conservante. comercial Saliva. Fluidificar con mucolítico: N-acetil-L-cisteína Esputo Añadir NaOH si micobacterias para descontaminar.  02. EXTRACCION ACIDOS NUCLEICOS Obtención de un lisado celular de aspecto homogéneo en LISIS CELULAR el que los ácidos nucleicos se encuentran libres de las estructuras celulares que INACTIVACION les mantenían NUCLEASAS CELULARES aislados. ADNasas, ARNasas Lisis Celular DETERGENTES: SDS (dodecil-sulfato-sodico) + EDTA Desestructurar Bicapa Lipídica EDTA: quelante cationes bivalente. Inhibe ADNasas Desnaturalizar proteínas PROTEASAS: proteasa K. Digiere proteínas (agentes caotrópicos: Isotiocianato de guanidinio - ARN) S INACTIVACION DE NUCLEASAS ADN, ARN Lisis Celular Células con pared celular con tratamiento enzimatico y mecanico no rompe la membrana celular Tratamiento enzimático: - lisozima o lisostafin (bacterias Gram positivas) - liticasa o zimolasa (cels vegetales, levaduras y hongos) Tratamiento mecánico: - Ebullición - Congelación/descongelación CTAB(Bromuro de cetil-trimetil-amonio): Pared celular alto contenido de Polisacaridos. SDS Si se quiere trabajar exclusivamente con ADN: ARNasa A 37ºC – 15-45 min VIDEO https://www.youtube.com/watch?v=a8d8ZNSX880  03. PURIFICACION ACIDOS NUCLEICOS Existen diferentes técnicas de purificación de ácidos nucleicos: Separar los ácidos nucleicos de los ❑Purificación con solventes orgánicos ❑Precipitación con sales (salting-out) demás componentes ❑Cromatografía de intercambio iónico del lisado. ❑Cromatografía de adsorción ❑Purificación con esferas magnéticas ❑Ultrafiltración ❑Plasmidos 03.1 Purificación con solventes orgánicos: Basado en la distinta solubilidad de los compuestos del lisado en solventes orgánicos. Presentan un bajo coste económico y se obtiene un ADN de buena calidad y alta concentración. Sin embargo, son protocolos largos y que requieren del uso de solventes orgánicos (fenol, cloroformo) que son irritantes, corrosivos y volátiles, por lo que debemos trabajar en la campana de extracción y con protección para la piel (guantes y bata).  que no se puede mezclar La mezcla de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico es inmiscible en agua y, tras la centrifugación, formará un gradiente con una fase acuosa, que contendrá el ADN en disolución en la parte de arriba, además de una interfase y una fase orgánica inferior que contendrán las proteínas. 1.- Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos. 2.- Precipitación del ADN. 4.- Resuspensión del ADN. 3.- Lavado del ADN. 03.2 Precipitación con sales, salting-out : Tras la lisis celular y la eliminación de las proteínas de la muestra, se precipitan los ácidos nucleicos añadiendo isopropanol o etanol. Este método permite la obtención de ADN de gran pureza y presenta la ventaja de que las soluciones utilizadas son muy seguras para la salud del personal técnico que realiza la extracción. 1.- Precipitación Proteínas. (NaCl 6M, Acetato Amonio 10M) 2.- Precipitación ADN. 3.- Lavado y resuspensión ADN. 03.3 Cromatografía de intercambio ionico: El mecanismo básico es el intercambio reversible de los iones en solución con los grupos funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina. Por ejemplo: Un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados positivamente, pero eluirá de la columna al cambiar el pH del tampón (tampón de elución) ya que los iones del tampón de elución interaccionan con los grupos cargados del ácido nucleico o del intercambiador iónico, respectivamente. Primero eluirán de la columna las moléculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al añadir el tampón de elución, eluirán las moléculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta. Lavado con tampones de concentración salina creciente. Eluyen contaminantes con baja carga negativa. Precipitar ADN con etanol y resuspensión en tampón TE 03.4 Cromatografía de absorción: Los agentes caotrópicos como el tiocinato de guanidio o el cloruro de guanidinio favorecen la unión del ADN a una matriz de sílice. Esta propiedad se explota en múltiples kits comerciales, que disponen la sílice en pequeñas columnas de centrifugación o microesferas que permiten obtener buenas concentraciones de ADN. Estos métodos comerciales son rápidos pero caros y es necesario ajustar la cantidad de muestra y seguir los pasos detallados por el fabricante para evitar la saturación de las columnas o microesferas. 