Clase 3. Enzimas y Conceptos Básicos de Cinética Enzimática PDF

Modulo Estructura y Función de Macromoléculas Biológicas Enzimas. Definición de enzima. Cinética química. Complejo enzima-sustrato y mecanismos de acción enzimática. Termodinámica de las reacciones catalizadas por enzimas. Conceptos básicos de cinética enzimática: ecuación de Michaelis-Menten. ...

Modulo Estructura y Función de Macromoléculas Biológicas Enzimas. Definición de enzima. Cinética química. Complejo enzima-sustrato y mecanismos de acción enzimática. Termodinámica de las reacciones catalizadas por enzimas. Conceptos básicos de cinética enzimática: ecuación de Michaelis-Menten. Propiedades de las enzimas ENZIMAS = CATALIZADORES BIOLÓGICOS Un catalizador es una sustancia que acelera la velocidad de una reacción y se recupera incambiado. La catálisis biológica tiene gran importancia: El azúcar puede guardarse por años. Sin embargo, nos sirve como fuente de energía en segundos, gracias a la catálisis. Las enzimas son proteínas altamente especializadas que tienen como función la catálisis o regulación de la velocidad de las reacciones químicas que se llevan a cabo en los seres vivos. E+S [ES] E+P  Las enzimas son proteínas* que catalizan reacciones químicas No hacen factibles las reacciones imposibles Son sustancias que, sin consumirse en una reacción, aumentan notablemente su velocidad. Ello hace posible que en condiciones fisiológicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requerirían condiciones extremas de presión, temperatura o pH. Prácticamente todas las reacciones químicas que tienen lugar en los seres vivos están catalizadas por enzimas. * En su mayoría son proteínas, hay ARN con capacidad catalítica (ribozimas)  Aspectos generales de las enzimas Las enzimas son catalizadores específicos: cada enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre actúa sobre – un único sustrato o – un grupo muy reducido de ellos. Sustrato: sustancia sobre la que actúa la enzima  ¿Cómo lo hacen? La cuestión fundamental de la enzimología es comprender cómo hacen las enzimas para ser catalizadores tan potentes y específicos Sitio activo Las reacciones enzimáticas tienen un lugar en un pequeño lugar de la enzima (E) denominado sitio activo. El sustrato (S) se une al sitio activo formando el complejo enzima-sustrato (ES) Características del sitio activo: 1. ocupa una porción pequeña de la proteína. 2. es una entidad tridimensional formada por grupos funcionales que provienen de diferentes partes de la secuencia proteica. Unión de la quimotripsina 3. los sitios activos son ranuras o hendiduras. a su sustrato En general, tienen carácter no polar, excluyen el agua, y tienen ciertos residuos polares, de tal forma que constituyen un microambiente. La unión del sustrato depende de una disposición definida de átomos en el sitio activo. El sitio de unión al sustrato O puede formarse el sitio de puede existir en ausencia de unión al unirse el sustrato sustrato (hipótesis de llave- (hipótesis de encaje inducido cerradura de Emil Fischer). de Daniel Koshland). Encaje inducido: Estructuras de la hexoquinasa con y sin glucosa glucosa + ATP → glucosa 6-fosfato + ADP Reacción catalizada por una enzima: centro activo región concreta de la enzima donde el sustrato se une Enzima y su Unión al centro Formación de sustrato activo productos E+S → ES → E + P Complejo enzima-sustrato  El sitio activo comprende: un sitio de unión formado por los aminoácidos que están en contacto directo con el sustrato y un sitio catalítico, formado por los aminoácidos directamente implicados en el mecanismo de la reacción  El sustrato se une a la enzima luego se inicia la catálisis Sitio de unión: es el que le da la especificidad a la enzima Sitio catalítico  Nomenclatura Hay varias formas de nombrar una enzima: nombres particulares nombre sistemático código de la comisión enzimática (enzyme comission)  Nomenclatura: nombres particulares Antiguamente, los enzimas recibían nombres particulares, asignados por su descubridor. Ejemplos: amilasa (hidroliza el almidón) glucoquinasa Glc + ATP → Glc-6P + ADP Al ir aumentando el número de enzimas conocidas, se hizo necesaria una nomenclatura sistemática que informara sobre la acción específica de cada enzima y los sustratos sobre los que actuaba.  Nomenclatura: nombre sistemático Consta actualmente de 3 partes: el sustrato preferente el tipo de reacción realizado terminación "asa" ejemplo: la glucoquinasa ATP:glucosa fosfo transferasa Glc + ATP → Glc-6P + ADP  Nomenclatura: Comisión de Enzimas El nombre es identificado por un código numérico: encabezado por las letras EC (enzyme commission) seguidas de cuatro números separados por puntos. – el primer número indica a cual de las seis clases pertenece la enzima, – el segundo se refiere a distintas subclases dentro de cada grupo, – el tercero y el cuarto se refieren a los grupos químicos específicos que intervienen en la reacción.  