BTIME - Gestion des prélèvements cellulaires et tissulaires, examen anatomopathologique PDF

# BTIME - Gestion des prélèvements cellulaires et tissulaires, examen anatomopathologique ## 09/10/24 - Séphira SAADALLAH - CR: Chede KAMMOUN - BTIME - Dr. Romain APPAY - 14 pages ## Gestion des prélèvements cellulaires et tissulaires, examen anatomopathologie ### Plan: - **A. Types de prélève...

# BTIME - Gestion des prélèvements cellulaires et tissulaires, examen anatomopathologique ## 09/10/24 - Séphira SAADALLAH - CR: Chede KAMMOUN - BTIME - Dr. Romain APPAY - 14 pages ## Gestion des prélèvements cellulaires et tissulaires, examen anatomopathologie ### Plan: - **A. Types de prélèvements..** - **I. Prélèvements cellulaires** - **II. Prélèvements tissulaires** - **III. Choix de l'examen** - **B. Transmission des prélèvements.** - **I. Fiche de renseignements....** - **II. Règles de conditionnement..** - **C. Techniques morphologiques.** - **I. Examen cytologique.** - **II. Examen histologique..** - **D. Biologie moléculaire.** - **E. Examen extemporané.** - **F. Conclusion.....** ### L'objectif du cours - Connaitre les grands principes de réalisation, transmission et utilisation des prélèvements transmis pour un examen anatomopathologique. - Savoir comment en anapath on fait pour établir un diagnostic. ### La note de l'UE - Comprise avec des TP qu'on aura au second semestre. - Les TP sont sur ordi dans les salles infos. - Nombre limité d'ordi, il faut impérativement aller dans son groupe de TP. - Contacter le responsable de l'UE en cas d'exception. - Les questions de l'examen concerneront uniquement les éléments marqués sur les diaporamas disponibles sur AMETICE. - Ce qui est dit à l'oral en plus, c'est de la « culture ». - Le contexte historique ne tombe pas à l'examen. ### Contexte historique - La médecine n'existe pas depuis toujours, le concept de maladie n'existait pas. - Il y avait un mélange entre maladie, croyances religieuses, magies et des balbutiements des premières notions médicales. - C'est en Grèce au Vème siècle avant JC où Hippocrate, le premier scientifique évoque le concept de la médecine et du diagnostic. - Hippocrate donne donc naissance à la médecine. - Hippocrate est le premier à évoquer le concept de la médecine mais pour lui c'était seulement un déséquilibre de 4 humeurs en lien avec les éléments. - Durant la renaissance avec notamment Léonard de Vinci et André Vésale, vient l'idée de regarder à l'intérieur du corps humain. - C'est durant la renaissance qu'on a eu les premiers anatomistes qui ont pratiqué les autopsies, décrit l'intérieur du corps humain, décrit des lésions macroscopiques et surtout rapporté des traités de maladies avec les descriptions anatomiques comme macroscopiques. - C'est donc un premier bond pour la médecine qui est passé de la médecine avec des déséquilibres d'humeurs en rapport avec les 4 éléments à des descriptions macroscopiques (organes malades). - Encore un peu plus tard on a Antoni Van Leeuwenhoek (il n'est pas scientifique mais un tailleur hollandais) il avait pour but de fabriquer des tissus de la meilleure qualité possible. - C'est dans ce but qu'il a eu l'idée d'associer des lentilles les unes avec les autres; ainsi il a créé le premier microscope. - Grâce à sa découverte il va ensuite découvrir l'existence du spermatozoïde, c'est d'ailleurs la première personne à avoir identifier une cellule (plus petite unité fonctionnelle du vivant). - Ainsi on est passé d'une échelle macroscopique durant la renaissance à l'échelle des cellules. - Au début du 20ème siècle vient Rudolf Virchow, grand médecin qui a donné son nom à des concepts anatomiques (espace de Virchow au niveau du SNC, la triade de Virchow qui sont le signe d'une hyperpolarité, le ganglion de Virchow). - En 1948, il a donné son nom à un traité: Pathologie Cellulaire étude physiologique et pathologique des tissus. - C'est un traité révolutionnaire de la médecine. - Il introduit un nouveau contexte: toutes les maladies du corps humain ont pour origine des altérations des cellules du corps. - Aujourd'hui, Rudolf Virchow représente le père de