03.5 Purificación con Esferas Magnéticas: Este método se basa en el uso de superficies, microesferas o partículas magnéticas que se recubren con anticuerpos o reactivos que se unen al ADN. - En primer lugar, se incuba el ADN junto a las microesferas para permitir su unión. - Después, las microesferas se atraen a un lateral del tubo mediante el imán y el líquido se pipetea o decanta. Este paso se repite con diferentes lavados. - Por último, procederemos a la elución del ADN, es decir, añadiremos una solución específica que lo extraerá del medio sólido que lo ha absorbido, en este caso las microesferas. En este paso, se incuban las microesferas con la solución de elución varios minutos, para permitir la separación del ADN y, de nuevo, se unen las microesferas a un lateral del tubo con el imán como en los pasos anteriores. Sin embargo, en último paso nos quedamos con el líquido, puesto que contiene el ADN resuspendido. Lyse tissue with Lysis Buffer 03.6 Ultrafiltración: Se utiliza una membrana que actúa de filtro sobre la que se coloca la muestra de ácidos nucleicos extraídos y se somete a centrifugación Los ácidos nucleicos libres de sustancias contaminantes quedan retenidos en la membrana y posteriormente se recuperan añadiendo agua o tampón especifico (TE) Producto lisis 03.7 Plásmidos: Los plásmidos contenidos en las bacterias son una fuente de ADN fácilmente modificable y multiplicable en cultivo, así como esenciales en múltiples diseños experimentales, CLONACION. Al tratarse de moléculas de ADN circulares y de menor tamaño que el cromosoma bacteriano, se han diseñado estrategias experimentales para obtener los plásmidos de manera específica. Centrifugación en gradiente de CsCl Lisis alcalina  PRECIPITACION DEL ADN Después de que son eliminados los lípidos y las proteínas, se recupera el ADN. Para ello, se adiciona etanol y soluciones con altas concentraciones de iones de sodio o amonio que se unen a los grupos fosfato, esta mezcla reduce las fuerzas repulsivas entre las cadenas y permite que el ADN se pliegue sobre sí mismo haciéndolo insoluble. Un paso de centrifugación permite que el ADN permanezca en el fondo del tubo mientras que el etanol es desechado. Los restos de etanol se eliminan con un lavado con etanol al 70% y el remanente se elimina por evaporación.  REHIDRATACION DEL ADN Una vez que se ha eliminado el etanol, el paso siguiente es hidratar el ADN para mantenerlo en solución. En el caso de emplear agua, el pH debe ser de 7 para permitir la redisolución completa del ADN y evitar una hidrólisis ácida. Cuando se utiliza una solución amortiguadora, es preferible utilizar una solución de Tris-HCl a 10mM y EDTA a 0.1M a un pH de 8.0 (low TE) para almacenar el material. Cuando se está disolviendo el ADN es importante evitar el pipeteo y la agitación agresiva pues se pueden fragmentar moléculas de alto peso molecular. Una opción que evita la fragmentación consiste en incubar a 55 °C el ADN, 1 a 2 horas con agitación suave. 04. CALIDAD ACIDOS NUCLEICOS La calidad de los ácidos nucleicos purificados viene dada por tres parámetros: INTEGRIDAD PUREZA CONCENTRACION La calidad en los ácidos nucleicos purificados es clave para su uso en técnicas posteriores  05. 