Bloc 1 Industria Biotecnologia Farmàcia PDF

4t curs Farmàcia BIOTECNOLOGIA FARMACÈUTICA: INDÚSTRIA BLOC 1: BIOTECNOLOGIA VEGETAL TEMA 1: Les plantes com a eina biotecnològica Caracterís:ques de la cèl·lula vegetal Estructurals: tenen paret, vacúol (ocupa tot el citosol) i...

4t curs Farmàcia BIOTECNOLOGIA FARMACÈUTICA: INDÚSTRIA BLOC 1: BIOTECNOLOGIA VEGETAL TEMA 1: Les plantes com a eina biotecnològica Caracterís:ques de la cèl·lula vegetal Estructurals: tenen paret, vacúol (ocupa tot el citosol) i cloroplasts. Metabòliques: produeixen metabòlits secundaris. Produeixen sucres, AG, proteïnes... (això ho fan totes les cèl·lules de tots els organismes). Són essencials per la supervivència de la cèl·lula i estan presents en qualsevol organisme viu. Genè:ques: les cèl·lules vegetals diferenciades (somàGques) són to:potents. Retenen tota la informació genèGca requerida per generar una planta completa. Metabòlits secundaris Les cèl·lules vegetals són capaces de produir compostos que no es produiran a totes les espècies. Aquests són els metabòlits secundaris i es formen a parGr del metabolisme primari. Els principals grups són: alcaloides, polifenols i terpens; i no es produeixen sempre sinó que s’ha d’arribar a un determinat estat de diferenciació cel·lular, són específics de determinats gèneres o espècies i no es produeixen en tot el desenvolupament de la planta. Són productes de defensa i de cara al medi ambient. Si s’acumulen en gran quanGtat al citoplasma poden ser tòxics per la cèl·lula pel que s’acumulen en comparGments (per ex. al vacúol). D’on procedeixen els fitofàrmacs? Els productes terapèuGcs són molt importants, a part de ser principis acGus de medicaments, també són importants anGmicrobians, enzims, saboritzants, colorants... els fitofàrmacs són compostos del metabolisme secundari (alcaloides, polifenols i terpens), que alhora provenen del met primari. Tipus de gens del metabolisme secundari Gens estructurals: codifiquen per enzims biosintèGcs. Aquests enzims només es sinteGtzen en determinats moments i en determinades parts de la planta, és un procés regulat. Gens reguladors: regulen l’expressió de gens estructurals. Altres gens: codifiquen proteïnes que controlen la síntesi i el flux de precursors o cosubstractes, o faciliten l’acumulació o l’excreció dels metabòlits secundaris. Quan manipulem l’expressió d’aquests gens es fa amb l’objecGu d’obtenir canvis a nivell qualitaGu o quanGtaGu en la biosíntesi de metabòlits secundaris. Les plantes com a font de metabòlits secundaris d’interès comercial Aquests metabòlits poden servir d’insecGcides, herbicides, proteases, fragàncies... l’aparició de noves estructures químiques és relaGvament baixa. - 75% de noves estructures químiques són d’origen vegetal - 25% dels medicaments produïts a la indústria farmacèuGca són d’origen vegetal - 10% dels compostos produïts per plantes estan caracteritzats químicament, i només es té un bon coneixement del 2,3% de la totalitat d’espècies vegetals Aquests números són molt baixos perquè el nombre d’espècies vegetals que coneixem és molt baix. SISTEMES DE PRODUCCIÓ DE FITOFÀRMACS Per obtenir un compost que Gngui acGvitat terapèuGca hi ha diferents rutes. Per exemple, en el cas del taxol (compost pel tractament del càncer) el podem obtenir a parGr de: 1  4t curs Farmàcia Síntesi química Cul:u tradicional Producció biotecnològica 20 etapes i és (si és d’origen vegetal): Hemisíntesi de MS a parGr de compostos intermediaris molt car, culGu de plantes i obGnguts amb la manipulació de parts de plantes. Es fa en econòmicament posterior extracció dels casos en que: inviable. MS (pel que no és · Preu del compost d’interès sigui elevat recomanable en casos que · Producció especifica del compost ha de ser major que la es produeixen molt poca planta intacta sencera quanGtat del producte). En · La recuperació del producte d’interès ha de ser fàcil el Taxol s’acumula a · Producció estable en culGus cel·lulars l’escorça de l’arbre del tejo · No sigui fàcil d’obtenir per síntesi química (no rentable) pel que implica 7 arbres · Què hi hagi un escalat facGble (el compost primer a peGta que tarden molt en créixer. escala) Sistemes de producció biotecnològica (fonaments en la to7potència) El cloroplast: té membrana que separa i també hi ha un metabolisme 2a més ac8u, per això, una gran quan8tat de compostos amb beneficis per la salut es produeixen allà. Si parlem de la obtenció de cul8us de cèl·lules i òrgans és important el concepte de to7potència cel·lular (recordar que qualsevol cèl·lula vegetal, somà8ca, diferencial és to8potent en major o menor grau; això vol dir que a par8r de qualsevol cèl·lula puc ser capaç de, en unes condicions adequades, fer que la cèl·lula es reembrionitzi i torni a generar una planta sencera). - Cultius cel·lulars: poden ser de cèl·lules aïllades/suspensió o cèl·lules immobilitzades - Cultius d’òrgans: Depèn on es sintetitza el compost, hi ha molts metabòlits 2a que es sintetitzen a una part però s’acumula en una altra; però ens interessa ON es sintetitza: arrels o brots. Obtenció de cul:us cel·lulars Com ho fem: tenim una planta d’interès d’on obGndrem un teixit de call i posteriorment un culGu de cèl·lules en suspensió. Després es fa l’escalat. Passo de culGu a peGta escala a bioreactor. A. Inducció del call Es selecciona la planta que produeix el compost que volem à es tria l’explant à es posa en medi de culGu à formació del culGu