l'anatomopathologie, métier qui consiste à regarder au microscope les cellules et tissus malades ou non pour établir le diagnostic d'une maladie. ### Fin de l'introduction - Les notions sont à connaître. ### L'anatomopathologie - Spécialité médicale qui analyse aussi bien des prélèvements tissulaires que cellulaires. - Discipline médicale. - Permet de voir les anomalies à la fois microscopiques (cytologiques et moléculaires) pour arriver à établir un diagnostic, ainsi qu'avoir connaissance des anomalies macroscopiques, et moléculaires des états pathologiques. ### L'anapath - Au carrefour entre tous les cliniciens qui vont prendre en charge les patients, le prélèvement qui est envoyé sur lequel un diagnostic est établi et en étant en relation étroite avec toutes les spécialités qui sont biologiques. ### Trois missions de l'anatomopathologie: - **Établir un diagnostic:** nommer la maladie dont est atteint le patient. - **Pronostic:** une fois qu'on a identifié ce qu'a le patient, on va pouvoir évaluer à quel stade de la maladie le patient en est (évolution spontanée de la maladie). - **Théranostique:** c'est la capacité de la maladie à répondre à un traitement spécifique, il s'agit de trouver les traitements qui vont permettre de guérir de la maladie. ### Exemple d'une tumeur - Le diagnostic va permettre d'avoir le nom de la tumeur, son pronostic ça va être son évolution spontanée, bénigne ou maligne et son théranostique, le plus souvent des thérapies ciblées. ### /!\ Etude de tous les prélèvements réalisés sur le corps humain sauf les prélèvements sanguins !! - L'anatomopathologiste étudie absolument tous les prélèvements (cytologique: broncho-alvéolaire, urine, crachats...) réalise sur le corps humain sauf les prises de sang, les prélèvements sanguins et hématologiques qui est dédié aux hématologistes. ## A. Types de prélèvements - On peut recevoir deux types de prélèvements: cellulaires, tissulaires. - On les reçoit dans divers contenants (bocaux, lames...). ### I. Prélèvements cellulaires - Plusieurs types de prélèvements qui peuvent être effectués. - Liquides spontanément émis. Exemples : urines, les expectorations. - Lavage. Exemple : lavage broncho-alvéolaire, les cellules sont récupérées dans un liquide (sérum physiologique) qui est envoyé dans le poumon. - Ponction. Exemple : LCR, un kyste où on va enfoncer une aiguille et aspirer le liquide du kyste. - Brossage. Exemple: dépistage du cancer du col de l'utérus : frottis cervico-utérin ou frottis cervico-vaginal. - Ponction à l'aiguille d'un tissu. Exemple : nodules thyroïdiens. - On peut donc recevoir des prélèvements sur lesquels on va réaliser des examens cytologiques, soit des liquides ou des solides directement prélevés. ### II. Prélèvements tissulaires - La grande majorité du métier de l'anapath sont les prélèvements tissulaires. - Il existe 2 types de prélèvements : - Les **biopsies:** prélèvement d'une toute petite partie de la lésion ou de l'organe. - Plusieurs manières de faire des biopsies selon la spécialité médicale, chirurgicale. - Selon la topographie de la tumeur, ses outils, l'accessibilité... il y a plusieurs types de tailles de prélèvements biopsiques : - Biopsie à l'aiguille (très petite) - Biopsie au trocart - Résection endoscopique - Biopsie chirurgicale - Les **pièces opératoires:** qui sont des prélèvements plus volumineux quand on enlève de manière partielle ou totale une tumeur ou un organe. - Deux types de pièces : - **Tumorectomie:** on enlève uniquement la tumeur - **Exérèse totale:** on enlève en totalité l'organe touché ## III. Choix de l'examen - Le prélèvement qu'on va envoyer à l'anapath va dépendre de la balance bénéfice/ risque en prenant en compte 3 critères : - **Rentabilité diagnostique:** plus on envoie à l'anapath de tissus lésionnels, meilleur sera son diagnostic, on préfère toujours les prélèvements les plus volumineux possibles (on préfère la pièce opératoire que la biopsie que la cytologie) - **Objectif thérapeutique:** dépend du traitement, exérèse totale ? Dans ce cas on va retirer le poumon. Est-ce qu'il s'agit d'une lésion tumorale ou d'une