1 INTEGRIDAD Además de conocer la cantidad y calidad del ADN por espectrofotometría, es importante conocer si el ADN obtenido está integro (como de “roto” esta). La integridad del ADN se puede observar mediante electroforesis en gel de agarosa. - Si el ADN está integro, se debe observar una banda estrecha cercana al pozo en que se colocó la mezcla de ADN. - Si está fragmentado, se observará una banda de más de un cm de ancho o un smear en el carril de la muestra. El ADN fragmentado dificulta la amplificación de productos de PCR de alto peso molecular y afecta la reproducibilidad de las técnicas. Degradado Integro  05. 2 CONCENTRACION unas cubetas miren 1 cm, la absorvancia sera directamente proporcional con el resultado. Una vez obtenido el material genético, es importante determinar el rendimiento mediante espectrofotometría. Medimos la Absorbancia. La ley de Beer-Lambert indica que la concentración de una molécula en solución depende de la cantidad de luz absorbida de las moléculas disueltas. Una característica del ADN es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm y permite estimar su concentración mediante espectrofotometría. Si una fuente de luz la hago pasar por una cubeta, una parte de luz será transmitida pero será menos que la inicial, quedandose una parte dentro del material la luz es proporcional a los centimetros que tiene la cubeta que estoy midiendo, la sustancia absorbe una cantidad de longitud de onda de mi pico (....) de ADN.  ug =microgramos Cuando la longitud de la celda en que se disuelve el ADN, es de 1 cm, la absorbancia es igual a la densidad óptica (DO). En el caso de ADN genómico o de doble cadena, una densidad óptica equivale a 50 ug/ml (Leninger 1975). absorbancia ---> 50,5 0,728 ---> X 1 unidad = 50ug/ml Se debe considerar el factor de dilución para obtener la concentración en nanogramos/microlitro (ng/ul). aparato de ultima tecnologia En el caso de algunos equipos como el espectrofotómetro Nanodrop, no es necesario diluir la muestra y el equipo nos proporciona directamente la concentración en ng/ul. Considerando que para una reacción de PCR se requieren de 10 a 200 ng debemos obtener al menos, 5 ng/µl de ADN en cada muestra, si se recuperaron 50 µl, el rendimiento neto de la extracción sería de 0.25 µl. Concentraciones menores dificultan la estandarización de la PCR u otras técnicas.  Tambien se utiliza el espectrofotometro 05. 3 PUREZA Para estimar la pureza del ADN se considera la proporción de la absorbancia a 260 nm y 280 nm. absorbancia absorbancia Es el numero que me 260 nm/280 nm 0,728 dara los valores = 1.38 0,526 0,728 0,526 Una proporción de 1.7-2.0 es aceptada como ADN puro, proporciones menores a este valor indican la presencia de proteínas. Proporciones mayores ARNasas. Arrastras proteinas y no lo hiciste bien Arrastras ARNasas y no lo hiciste bien Una segunda valoración de la pureza de ácidos nucleicos es la proporción 260/230. Los valores aceptados se encuentran en el rango de 2.0 a 2.2, si la relación es menor indican la presencia de contaminantes como carbohidratos o fenol  A 260 Pico máxima absorbancia ácidos nucleicos. A 280 Pico máxima absorbancia principales contaminantes (proteínas y derivados fenólicos). A 230 Pico máxima absorbancia contaminantes menores (glúcidos y sales). A 320 Para medir la turbidez de la solución.  