de call que seran les cèl·lules que es dividiran, creixeran i es diferenciaran. El medi de culGu és sòlid i conté: - Elements minerals necessaris pel creixement de la planta - Un sucre ja que no hi ha fotosíntesi per produir-lo - Aminoàcids - Vitamines - Reguladors del creixement - Gelificant En afegir sucres al medi, cal treballar en condicions asèp:ques: es treballa sota una cabina de flux laminar, en medis de culGu estèrils i amb explants estèrils (es sotmeten a banys d’agents esterilitzants i posteriorment es renten amb aigua desGl·lada per eliminar els anteriors). Un cop obGngut el teixit de call, s’ha de separar de l’explant original i traspassar a una nova placa amb el mateix medi de culGu (afavoreix el creixement). B. Establiment de la suspensió cel·lular i cul:u bioreactor 1. Disgregació del call i establiment de la suspensió: addició del call a un medi líquid en constant agitació verGcal (150 rpm) → per facilitar aquest pas, és interessant que el teixit de call sigui el menys compacte 2  4t curs Farmàcia possible, i això es fa variant les hormones emprades. (p ex. L’auxina 2,4-D indueix la formació de calls amb aquestes caracterísGques = molt friables). Flascons agitants: contenen peGts volums i s’empren per estudiar si l’escalat a bioreactor serà facGble (?) 2. Escalat en bioreactor: disposició de la suspensió en bioreactors més grans. Objec6u: conèixer les condicions idònies perquè es disgreguin les cèl·lules, cal tenir en compte aspectes com: - Taxa de creixement: ha de relaGvament ↑ (tot i que mai arriba a assolir un valor similar a la dels MC dels bacteris) - Volum del inòcul inicial: ha de ser el ↓ possible (requereix l’alta taxa de creixement) - Mida i agregació de les cèl·lules: no convé que les cèl·lules esGguin agregades, fet que aconsegueix tamisar les suspensions cel·lulars - Oxigenació: necessitem tenir culGus que Gnguin oxigen i per això volem deixar un espai d’aeració (sense suspensió) - Agitació: no es formen agregats i afavorim l’oxigenació. Si hi ha paret, la velocitat ha de ser ↓ per evitar trencament!! Sistemes d’op:mització de la producció 1. Selecció de línies cel·lulars altament produc:ves 2. Op:mització dels medis de creixement i producció actuant envers els components del MC. Hi ha medis de creixement o medis de producció 3. Addició de precursors biosintèGcs 4. Inducció de les rutes metabòliques secundaries mitjançant elicitors, que poden ser abiòGcs o biòGcs, acGven la ruta 2ària 5. Esnmul de l’alliberament del compost d’interès al medi de cul:u, és més fàcil extreure-la si està en medi líquid que si s’ha d’extreure de la cèl·lula Per dur a terme la producció biotecnològica hi ha unes jusGficacions: - Compost amb un elevat valor afegit (>500€/kg) - Compostos amb un elevat rendiment d’obtenció (1-2 mg prod/L/dia) Metodologia per l’obtenció de línies cel·lulars amb elevada capacitat de produir compostos 2aris d’interès 1. Selecció planta amb una capacitat de producció superior 2. Selecció de l’explant en base a 2 criteris: capacitat de produir biomassa (“bon creixement”) i velocitat a la qual ho fa (a part de produir el compost d’interès) 3. Establiment del cul:u de call 4. Establiment de la suspensió cel·lular 5. Selecció de la suspensió cel·lular més producGva 6. Extensió de la suspensió cel·lular en un nou medi de culGu → permet la formació de nous calls a parGr de cèl·lules aïllades, els quals donaran lloc a les línies cel·lulars 7. Selecció de les línies cel·lulars altament producGves 8. Desenvolupament de nous cul:us cel·lulars en un medi líquid → una part s’usa per determinar la producció del conGngut d’interès i una altra per estudiar-lo 9. RepeGció del pas 6 (Extensió) amb les línies cel·lulars triades, per tal de seleccionar-les 3  4t curs Farmàcia L’obtenció d’una línia altament producGva pot ser el resultat de: - Canvis fisiològics: són deguts a la presència de certs factors en el medi, i reverteixen quan se separa el factor inductor. Per tant, és essencial mantenir les [ ] dels compostos quan es té una línia que produeix molt - Canvis epigenè:cs: són els que no reverteixen pel canvi de condicions del medi. No són deguts a una mutació sinó a una acGvació de gens prèviament inacGus (canvis en la cromaGa). Només es transmeten via mitosi o divisió cel·lular. Hi ha alteracions de l’expressió gènica. - Canvis genè:cs: o mutacions. Són canvis estables i heretables via meiosi, és a dir, via sexual. Op:mització dels medis de creixement i producció Hi ha 3 fases: de retard, exponencial i estacionària. Tendeix a presentar un creixement més lent (dies) en comparació amb el creixement dels bacteris (minuts). Retard perllongada Exponencial Estacionària No divisió cel·lular, la cèl·lula es Hi ha divisió cel·lular pel que Ja no hi ha creixement i en la major part dels prepara per la fase exponencial. Hi incrementa la biomassa. cul>us s’observa producció de metabòlits 2aris. ha duplicació de DNA i síntesi de No hi ha producció de L’E ja no va cap a la producció de met 1aris sinó RNA i proteïnes necessaris perquè metabòlits 2aris. Les cèl·lules que es formen els met 2aris a par>r dels la cèl·lula >ngui una ac>va divisió fan servir fonts d’E i C per precursors que han format en la fase cel·lular en la següent fase. produir els metabòlits 1aris exponencial els met 1aris. Per opGmitzar aquest procés cal assolir un equilibri entre la producció de biomassa i els compostos d’interès, fet que es resol amb la