lésion inflammatoire ? Dans ce cas on va prélever une petite partie. Est-ce qu'on n'en sait rien du tout? Dans ce cas on fait juste une cytologie pour avoir les premiers éléments d'orientation. - **Accessibilité:** la localisation (selon la localisation ou pourra la retirer ou non), c'est finalement une « contrainte de logistique ». - Il faut savoir qu'en anapath la rentabilité diagnostique sera d'autant plus importante qu'on voit beaucoup de matériel c'est-à-dire que dans un prélèvement cytologique on va uniquement voir si les cellules sont tumorales ou non, sur un prélèvement biopsique on commence à voir le rapport entre ces cellules et le tissu environnant (à proximité immédiate) et sur la pièce opératoire on peut vraiment voir la pathologie et tous ses liens avec tous les organes adjacents (du moins toutes les structures adjacentes de l'organe touché). - Donc, on sera plus à l'aise pour établir un diagnostic si le prélèvement est volumineux. - On va toujours privilégier les prélèvements de grande taille, mais naturellement ce n'est pas tout le temps possible, il faut bien prendre en compte l'accessibilité du prélèvement. - Il ne faut pas oublier que le geste réalisé dépend de l'objectif thérapeutique. - Exemple: tumeur du cerveau, ou proche d'une structure noble, il n'est pas possible de réaliser une exérèse totale de la tumeur, on se limite à une biopsie ou à un examen cytologique. ## B. Transmission des prélèvements - 3 règles impératives à suivre : - **Le prélèvement est toujours accompagné d'une fiche de renseignements** - **Respect des règles de conditionnement** - **Transmission dans les plus brefs délais** #### I. Fiche de renseignements - Remplie par le médecin qui a réalisé le prélèvement, elle est indispensable pour transmettre les informations au laboratoire car il ne connaît pas les patients, il est considéré comme un service. - Doit contenir : - Les informations administratives, pour relier le prélèvement au patient: mais également à la personne qui l'a réalisé. - Les renseignements techniques, importants pour vérifier le délai de transmission (à quelle date et à quelle heure a-t-il été réalisé ?), les types de conditionnement (Dans quoi ? Quel liquide ? Quelle fixation? Dans l'état frais ? Dans du sérum physiologique ? Dans du formol ?), et le type de prélèvement (cytologie, biopsie ou pièce opératoire), préciser les règles de conditionnement (toxicité...). - Renseignements médicaux, avec les infos indispensables: siège du prélèvement et quelques renseignements cliniques. - Avec les dossiers de patients informatisés, on ne demande plus systématiquement à ce que ce soit fait sur papier, mais cela reste néanmoins obligatoire, l'anapath doit savoir ce qu'il manipule (foie, peau, liquide...). #### II. Règles de conditionnement - Un organe dès qu'il est détaché n'est plus vascularisé, il ne peut plus vivre, il n'est plus intègre, cela entraine une autolyse des cellules (comme de la nourriture laissée sur le plan de travail, elle finit par pourrir) et on ne peut plus faire de diagnostic. - On est alors face à deux situations: - **Transmis en moins d'1h:** - Il peut rester à l'état frais, l'anapath le reçoit et l'analyse directement, cette modalité est obligatoire dans trois situations: - examen extemporané - immunofluorescence - biologie moléculaire (recommandations de l'Inca) - On n'ajoute rien, <<< on ne fait rien >> et on << l'envoie comme ça >>, juste dans un << pot >>. On ne rajoute rien ni du sérum physiologique ni de l'eau stérile. (D'ailleurs en anapath on ne travaille jamais avec du sérum physio ou de l'eau stérile). - **Transmis >1h (service d'anapath fermé par exemple, retard du bloc opératoire...) :** - Fixation au formol tamponné à 4% (pH= 7), pour éviter que le tissu << pourrisse », il permet de figer les protéines les unes avec les autres et fige le prélèvement ad vitam æternam dans l'état dans lequel il est conditionné. - Le formol est un produit toxique, cancérigène il doit être manipulé sous hotte aspirante, la quantité de formol doit être 10 fois plus importante que le volume de la pièce opératoire et le récipient doit