Nomenclatura: Comisión de Enzimas Ej.: la ATP:glucosa fosfotransferasa (glucoquinasa) Glc + ATP → Glc-6P + ADP EC 2.7.1.2. 2: transferasa 7: fosfotransferasa 1: el aceptor es un grupo OH 2: es un OH de la D-glucosa el que acepta el grupo fosfato.  Nomenclatura: Comisión de Enzimas Clases 1. Óxido-reductasas 2. Transferasas 3. Hidrolasas 4. Liasas 5. Isomerasas 6. Ligasas MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS H2O2 → H2 O + O2 Perfil energético de una Perfil energético de una reacción espontánea reacción catalizada  MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS La acción de los catalizadores consiste en disminuir la Energía de activación Las enzimas son catalizadores especialmente eficaces, ya que disminuyen la Ea aún más que los catalizadores inorgánicos. Por ej, la descomposición del agua oxigenada (H2O2) puede ocurrir – sin catalizador Ea= 18 Kcal/mol – con un catalizador inorgánico (platino) Ea= 12 Kcal/mol – con una enzima específico (catalasa) Ea= 6 Kcal/mol Así, se puede calcular que el platino acelera la reacción 20.000 veces, mientras que la catalasa la acelera 370.000 veces. MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS Para que una reacción química tenga lugar, las moléculas de los reactantes deben chocar con una energía y una orientación adecuadas. La actuación de la enzima – aumenta la concentración efectiva de los sustratos (aumenta la probabilidad de choque) – permite que los reactantes (sustratos) se unan a su centro activo con una orientación óptima para que la reacción se produzca y – modifica las propiedades químicas del sustrato unido a su centro activo, debilitando los enlaces existentes y facilitando la formación de otros nuevos Modelo Llave-Cerradura  MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS Hay dos modelos sobre la forma en que el sustrato se une al centro activo del enzima: el modelo llave-cerradura el modelo del ajuste inducido  MODELO LLAVE-CERRADURA La estructura del sustrato y la del sitio activo son complementarias Este modelo es válido en muchos casos, pero no es siempre correcto  MODELO DEL AJUSTE INDUCIDO el centro activo adopta la conformación idónea sólo en presencia del sustrato. La unión del sustrato al centro activo del enzima desencadena un cambio conformacional que da lugar a la formación del producto. Modelo del Ajuste Inducido Perfil Energético de una Perfil Energético de una Reacción Espontánea Reacción Catalizada  Cofactores - Coenzimas A veces, un enzima requiere para su función la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catálisis: los cofactores. Pueden ser iones inorgánicos como el Fe++, Mg++, Mn++, Zn++ etc. Casi un tercio de los enzimas conocidos requieren cofactores. Cuando el cofactor es una molécula orgánica se llama coenzima.  Cofactores - Coenzimas Muchas de estas coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas. Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente al enzima se llaman grupos prostéticos. La forma catalíticamente activa del enzima, es decir, el enzima unida a su grupo prostético, se llama holoenzima. La parte proteica de un holoenzima (inactiva) se llama apoenzima, de forma que: apoenzima + grupo prostético= holoenzima Coenzima: NAD+ Deriva de la Vitamina B5 (ácido nicotínico) Coenzima: FAD Es grupo prostético Deriva de la Vitamina B2 (flavina) FAD forma oxidada FADH2 forma reducida CLASE 1: OXIDOREDUCTASAS  CINÉTICA ENZIMÁTICA La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. La velocidad de una reacción catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad de la enzima.  CINÉTICA ENZIMÁTICA MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inicial del sustrato sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los enzimas. MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA V = velocidad de la reacción catalizada por la enzima MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN V = velocidad de la reacción catalizada por la enzima  MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten es una hipérbola. La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.  La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parámetro cinético importante por varias razones: KM es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato (si k2 es el paso limitante): – a menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y – a mayor KM, menor afinidad. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: se mide en términos de velocidad La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.  Factores que afectan la cinética enzimática La actividad puede estar afectada por: el pH la temperatura la fuerza iónica Inhibidores  Efecto del pH Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino –NH2; etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica. Este es el llamado pH óptimo. La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína, los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos complejos para mantener estable el pH intracelular Efecto el pH Efecto de la Temperatura