creació de culGus en 2 fases: 1. CulGu de les cèl·lules en un MC de creixement → opGmitza formació biomassa 2. CulGu de les cèl·lules en un MC de producció → opGmitza la producció de MS (es fa després d’obtenir el culGu amb la quanGtat de biomassa necessària) Factors que afecten Afecten al medi de creixement i al de producció. - Llum: normalment es fan en fosc, excepte aquells MS que es sinteGtzen als cloroplasts Ambientals - Tª: 21-25ºC - Agitació Font de Carboni: sacarosa, glucosa, fructosa... Limitació de N i fosfats: desfavoreix al creixement cel·lular (fase 1) degut a la falta de Nutrients macronutrients, però afavoreix la producció de MS atès que actua com un estrès abiòGc que indueix certes rutes metabòliques 2aries Relació C/N: afavoreix o desfavoreix els processos en funció de l’espècie PGRs, fitohormones: afecten al creixement i a la producGvitat. - Cinines: Kin, BAP, ZeaGna... Reguladors - Auxines: AIA, ANA, 2,4-D... aquest úlGm indueix la formació de calls friables però creixement desfavoreix la producció de compostos secundaris Cal provar diferents combinacions i concentracions d’hormones per trobar el més òpGm. Factors que permeten op:mitzar només la producció dels medis de cul:u a. Addició de precursors: requereix del coneixement de les rutes metabòliques, atès que aquests productes no han d’estar gaire allunyats del producte final (en el context de la ruta metabòlica) ni en un pas pròxim a una ramificació d’aquestes. Han de ser de ↓cost i ↓toxicitat (evitar inhibir la producció). A més, cal destacar que l’addició de precursors pot afavorir més la producció de determinades línies cel·lulars (siguin ja les òpGmes o d’altres descartades abans). 4  4t curs Farmàcia b. Addició d’elicitors: compostos que acGven una ruta metabòlica determinada i que, degut a aquesta caracterísGca s’han d’afegir al FINAL de la fase exponencial. Poden ser: Biò:cs Abiò:cs Jasmonat, MJ (MeGl-Jasmonat): principals hormones vegetals que UV, pH, estrès osmò:c (p.ex. regulen la resposta d’estrès davant patògens Gpus microbi. AcGven la amb mannitol) i lesions ruta metabòlica de certs composGs (p.ex. citoadhesines). cel·lulars (no es recomanen ja Quitosan (compost de la paret dels fongs) que desfavoreixen la Àc. Araquidònic (compost de la paret dels fongs) producció). A l’hora de triar i afegir els elicitors cal tenir en compte un seguit de criteris: - Especificitat de l’elicitor: per evitar una determinada ruta metabòlica - Concentració: depèn del culGu cel·lular - Moment d’addició - Duració del tractament: si s’excedeix, es poden generar efectes tòxics sobre el culGu de cèl·lules - Concentració criGca de l’elicitor: concentració en què s’observa un pic de la producció del compost d’interès i a parGr de la qual es poden donar efectes tòxics (si s’afegeix superior a aquesta) Esbmul de l’alliberament del compost d’interès al medi de creixement, MC Això facilita molt l’extracció, la qual encareix molt el procés. En una cèl·lula vegetal els compostos 2aris tendeixen a acumular-se en la vacuola o en les parets per evitar efectes de retroinhibició i toxicitat. Quan el compost està acumulat a la vacuola, d’una manera o altre es busca permeabilitzar les membranes (tant la vacuolar com la plasmàGca) per afavorir l’alliberament del compost cap al medi de culGu. Qualsevol dels mètodes emprats han d’afavorir la formació de porus per tal que es promogui la sorGda del compost. La tècnica ha de ser poc agressiva per mantenir la viabilitat de les cèl·lules (igualment algunes no seran viables). Per permeabilitzar les cèl·lules hi ha mètodes €sics i químics. Químics Físics - Dissolvents orgànics: isopropanol - Ultrasons - DMSO - Electroporació - Detergents no iònics S’apliquen corrents de baixa intensitat als cul8us - Quitosan (també elicitors)!! cel·lulars obtenint la permeabilització. CULTIU DE CÈL·LULES IMMOBILITZADES Es té una suspensió cel·lular, i a parGr d’ella es poden immobilitzar les cèl·lules, mitjançant matrius inertes, per dos sistemes. Microencapsulació Adhesió S’afegeixen als culGus cel·lulars diferents compostos viscosos que S’afegeixen al culGu de cèl·lules formen una coberta al voltant de les cèl·lules; permetent que les unes matrius inertes que poden cèl·lules quedin unides entre elles. ser escuma de poliuretà o fibra a. Alginat (1-2%): per si sol no polimeritza, sinó que s’afegeixen de vidre buida; actuen com una sals de Ca2+ a una [0,2-0,3]M per tal que polimeritzi. matriu sobre la qual s’adhereixen b. Carraguenines (3%): polimeritzen al afegir K les cèl·lules. Com si fos una c. Agarosa al 3% esponja, les cèl·lules es posen als d. Agar al 2-5% porus. Les cèl·lules s’han d’immobilitzar al final de la fase exponencial – per evitar el trencament de les microcàpsules i les matrius inerts amb el creixement cel·lular. És important que aquestes puguin alliberar el compost d’interès al medi de culGu ja que, si no és així, caldria desmuntar el sistema sencer per tal d’extreure’l. 5  4t curs Farmàcia *Substàncies produïdes durant la fase exponencial (p. ex. betalaïnes i carotenoids): no es poden obtenir en cul6us de cèl·lules immobilitzades. Tipus de sistemes de producció de cèl·lules immobilitzades - En columna: segueix un flux verGcal - En llit pla: segueix un flux horitzontal Els dos sistemes estan compostos per 3 recipients: el d’entrada de les cèl·lules, el que conté el medi de culGu i el de sorGda de producte d’interès; i 2 bombones peristàlGques, que