être de taille supérieure au prélèvement (le formol rigidifie, donc si le prélèvement est coincé on ne peut plus l'analyser). - Le prof précise que le délai d'une heure est une approximation et qu'on ne jette pas un prélèvement qui n'a pas été fixé au formol et qui est resté une nuit dans le frigo, il peut toujours servir au diagnostic. - Le formol pénètre à l'intérieur du prélèvement en partant de la périphérie (1cm/24h), vers le centre, mais il n'arrive pas toujours à y pénétrer et il stoppe sa course plus tôt que voulu alors tout l'intérieur est nécrosé. - Même pour un prélèvement fixé au formol, il faut toujours l'envoyer dans les plus brefs délais à l'anapath. - Il faut alors optimiser le processus de fixation en conditionnant le prélèvement : - Organe creux: doit être ouvert ce qui permet au formol de pénétrer à l'intérieur (organes du tube digestif, la trachée, vésicule biliaire, utérus, vessie...), sinon l'intérieur de l'organe n'est pas fixé. - Organe plein: doit être coupé/tranché (rein) - Poumons: doivent être insufflés (on les gonfle via une canule et on envoie le formol « comme un ballon de baudruche ») - La fixation fait changer la teinte des organes (exemple du poumon qui est rouge dans le corps humain, devient brunâtre après fixation au formol). - Il faut donc fixer dans du formol (sauf dans les 3 situations évoquées plus haut) mais attention il faut que ça soit fait le plus rapidement possible dans le but d'optimiser le processus de fixation dans les temps. - Il faut également fixer suffisamment longtemps pour que tout l'organe soit irrigué et que toutes les protéines puissent se fixer les unes aux autres, cela dépend de la taille du prélèvement : - 6h-24h: les biopsies (petit prélèvement) - 24h-48h : les grosses pièces=pièces opératoires (juste pour que la pièce soit suffisamment fixée) - Ces délais sont importants à connaître, cela ne sert à rien d'appeler l'anapath 3h après lui avoir envoyé le prélèvement, il existe des contraintes de fixation des tissus qui sont incompressibles, ils sont donc obligés d'attendre 24 à 48h avant même de pouvoir regarder l'échantillon et commencer à travailler dessus. - Le prélèvement doit systématiquement être transmis le plus rapidement possible. ## C. Techniques morphologiques - L'objectif de ces techniques (cytologie comme histologie) sera de déposer in fine sur des lames de verre les cellules du prélèvement transmis et de les colorer afin de pouvoir les regarder et les analyser au microscope. ### I. Examen cytologique - Deux techniques : - **Pots sans fixateur:** directement prélever chez le patient puis mis dans un flacon ou tube (dans le cas des frottis on a un pot spécial) afin d'être envoyé en anapath, ils sont cytocentrifugés (on met le tube dans une machine, le flacon tourne très vite et toutes les cellules sont déposées sur une lame de verre). - **Pots avec liquide de transport:** (surtout fait dans le cas de dépistage du cancer du col de l'utérus) technique sensiblement différente, on ne centrifuge pas mais on réalise une aspiration du liquide qui passe à travers une membrane (filtration) et dépôt sur lame de verre (=lame blanche). Ces pots permettent de mieux préserver les cellules (les frottis cervico utérins sont essentiellement faits en ville donc ils ont besoin de mieux préserver les cellules). - Dans les deux cas, l'objectif final est le dépôt sur lame de verre. - Si on est dans une situation de brossage (un frottis), tout est directement étalé sur la lame sans technique supplémentaire. - En revanche, ces cellules sont transparentes, translucides (le corps humain est composé presque que d'eau) on ne peut pas les visualiser au microscope, il faut les colorer avec deux types de colorations : - **Coloration de Papanicolaou:** cellules épithéliales (utilisé en gynécologie+++, suspicion de tumeur épithéliale). - **Coloration de May-Grünwald Giemsa (MGG):** cellules hématologiques (inflammation versus non-inflammation). - Le choix de la coloration est juste une question de confort (le Papanicolaou nous permet d'apprécier les cellules épithéliales++) - Cet examen cytologique a comme