05. ALMACENAMIENTO Una vez que el ADN ha sido purificado, cuantificado y analizado mediante electroforesis, una parte de la muestra se puede almacenar a 4 °C para los análisis inmediatos y el material restante a -20 °C o -80 °C, para una preservación por varios meses. En este último caso es conveniente que el ADN se conserve en soluciones con baja concentración de sales (low TE) para inhibir la acción de DNasas contaminantes. Ventajas y desventajas de los métodos tradicionales y comerciales de extracción y purificación de ADN. NO PREGUNTARA NADA DE ESTA TABLA  06. ARN Las moléculas de ARN son de menor tamaño y menos estables que las de ADN y las ribonucleasas son difíciles de inactivar y están presentes de manera ubicua en todos los organismos. Por lo tanto, antes de comenzar con nuestros experimentos con ARN, es necesario disponer de una Hay que limpiarse del ARNnucleasa zona libre de ribonucleasas (RNase-free). Estas zonas se limpian con productos especiales y se mantienen libres de polvo o interacción con material de laboratorio no destinado a experimentos con ARN. Además, nuestras soluciones deben estar libres de ribonucleasas por lo que se usa agua tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC) o se añaden otros inhibidores comerciales de estas enzimas.  06. 1. ARN total 06.1.1. Métodos solventes orgánicos – TRIzol Uno de los métodos de extracción de ARN total de uso más extendido es el basado en el reactivo TRIzol (o reactivo TRI). Purificación del ADN Este método es una variación de la extracción de ácidos nucleicos con fenol y cloroformo, pero en un medio ácido en lugar de básico como ocurría en la extracción de ADN. El TRIzol es un reactivo comercial que contiene un 40 % en peso de fenol saturado (pH 4,3), tiocianato de guanidio 1 M, tiocianato de amonio 1 M, tampón de acetato de sodio 0,1 M (pH 5,0) y un 5 % en peso de glicerol, al que se le añade cloroformo para conseguir la formación de un gradiente con tres fases NO PIDE LA COMPOSICION QUIMICA Fases: - Una acuosa que contiene el ARN - Una interfase (donde se encuentra el ADN gracias a las propiedades caotrópicas del tiocianato de guanidio) - Una fase orgánica (en la que encontramos proteínas y otros restos de ADN). ARN Antes de realizar este protocolo debemos recordar que es necesario conservar el reactivo TRIzol en oscuridad y refrigerado, y que debemos trabajar en campana de flujo laminar y con protección frente a salpicaduras, ya que los reactivos (fenol, cloroformo) son corrosivos, irritantes, volátiles y muy peligrosos. Si queremos eliminar cualquier resto de ADN de nuestra muestra, podemos proceder a un tratamiento con desoxirribonucleasas (DNasa I), que aumentará la pureza del ARN pero nos hará perder algo de concentración. Quita el ADN que sobra VIDEO RNA Extraction by TRIzol® - YouTube 06.1.2. Métodos sobre soporte físico En este caso, de nuevo nos encontramos con diferentes matrices, normalmente de sílice, dispuestas en columnas para centrifugación, microesferas magnéticas o membranas de filtrado que permiten una rápida obtención del ARN de la muestra. El fundamento vuelve a ser la creación de las condiciones necesarias para la unión del ARN a la matriz (adición de etanol u otras soluciones específicas) y el lavado del resto de macromoléculas pero, al tratarse de kits comerciales, los protocolos a seguir son los detallados por el fabricante en cada caso  06. 2. ARN mensajero La mayoría de las técnicas enfocadas al estudio de la expresión génica requieren de la obtención de ARNm de alta calidad sin la interferencia de otros tipos de ARN o de restos de ADN. Para ello, lo más común es aprovechar la poliadenilación que ocurre de manera natural en el ARNm, es decir, se aprovecha la adición de una cola de nucleótidos de adenina (cola poli-A) que se produce durante la maduración del ARNm, para purificar estas moléculas de manera selectiva. Esto se consigue mediante el uso de microesferas o columnas recubiertas de oligonucleótidos de desoxitimidina (oligo-dT) que se unen a esta cola poli-A. Un protocolo clásico consta de los siguientes pasos VIDEO mRNA Extraction from Total RNA - YouTube 06. 3 CONCENTRACION Y PUREZA ARN A260/A280 en ARN Grado de pureza adecuado: 1,8-2,1 A260/A230 Ácido nucleico puro: 1,5-2,2 < 1,5 Presencia de contaminantes < ARN ribosomal es el mas abundante de los ARN, por lo mismo es mas facil encontrarlo y que sea integro. ARN es ribosomal Gracias