faciliten l’addició de precursors i elicitors al medi i l’obtenció dels productes secundaris. Avantatges dels cul:us cèl·lules immobilitzades - El procés es pot desenvolupar de forma conUnua, mentre el producte sigui alliberat de les cèl·lules al medi de cul8u (factor molt important, ja que sinó no es poden fer). - Permeten fer canvis del MC: es poden addicionar o eliminar compostos de manera fàcil i rapida (p.ex. precursors o elicitors) - Ús eficient de rela7vament baixes quan7tats de biomassa - atès que es treballa amb cèl·lules en l’etapa de producció (estacionària) i no de creixement. - Les cèl·lules poden ser immobilitzades fàcilment - Gràcies a l'existència d'una matriu inert, es pot aconseguir la diferenciació bioquímica o estructural requerida per la producció d’alguns MS (“com si es tractés d’una planta” CULTIUS D’ÒRGANS El òrgan que hauré de culGvar és on es dona la biosíntesi i NO on s’acumula el producte secundari. Alguns PS no es poden aconseguir a través de culGus cel·lulars ja que la seva síntesi té lloc exclusivament en òrgans diferenciats (per ex: la berberina, els èster de bornil, la hiosciamina i l’escopolamina es generen a les arrels). Cul:us d’arrels Arrels normals: arrels tallades d’una planta i dipositades en un medi de culGu, les quals presenten un ↓creixement (es pot incrementar amb l’addició d’auxines) i/o una ↓producció (es pot veure afectada per l’addició d’auxines) Arrels transformades: arrels infectades pel bacteri del sòl Agrobacterium rhizogenes, les quals presenten un creixement accelerat i desmesurat que dona lloc al fenomen de “arrels de cabellera” → segueixen creixent després de l’eliminació del patogen. Mecanisme de transformació i obtenció d’arrels transformades Es va veure que afegint auxina, s’augmenta un xic la velocitat però que aquesta hormona també fa que la producció sigui més baixa. Agrobacterium rhizogenes infecta a la planta i en el punt de infecció es formen arrels molt llargues i ramificades. Es dona el síndrome d’arrels en cabellera. Si s’elimina l’agent infectant (la bactèria), les arrels es segueixen formant i segueixen creixent. D’aquí es dedueix que el microorganisme ha introduït part del material genèGc a la planta, responsable de la formació d’aquestes arrels. Per tant, les arrels que creixen per la infecció d’agrobacterium s’anomenen arrels transformades. Aquest bacteri té un DNA cromosòmic i un DNA plasmídic (plasmidi Ti) inductor d’arrels. Dins del plasmidi Ti hi ha gens Vir (de virulència) i el tDNA que és la part que s’insereix a la cèl·lula vegetal, s’incorpora en el genoma de la cèl·lula vegetal i fa que es formin arrels. 6  4t curs Farmàcia Dins dels gens que es troben el tDNA hi ha: Responsable de la formación d’arrels. - RolA: codifica per una proteïna que es troba en la ruta de senyalització de la resposta a auxines que incrementa la sensibilitat a les auxines. Gens - RolB: s’encarrega de la hidròlisi dels conjugats de les auxines. Les auxines es transporten rol conjugades però en aquesta forma no són funcionals. Allibera auxines en forma acGva - RolC: hidrolitza els N i O- conjugats de citoquinines → incrementen els nivells de citoquinines acGves. Gens Implicats en la síntesi d’opines i altres implicats en la sintesi d’auxines. En aquest cas tenim un clon estable pel que no caldrà la opGmització. Cul:us d’arrels transformades: 1. Establiment: es fa un explant d’una planta producte del compost d’interès i s’infecta amb Agrobacteri 2. Aïllament de clons i selecció 3. OpGmització de les condicions de producció 4. Escalat en bioreactors Avantatges dels cul:us d’arrels transformades - Poden créixer ràpidament en un culGu sense fitohormones (compostos de síntesi que s’afegeixen). - Els nivells són més constants, reproduïbles i predicGbles, ja que, en els culGus d’arrels es produeixen exactament els mateixos compostos que en l’arrel mare. En el cas dels culGus de cèl·lules, quan es divideixen, poden haver canvis en la producció de compostos. - Estabilitat genèGca durant llargs períodes de culGus. - CulGu a gran escala sense pèrdua de la capacitat biosintèGca Avantatges dels cul:us IN VITRO de cèl·lules i d’òrgans vegetals - Tecnologia poc contaminat, genera pocs residus, molts menys que un cul8u a nivell de camp. - Evita l’ex8nció d’espècies vegetals. Són espècies que es produeixen en poca quan8tat, i per això s’evita la pèrdua de les espècies, si es cul8ven in vitro. - No s’han d’emprar herbicides ni pes8cides - Són independents de factors externs, ambientals (temperatura, sequera, plagues) però també de factors geopolí8cs i socials, que a vegades impedirien importar espècies o productes d’un lloc a l’altre. - Per tant, és possible recol·lectar el compost desitjat en qualsevol part del món, amb un control estricte del control i qualitat del compost. - Els cicles de cul8u són de setmanes i no d’anys com passa en la planta intacta, fet que facilita la producció - Permeten establir processos de biotransformació dependents d’enzims vegetals. En el cul8u de cèl·lules immobilitzades o d’arrels, es poden establir biotransformacions, d’un compost es passa a un altre, ja que els cul8us presenten uns determinats enzims vegetals. Seqüència d’op:mització d’un procés per la producció de metabòlits 2aris en cul:us IN VITRO Seria comú per cul8us de cèl·lules i d’arrels. 