principal avantage d'être très rapide : prélèvement reçu - cytocentrifugé - coloré examen direct avec une réponse apportée en quelques heures. - Le problème de l'examen cytologique est qu'il apporte des informations très limitées, on ne voit pas du tout le rapport des cellules entre elles ni avec le tissu. - Sur ces images on voit que le frottis nous présente seulement les cellules superficielles, tandis que la biopsie permet de voir l'architecture globale de tout l'épithélium. - L'examen cytologique de par ces informations limitées, est un examen utilisé uniquement pour le dépistage ou l'orientation (suspecter, orienter vers un diagnostic inflammatoire, tumoral...) et tout examen cytologique doit être confirmé par une biopsie. ### II. Examen histologique - Les prélèvements tissulaires (biopsies ou pièce opératoires) représentent la majeure partie du travail des anapaths. - Ils commencent toujours par un examen macroscopique lors de la réception du prélèvement. #### 1ère étape : Description macroscopique des pièces - On donne son aspect, sa taille, son poids, toutes les lésions qui sont observées, le nombre de biopsies reçues, on décrit absolument tout ce que l'on voit. - C'est très important pour faire la corrélation avec le compte rendu opératoire. - Il faut qu'il y ait une adéquation entre le nombre de prélèvements que dit avoir fourni le chirurgien et le nombre de prélèvements reçus. Ici, on travaille toujours sous une hôte aspirante à partir du moment où le tissu est fixé au formol. #### Pour les pièces opératoires - On observe les rapports entre la tumeur et les différents tissus avoisinants - Exemple: on nous transmet un rein et une surrénale, sur quel organe est située la tumeur et où précisément ? #### 2ème étape : Encrage - On encre les pièces à l'encre de chine de plusieurs couleurs qui reste intact tout le long du processus, on continue à le visualiser lors de l'observation microscopique. - L'objectif est de pouvoir orienter la pièce et évaluer les limites avant de les transmettre au chirurgien. Le chirurgien doit tout de même envoyer les pièces de manière orientée afin de faire un examen histologique cohérent (ex: il doit placer des repères anatomiques comme un fil long pour le bord interne, 2 fils courts sur le bord inférieur...) Le but de l'encre de chine est de permettre de s'orienter et connaitre les limites qui sont non-saines et éventuellement guider la reprise du geste chirurgical. #### 3ème étape : Échantillonnage - On ne peut pas regarder l'intégralité de l'organe, on doit sélectionner les zones d'intérêt, on fait un échantillonnage du matériel transmis. - On place dans des petites cassettes numérotées (avec un numéro d'identification + QR code pour la traçabilité) les zones pertinentes que l'on veut regarder au microscope. #### 4ème étape : Imprégnation et inclusion en paraffine - Le prélèvement doit être rigidifié dans l'optique d'être coupé et posé sur une lame de verre et être coloré en vue de l'analyse. Cela se déroule en plusieurs étapes : - **L'imprégnation:** - 1) Déshydratation avec de l'alcool qui remplace l'eau. - 2) Clarification avec du xylène qui remplace l'alcool. - 3) Imprégnation en paraffine qui remplace le xylène. - L'imprégnation est réalisée par des automates durant une nuit. Puis le prélèvement devient dur car toute l'eau a été remplacée par de la paraffine. #### 5ème étape : Inclusion dans un bloc - Étape manuelle, on doit maintenant l'inclure dans un bloc de paraffine, on le place dans de la paraffine liquide (chauffée), on le pose dans le moule avec la cassette par-dessus et on finit par le déposer sur une plaque réfrigérée qui durcit la paraffine. Puis on obtient un bloc de paraffine qui contient notre prélèvement. - (Le bloc est collé à la cassette qui contient le N° d'identification pour assurer la traçabilité) #### 6ème étape: Coupe - Notre tissu est rigide, on peut alors le couper à l'aide d'un microtome (coupe de 3 à 5 micromètres, très petit, pour comparer un GR correspond à 7-8 µm), on réalise des coupes de tissus extrêmement fines, ensuite on prend une lame de scalpel pour trancher le prélèvement