1. Seleccionar la planta amb el con8ngut de metabòlits secundaris adients per iniciar el cul8u in vitro 2. Establir el cul8u in vitro 3. Estabilitzar i seleccionar el cul7u in vitro: s’ha de seleccionar velocitat de creixement (la més ràpida posible), que el compost s’alliberi al medi, també en el cas del cul8u d’arrels... 4. Op7mització del MC per la producció mitjançant disseny factorial: nutrients, precursors, elicitors, alliberació i recol·lecció in situ del producte... 5. Op7mització en bioreactors, l’escalat. Aquí s’op8mitzen diferents sistemes de cul8u (batc, con8nu, fed- batch) com també l’extracció i purificació del producte d’interès 7  4t curs Farmàcia TEMA 2. Sistemes de producció en dues fases. Escalat de bioreactors i producció industrial Bioreactor: sistema (recipient) per fer créixer cèl·lules o teixits que manté un ambient biològicament acGu (medi de culGu opGmitzat per a la producció del metabòlit d’interès a gran escala). Els bioreactors que s’empren en el culGu de cèl·lules vegetals es van adaptar a parGr dels que s’empraven en cèl·lules bacterianes. Control de condicions (cel·lulars i bacterians) Agitació 100 rpm. En cèl·lules vegetals ha de ser baixa per evitar el seu trencament Aeració, Aprox 50% d’oxigen dissolt. S’aporta el O2 amb una vàlvula pressió d’O2 Temperatura Aprox 25ºC. Bacteris a 37ºC Poca, si es forma s’ha d’eliminar → ultrasons o anGespumants (silicona, polipropilè). Si hi Escuma hagués molta escuma seria degut a una contaminació. pH Aprox 5’8 Estudi compara:u dels cul:us microbians i de cèl·lules vegetals Bioreactors: adaptacions pel cul:u de cèl·lules vegetals És important remarcar que la variable + important dels MC cel·lulars és l’agitació (factor de transferència de massa): - Assegura el subministrament de nutrients a totes les cèl·lules del MC (Homogeneïtzació) - Evita la sedimentació de les cèl·lules (en especial, dels agregats d’aquestes) - Assegura la transferència de gasos arreu del medi - Facilita la solubilització de components vegetals AGITACIÓ MECÀNICA En el cas dels medis de culGus bacterians, la selecció dels mecanismes d’agitació és menys estricta, atès que els bacteris presenten una baixa sensibilitat. De forma contrària, els bioreactors per cèl·lules vegetals han de 8  4t curs Farmàcia presentar unes caracterísGques molt concretes per tal de minimitzar el dany cel·lular i maximitzar l’homogeneïtzació del medi de culGu. Sistema que empra 1 o + pales per homogeneïtzar el culGu. En el cas de bioreactors de cèl·lules vegetals, aquestes han de presentar hèlixs còncaves que permeten reduir el dany (“les dels bacteris son planes”). a. Pales: evita la formació d’agregats i la sedimentació b. Raqueta: permet opGmitzar l’homogeneïtzació del centre del Per bioreactor rotació c. Hèlix: actua com un “obridor d’ampolles de vi” Existeix una gran varietat de mida, forma i disposició de les pales possible, que generen diferents Gpus de fluxos i, doncs, indueixen danys diferents. Tot i que aquest mecanisme causa més dany que el sistema de balanceig, es tendeix a fer servir més en processos industrials. Sistema de “balanceig” (vaivé) que aprofita el corrent en forma d’ones per homogeneïtzar el cultiu, normalment empra bosses de plàstic d’un sol ús o multiús (però es canvien al cap d’un temps). Sense rotació Aquest tipus de mecanisme mou el medi cel·lular per tal d’evitar la sedimentació; i, a més, permet ampliar la superfície d’oxigenació (avantatge). !!!Limitació: no es pot fer servir en grans volums (màx 300-500L). El de pales és millor per l’escalat però té més dany mecànic. El de balanceig té menys dany mecànic però més limitació del volum. AGITACIÓ PER AIRE Els bioreactors també poden ser agitats per corrents d’aire → permeten minimitzar l’estrès (tot i que no eliminar-lo) ja que la força i velocitat d’aquests afecten a les cèl·lules. Columna de borbolleig Airli= Sistema que insufla aire o un gas Sistema que insufla aire o un gas estèril, a través d’un difusor i a ↓ estèril, directament i a ↑ pressió, pressió, per la part inferior del bioreactor - tot i que aquest accedeix al per la part inferior del bioreactor - medi de culGu a través de corrents d’aire laterals, formats per tal de de tal manera que també danya disminuir el dany cel·lular (respecte l’altre). Major capacitat les cèl·lules. Menor cost i menor d’homogeneïtzació, tot i que té un cost més elevat i una probabilitat probabilitat de contaminació. de contaminació superior (ja que és més complexe). Els bioreactors amb agitació per aire no exerceixen la mateixa força que els d’agitació mecànica → el seu medi és més viscós, de tal manera que presenten un menor creixement cel·lular i una menor capacitat d’homogeneïtzació. Tendeixen a tenir una gran altura i un diàmetre pe:t (per facilitar el fluxe d’aire), fet que dificulta el seu escalat - també és més di€cil que el dels bioreactors de pales. Bioreactors: adaptacions pels cul:us d’arrels Han de presentar unes altres caracterísGques per tal d’evitar el trencament d’aquests òrgans (i la pèrdua del culGu): punt d’anclatge per les arrels i protecció de les pales. 9  4t curs Farmàcia D’altra banda, en aquest Gpus de sistemes, la distribució de la biomassa no és uniforme i, en conseqüència, la transferència de nutrients tampoc. Degut a l’anterior, la mescla no és homogènia i la transferència de massa pot arribar a ser insuficient en algunes parts de les arrels, fet que deriva en l’aparició de necrosi, processos d’autòlisi i la pèrdua de la capacitat biosintèGca. AGITACIÓ Segueix el mateix mecanisme que en els culGus cel·lulars però requereix d’un MECÀNICA comparGment intern - composat per una malla d’acer o nylon - que ancla l’arrel i les protegeix de les pales d’agitació, que sempre han d’estar al fons. AGITACIÓ Segueix el mateix mecanisme que en els culGus cel·lulars. PER AIRE a. AirliR: ha d’incloure una malla d’acer que serveixi d’anclatge per les arrels. b. Columna de borbolleig: ha d’incloure un sistema d’immobilització per les arrels, que pot ser: - Espuma de poliuretans: permet anclar-hi totes les arrels. - Fixació a eixos: permet anclar les arrels en diferents “columnes”. Bioreactor de Spray: immobilització en reixeta Sistema de bioreacció molt úGl actualment. Es basa en l’administració del medi de culGu a través d’un difusor situat a la part superior del recipient (com si es tractés d’una dutxa) i això permet una distribució més uniforme dels nutrients. Les arrels estan immobilitzades sobre malles situades a diferents nivells- presenta dues bombes peristàlGques (1 d’entrada del MC i 1 d’extracció d’aquest). Inoculació En medis de culGu d’arrels, el procés d’inoculació tendeix a suposar un fort inconvenient, atès que es sol requerir un gran nombre d’aquestes (sobretot en bioreactors de molts litres) → Cal fer un pre-cul:u d’arrels en bioreactors més peGts que actuen com una columna de borbolleig: 1. Pre-culGu de les arrels en un bioreactor de Gpus columna de borbolleig. 2. Tancament de bioreactor per a facilitar-ne el transport cap al de major mida. 3. Càrrega del bioreactor gran amb el de menor mida, obrint la palanca de fuga del segon (situada a la zona inferior) i insuflant aire estèril per la part superior d’aquest. Exemple: producció industrial de ginsengà → TIPUS DE BIOREACTORS Avui en dia, està començant a ser tendència fer servir bioreactors d’un sol ús i de menor mida, atès que aquests permeten evitar la pèrdua de tot el producte si només es contamina un dels sistemes - en conseqüència, a nivell industrial, s’estan construint plantes de bioreactors peGts. 10  4t curs Farmàcia Sistemes de producció industrial Discon:nu Con:nu Sistema tancat de gran mida Sistema obert de gran mida, compost per 3 (=bioreactor), al qual s’inoculen comparGments (un reservori de medi, un arrels o cèl·lules per tal de bioreactor central i un de recollida de culGvar-les i recol·lectar-les al mostra); de tal manera que pot aportar cap d’un període de temps. medi de culGu i recol·lectar el producte - Només es poden modificar els d’interès connnuament. paràmetres externs del culGu → llum, - Es pot regular la concentració de substrat i el temps de Tª i aireig contacte amb el MS (paràmetres interns) - No es pot afegir ni reGrar res del medi - UGlitat: cèl·lules i arrels que alliberen el producte fins al final del culGu d’interès al medi de culGu (o a les quals es pot extreure - UGlitat: cèl·lules i arrels que acumulen aquest a través de diferents mecanismes) el producte d’interès al seu interior Aquest requereix una major instrumentació pel que és més suscepGble de ser contaminat que fa que requereixi més mesures de precaució. A vegades, la producció d’interès no sempre té lloc alhora que la producció de biomassa, fet que es resol amb el desenvolupament de culGus en 2 fases: 1. Tanc que conté medi de culGu dissenyat per opGmitzar creixement de les cèl·lules. 2. Bomba peristàlGca que transporta el conGngut del tanc 1 al tanc 3. 3. Tanc de creixement (200 L): s’hi inoculen les cèl·lules o arrels amb la finalitat d’induir el creixement de la biomassa (fins obtenir els valors adequats per començar la producció). 4. Bomba peristàlGca que transporta el conGngut del tanc 3 al tanc 7. 5. Tanc que conté medi de culGu dissenyat per opGmitzar la producció de les cèl·lules. 6. Bomba peristàlGca que transporta el conGngut del tanc 5 al tanc 7. 7. Tanc intermig: permet la subsGtució del medi de creixement pel de producció (filtrat). 8. Bomba peristàltica que transporta el contingut del tanc 7 al tanc 9. 9. Tanc de producció (700 L): s’hi emmagatzemen les cèl·lules o arrels que es troben en la fase estacionària (= producció dels metabòlits d’interés) - destacant que aquesta és la raó per la qual presenta una mida superior que el tanc de creixement. 10. Bomba peristàltica que transporta el contingut del tanc 9 al tanc 11. Tanc de recollida dels productes d’interés des del medi de cultiu (per filtrat). D’altra banda, és important entendre que el tipus de sistema anterior es sol fer per cultius de cèl·lules, mentre que és molt poc comú emprar-lo en el desenvolupament de cultius d’arrels. Abans de tot el procés es fa una prova pilot de menor mida. Producció de siconina en suspensions cel·lulars de Lithospermum erythrorhizon (2 fases) Color vermell: indica la producció de siconina (aquesta presenta aquest color). Aquest culGu permet incrementar la producGvitat més de mil vegades i reduir el cost. 11  4t curs Farmàcia TEMA 3. Enginyeria metabòlica Conceptes Enginyeria genè:ca: conjunt de tècniques que permeten alterar les caracterísGques d’un organisme mitjançant la modificació dirigida i controlada del seu genoma. Plantes transgèniques: presenten un genoma modificat mitjançant enginyeria genèGca, en introduir un o diversos gens nous o modificar la funció d’un gen endogen. Aquests gens s’expressen i confereixen a les plantes un o diversos caràcters NOUS. Enginyeria metabòlica de plantes: manipulació, a través d’enginyeria genèGca, d’una o més rutes biosintèGques