qui avance, le technicien choisit la coupe la plus jolie et la dépose sur une lame de verre. - Ps: Lame blanche: coupe de tissu posée sur une lame de verre #### 7ème étape: Coloration - **Coloration standard** - Nos cellules sur la lame de verre sont transparentes, il faut les colorer, on utilise des automates qui réalisent des colorations standards d'anatomopathologie qui est la coloration HES en France (les premières lettres des 3 colorants utilisés), le colorant va colorer les substances protéiques : - 1) Hématoxyline: colorant basique, colore les noyaux en bleu. - 2) Éosine/Phloxine: colorant acide, colore le cytoplasme en rose. - 3) Safran: colore de manière non spécifique toutes les fibres de collagène en orange. - D'autres colorants sont utilisés c'est le cas de l'HE (partout dans le monde) versus l'HES (en France). - →L'HPS (utilisation de la phloxine, même chose que l'HES, sud de la France++). - En anapath on ne se limite pas à cette coloration standard, pour établir un diagnostic encore plus poussé on peut utiliser des techniques complémentaires à partir de la lame blanche. #### Techniques complémentaires : - Colorations spéciales - Il existe également des colorations spéciales, elles mettent en évidence des constituants particuliers, on révèle des éléments qui ne nous apparaissent pas en coloration standard. - Ne pas retenir le nom des colorations spéciales juste à titre informatif : >- Exemple le cas d'une hémochromatose (=accumulation de fer dans le foie): on fait un prélèvement hépatique et on observe au microscope, avec une coloration standard on ne voit pas directement le fer donc il nous faut une coloration spéciale: coloration de Perls >- Certaines colorations spéciales permettent de mettre en évidence des germes, des bactéries, des champignons... >- Le rouge Congo (pas à retenir pour ce cours mais c'est une spécialité des examens marseillais et tombe très souvent au concours national) est révélateur d'une maladie qui est l'amylose, c'est une maladie qui touche tous les organes. C'est un grand groupe de maladie qui entraine des défauts protéiques qui s'accumulent dans les tissus et entraine le dysfonctionnement de l'organe dans lequel la protéine se dépose. Pour en faire le diagnostic, on prélève l'organe malade et on informe l'anapath qu'on suspecte une amylose. Pour poser le diagnostic d'une amylose, l'anapath va utiliser une coloration spécifique: le rouge Congo. Cette coloration est rouge et donne une biréfringence jaune-bleue à la lumière polarisée. (c'est très joli au microscope mais c'est catastrophique pour le malade) >- L'immunomarquage : - On peut réaliser d'autres techniques plus particulières comme l'immunomarquage. - L'objectif est d'identifier une cible précise, donc pour voir cette cible on va devoir la colorer (avec un fluorochrome ou un chromogène). - L'immunomarquage c'est lorsqu'on utilise une réaction antigène/anticorps qui est dirigé vers une protéine d'intérêt. - Cet anticorps est marqué par un chromogène (=Substance susceptible de produire un pigment) ou un fluorochrome (=Substance qui produit une fluorescence), il se lie à la protéine d'intérêt et apparaît marron dans le cas d'un chromogène (microscopie conventionnelle/standard), ou fluorescent dans le cas d'un fluorochrome (microscope à fluorescence, on envoie un faisceau laser sur le fluorochrome et le fluorochrome possède la capacité de transformer le faisceau en fluorescence donc d'émettre de la lumière). | | Avantages | Inconvénients | |:------|:------------------------------------------------------------------------------------|-----------------------------------------------------| |Chromogène|Facilité d'interprétation<br>FFPE (Formalin-Fixed Embedded, prélèvement fixé au formol et inclus en paraffine)<br> Sensibilité ++++ | Peu sensible | |Fluorochrome| | Microscope fluorescent<br>Congelé (état frais) | - Dans le cas de l'immunofluorescence il ne faut pas que le tissu soit fixé au formol et inclus en paraffine (car la paraffine émet de la fluorescence à l'état normal donc fausse le résultat). - Avec l'immunofluorescence c'est beaucoup plus sensible donc on pourra voir les plus petits défauts. - **Exemples de technique complémentaire qui utilisent ces 2 colorants :** - L'immunohistochimie : technique complémentaire qui permet d'identifier les protéines grâce à des anticorps et à la réaction AG/AC où on a une protéine cible, qui correspond à l'antigène et l'AC marqué va être dirigé contre cette protéine cible. Et donc l'AC sera marqué d'un chromogène et dans ce cas on pourra directement voir la protéine avec un microscope standard. L'immunohistochimie est le premier examen complémentaire en anatomopathologie. (On l'utilise quasiment 100% du temps) >- L'immunofluorescence: prélèvement en état frais (à retenir attention), on ne va pas fixer au formol on va juste réaliser une coupe sur le prélèvement congelé, l'AC sera marqué avec un fluorochrome et dans ce cas on utilisera un microscope à fluorescence, c'est le cas des pathologies rénales et dermatologiques + qui sont des pathologies auto-immunes associées à des dépôts protéiques/d'immunoglobulines. - **L'hybridation in situ ou HIS** - Un principe un peu similaire mais différent sur la technique réalisée : la technique d'hybridation in situ. - Le but est d'identifier une séquence d'acide nucléique, qui peut être de l'ADN ou de l'ARN. - On utilise une sonde marquée par un chromogène (on perçoit le pigment) ou par un fluorochrome (fluorescence émise). - **On parle de CISH (Chromogenic In Situ Hybridization) lorsqu'on réalise cette hybridation avec un chromogène ou FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) lorsque la sonde est marquée par un fluorochrome.** - On préfère utiliser des chromogènes sauf quand la sensibilité du chromogène n'est pas suffisante, dans ce cas on passe sur du FISH mais les utilisations sont beaucoup plus complexes. On ne nous demandera jamais à quel moment on réalise une FISH ou un CISH. - **Question: Quand on veut cibler un gène on doit utiliser une sonde en ADN complémentaire ?** - **Réponse: Exactement, la sonde est de l'ADNc sur lequel on a notre marqueur (chromogène ou fluorochrome).** - **Non-dit cette année :** - La technique d'hybridation in situ permet de remplacer la biologie moléculaire puisque ça permet de voir l'ADN des cellules de la tumeur identifiée. On voit ainsi des amplifications, des délétions, des réarrangements de gènes. - On peut aussi utiliser une sonde contre certains virus ou mettre en évidence des immunoglobulines plasmocytaires. - **Question: Pour la FISH on utilise des fluorochromes, il faut utiliser des marqueurs fluorescents? Oui point très important, avec la FISH on a également les inconvénients des marqueurs fluorescents. C'est bien pour voir les petites régions du génome, donc une haute sensibilité mais en revanche le prélèvement doit être à l'état frais + un microscope à fluorescence.** ## D. Biologie moléculaire - La biologie moléculaire est assez récente, son essor est au début du 21ème siècle avec le séquençage de tout le génome. - La biologie moléculaire correspond à toutes les techniques qui permettent de comprendre les altérations moléculaires de la cellule c'est-à-dire les altérations qui ont lieu au niveau de l'ADN/ARN. - On est plus à l'échelle de la cellule mais à l'échelle de l'ADN. - C'est ce qui permet d'identifier les anomalies génétiques qui seront capitales pour poser le diagnostic, qui sont liées à l'oncogenèse et à la genèse et la progression des tumeurs. Le rôle de l'anapath est très important en oncologie. - On a aussi bien des biomarqueurs diagnostics (type histologique, tumeur caractérisée par telle ou telle altération), que des biomarqueurs pronostics (grade histologique, pas de traitement spécifique, mais indique si la tumeur va évoluer plus ou moins rapidement) et enfin des biomarqueurs théranostiques (=cibles thérapeutiques, l'altération moléculaire ciblée par un traitement on parle de thérapies ciblées). - Techniques morphologiques : - On connaît déjà l'immunomarquage et l'HIS, deux techniques très pratiques car elles peuvent être réalisées très rapidement en anapath, avec un résultat quasi immédiat : - Avec l'immunomarquage, on peut diriger un AC