vegetals. Requeriments per la manipulació de rutes metabòliques - Coneixement de les rutes metabòliques secundàries (com dels intermediaris de les rutes, enzims, especificitat i comparGmentació de les rutes) - Coneixement de les funcions dels metabòlits secundaris: permet obtenir una idea del Gpus d’expressió genèGca dels gens involucrats en les rutes i si aquests requereixen la presència d’inductors o elicitors (com mimeGtzar l’estrès) - Capacitat de clonació dels gens per tal de permetre’n la modificació Estratègies per millorar la producció del metabòlit d’interès 1) Disminuir el catabolisme del compost desitjat 2) Millorar l’expressió o l’acGvitat d’un enzim limitant de velocitat 3) Evitar la inhibició per retroalimentació d’un enzim clau 4) Disminuir el flux per vies compeGGves 5) Millorar l’expressió o l’acGvitat de tots els gens implicats en la ruta 6) ComparGmentació del compost desitjat 7) Conversió d’un producte existent en un producte nou Transformació de la cèl·lula vegetal Seleccionar el teixit per la transformació → crear el casset de transformació → introduir el casset al teixit vegetal i seleccionar les cèl·lules transformades. Casset de transformació: I. IdenGficar el gen d’interès (GOI) II. Aïllar i clonar el GOI (amplificar en un vector bacterià) III. Modificacions per a una integració i expressió exitoses a la planta Estructura d’un gen Transgèn (mòdul d’expressió = gen quimèric) 12  4t curs Farmàcia MÈTODES DE TRASNFROMACIÓ Transformació directa Vectors naturals - Bombardeig amb microparbcules (biolís:ca) - Agrobacterium tumefaciens - Protoplasts: Electroporació, polieGlenglicol - Agrobacterium rhizogenes TRANSFORMACIÓ DIRECTA: Bombardeig amb microparbcules (biolís:ca) - Pot uGlitzar-se sobre qualsevol Gpus de teixit - No es garanteix la integració ni l’expressió estable dels gens (expressió transitòria) - Eficiència de transformació estable baixa Mecanisme de biolís6ca: 1. Amplificació del gen d’interès en cèl·lules d’E.coli 2. Extracció dels gens mul8plicats dels plasmidis 3. Inserció dels segments de DNA i les microparUcules d’or dins d’un mateix eppendorf → de tal manera que les microparUcules quedin recobertes dels segments 4. Col·locació de les parUcules a la cambra de bombardeig 5. Bombardeig de les parUcules sobre un cul8u de cèl·lules o teixit a través d’un difusor que perme8 incrementar la supergcie tractada i la probabilitat de transformació. Distància entre el disc de bombardeig i el teixit vegetal → es pot ajustar per evitar danyar el teixit o les cèl·lules degut a la força d’acceleració [p.ex. caldrà reduir-la per tractar teixits gruixuts i augmentar-la per tractar teixits prims] VECTORS NATURALS: Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens: bacteri gram+, natural del sòl, que té la capacitat d’infectar plantes i causar-ne l’agalla de la corona. És un rar exemple de transferència horitzontal de gens entre regnes de manera natural. Un fragment d’ADN del plasmidi Ti es transfereix del Agrobacterium a la cèl·lula vegetal (T-DNA) provocant la seva transformació i induint un creixement proliferaGu incontrolat (tumor). Posteriorment, el teixit tumoral lliure de bactèria pot créixer en un medi de culGu sense fitohormones. Estructura gènica DNA cromosòmic: - Gens Chv → parGcipen en el reconeixement de les molècules senyals de les plantes - Gens del catabolisme d’opines → permeten obtenir l’energia a parGr d’aquestes DNA plasmídic: presenta tot un seguit de regions molt ben diferenciades Regió del DNA de transferència, emmarcada entre dos marges de 25 pb repeGGus → Ler Border (LB) i Right Border (RB). Aquesta regió és transferida a les cèl·lules vegetals i té la capacitat d’inserir-se en el seu genoma de forma estable. Està composada per: T-DNA - Gens inductors de tumors oncogens → implicats en la síntesi d’auxines i citoquinines i doncs, responsables de la formació dels tumors - Gens que codifiquen per la síntesi de opines (com a A.rhizogenes) → les opines són “sucres” que serveixen d’aliment al bacteri per tal que sobrevisqui (40 kb) Regió del DNA que no es transmet a la cèl·lula vegetal però la qual conté tot un seguit de Regió gens imprescindibles per la transmissió del T-DNA. Vir 13  4t curs Farmàcia Gens VirA i VirG: codifiquen per les proteïnes VirA i VirG de forma consGtuGva, independentment de la “inducció del bacteri”. Aquestes proteïnes consGtueixen un sistema receptor de dos components que, en acGvar-se, indueix l’expressió de la resta dels gens Vir. S’expressen fins i tot en absència de la planta hoste. 1. Una planta ferida allibera compostos fenòlics (Acetosiringona). Això actua com a senyal imprescindible per l’acGvacio de VirA i VirG 2. L’Acetosiringona s’uneix a la proteïna dimèrica VirA, situada a l’espai periplasmàGc (entre la membrana interna i l’externa) 3. VirA s’autofosforila i després, fosforila a VirG 4. VirG (acGva) fosforila un seguit de residus de la regió Vir, induint així la síntesi de la resta de gens Vir Gen VirD2: codifica per una endonucleasa específica de cadena que talla el T-DNA per les seqüències Border (l’allibera del plasmidi) i, posteriorment, s’uneix covalentment al seu extrem 5’ (per protegir-lo fins arribar al nucli). A més, aquesta proteïna facilita l’entrada del T-DNA al nucli de la cèl·lula vegetal ja que és reconeguda per alguns receptors de la membrana. Gen VirD1: codifica per una helicasa que també parGcipa en l’escissió del T-DNA de la resta