contre une protéine mutante. Si on a une mutation dans le génome = un gène mutant, on aura un ARN qui va entrainer la synthèse de la protéine mutante. - →Donc si l'AC détecte cette protéine, on peut conclure qu'il y une mutation au niveau du gène. - Dans le cas de l'HIS: on réalise une séquence complémentaire de la région qui nous intéresse et on ajoute notre marqueur fluorescent. - Elles offrent une très grande sensibilité mais le nombre de cibles analysables est très limité car toutes les altérations et tous les gènes n'ont pas forcément d'anticorps dédiés, on est limités dans le panel d'altérations que l'on peut screener sur une coupe de tissu. - Techniques biologiques: (biologie moléculaire pure et dure) - Quand on veut réaliser des examens beaucoup plus exhaustifs, on utilise des techniques biologiques, réalisées à partir d'une extraction d'ADN ou d'ARN, on peut l'extraire aussi bien à partir de tissu congelé que de tissu fixé et inclus en paraffine. - En pratique, c'est compliqué d'avoir du matériel congelé d'ailleurs on ne congèle pas du matériel fixé au formol. Le plus souvent l'anapath reçoit des prélèvements fixés au formol. - Heureusement, il y a les techniques biologiques qui nous permettent d'extraire l'ADN/ARN à partir de tissu fixé au formol et inclus en paraffine. - Le principe reste le même, on va réaliser notre lame blanche mais au lieu de la colorer, on l'envoie au biologiste qui va gratter le tissu et extraire l'ADN/ARN. - /!\ Le plus gros problème est que suite à la fixation au formol et l'inclusion en paraffine, l'ADN est dégradé partiellement, il se fragmente et dévient beaucoup plus difficile à lire. -IMPORTANT A RETENIR (insiste vraiment dessus et a dit qu'il allait l'ajouter aux diapos) : - Il est possible de réaliser des analyses de biologie moléculaire sur un prélèvement fixé au formol. Ainsi, même après un diagnostic de cancer, il est envisageable de demander à l'anapath de rechercher une altération moléculaire. Toutefois, l'ADN extrait de ce type de prélèvement est généralement de moins bonne qualité. - C'est pourquoi, pour certaines pathologies, l'INCa (Institut National du Cancer) recommande de congeler des échantillons de tissu. Cette précaution permet, si une nouvelle technique détectant des altérations moléculaires nécessitant de l'ADN de très bonne qualité est développée, de garantir que ce matériel sera disponible. Il s'agit d'un principe de précaution majeur. La congélation est obligatoire. -Un exemple à retenir +++: celui des tumeurs pédiatriques. La congélation est obligatoire +++ - Si un futur traitement innovant exige de l'ADN de haute qualité, la congélation de matériel biologique garantit une certaine sécurité et limite les pertes de chances pour le patient. - **Questions:** - **Quand on congèle l'échantillon on peut le garder combien de temps?** tout le temps, indéfiniment. - **Les cellules sont intactes après congélation?** non elles sont détruites. On ne congèle pas pour la cytologie/morphologie mais vraiment pour le génome et la biologie moléculaire. - **On congèle à quelle température?** soit -130° dans l'azote liquide (le prof dit -130° mais en réalité c'est -197°) soit à -90° dans des congélateurs. (On s'en fou) - Exemple concret dans le cadre du cours : ces dernières années, il y a un projet national avec des séquenceurs très puissant qui permettent de séquencer l'intégralité du génome, ce qui a permis aux oncologues d'identifier des cibles thérapeutiques. Mais le problème c'est qu'il fallait de l'ADN de très bonne qualité donc congelé. Donc seulement les patients avec de l'ADN congelé ont pu bénéficier du séquençage du génome complet. ## E. Examen extemporané - Il s'agit d'un examen anatomopathologique un peu particulier, il est effectué au cours de l'intervention chirurgicale, pendant que le patient est encore sous anesthésie, et dont le résultat doit conditionner la suite de l'intervention. (On évite les examens extemporanés de courtoisie=ne conditionnent pas la suite de l'intervention) - On va juger : - **La malignité de la tumeur** (le chirurgien veut limiter l'exérèse à la tumeur si elle est