del plasmidi (= ajuda a l’endonucleasa VirD2). Gen VirE2: codifica per una proteïna la qual s’uneix (envolta i protegeix) la cadena de T-DNA alliberada de diferents enzims de degradació de la cèl·lula vegetal (p.ex. endonucleases i exonucleases). Gens VirB1-VirB11 i VirD4: codifiquen per un conjunt de proteïnes que formen el complex-canal de transferència (TSS4) del T-DNA a través del qual el T-DNA surt del bacteri. Així doncs, les proteïnes VirD2 i VirE2 permeten reconèixer alguns factors de transcripció de la membrana nuclear de la cèl·lula vegetal (com algunes imporGnes) i, per tant, hi afavoreixen l’entrada del material genèGc. Tot seguit, determinats enzims alliberen el T-DNA i aquest s’integra al genoma vegetal → actualment es creu que ho fa de forma totalment aleatòria, de tal manera que genera mutacions en el genoma que el rep. Transferència i integració del T-DNA des del bacteri al nucli de la cèl·lula vegetal Diverses proteïnes d’Agrobacterium i de la planta contribueixen al moviment del T-DNA cap al nucli. Quan ja tenim això inserta al genoma, Gndrem la cèl·lula transformada. Desenvolupament d’Agrobacterium com a vector de transformació de plantes A nivell de laboratori i de forma sintèGca, el mecanisme d’infecció d’aquest bacteri s’usa per transferir material genèGc d’interès a moltes cèl·lules vegetals; les parts imprescindibles dels plàsmids són les sequencies border, els gens Vir i els gens Chv (mentre que el T-DNA és intercanviable, ja que no codifica pel mecanisme de transformació). És a dir, canviem el T-DNA pels gens que m’interessen i ho posem entre les seqüències border (i mentre esGguin presents els gens Vir) i ho transferim a la cèl·lula que ens interessa. Per fer això, hem de crear el plasmidi desarmat (entren els gens introductors de tumors – oncogens) 14  4t curs Farmàcia - Plàsmid desarmat: plàsmid d’Agrobacterium sense patogenicitat (“al qual se li han eliminat els oncogens”) però el qual mante la virulència (els gens Vir) i per tant pot transferir el T-DNA Virulent però no patogen. - Plàsmid Ti: plàsmid desarmat d’Agrobacterium que transporta un gen d’interès entre els marges esquerre i dret, de tal manera que es pot transferir a les cèl·lules vegetals. Qualsevol gen entre els marges dret i esquerre es pot transferir a les plantes. El sistema de vectors binaris de T-DNA Degut a l’excessiva mida que presenta un plàsmid Ti complet (= 200 kb), avui en dia es treballa amb sistemes de vectors binaris. Tenim 2 plasmidis i per això és binari. El T-DNA i els gens Vir es troben en plasmidis separats: - Plàsmid Ti: conté els gens Vir (imprescindibles per la transformació) - Vector binari: conté el T-DNA amb un gen d’interès i un gen marcador, els quals han d’estar sempre situats entre les seqüències border (LB i RB), que es troben en un plasmidi d’E.coli que facilita la clonació Només es 6ndrà èxit en la transformació si: 1. El nou gen ha d’arribar al nucli de la cèl·lula i inserir-se en un cromosoma 2. La cèl·lula que rep el gen ha d’estar viva 3. La cèl·lula transformada ha de dividir-se i donar lloc a una planta sencera 4. El transgen ha d’inserir-se al cromosoma, en un lloc que no interfereixi en l’expressió. Efecte posicional → Si la inserció és a l’atzar i s’insereix en un punt on davant hi ha un silenciador, aquest gen no s’expressarà i per tant no obGndrem la caracterísGca que volem expressar. 5. El nou gen no ha d’inserir-se en la seqüència d’un gen existent que afecG la supervivència de la cèl·lula o la producGvitat de la planta Si tot això funciona Gndré la cèl·lula transformada i a parGr d’aquí he de regenerar una planta. Quan transformem cèl·lules (ja sigui via agrobacterium o biolísGca) obGndrem cèl·lules transformades i cèl·lules que no. A l’hora de regenerar la planta ens interessarà fer-ho a parGr de les cèl·lules transformades (ja que sinó faríem molta feina que no té necessitat). 15  4t curs Farmàcia Gens marcadors Els gens marcadors ens permetrà seleccionar les cèl·lules transformades. Aquest gen Gndrà el seu propi promotor (regula l’expressió) i el seu propi terminador (indica el final de la transcripció). Si les cèl·lules noves tenen el gen marcador, ens indica que s’han transformat. Aquests gens codifiquen per proteïnes que confereixen resistència a la cèl·lula vegetal davant d’anGbiòGcs o herbicides (les cèl·lules que no s’hagin transformat no Gndran aquesta resistència). És un sistema de detecció: - Resistència a kanamicina (gen de la neomicina fosfotranferasa d’E.coli) - Resistència a hidromicina (gen de la fosfotransferasa d’E.coli) - Resistència a basta (herbicida) Transformació estable via Agrobacterium Cal que hi hagi una super€cie ferida. 1. Incorporació del plasmidi Ti dins els Agrobacterium que contenen el vector binari 2. Addició d’una suspensió d’Agrobacterium a una placa de petri que conté medi de culGu per afavorir-ne el creixement → es deixa durant unes 24h 3. Disposició de “discs de fulles” sobre la placa anterior per tal de transformar-los 4. Traspàs dels “discs de fulles” a una nova placa que conté un medi de selecció (s’afegeix el gen de selecció i l’anGbiòGc per evitar el creixement de la planta) 5. Eliminació dels “discs de fulles” no transformats i creixement dels que SÍ que s’han transformat 6. Traspàs dels “discs de fulles” transformats a una nova placa que conté hormones (la relació auxina/citoquinina ha de ser pròxim al valor de 1) 7. Formació del teixit de call sobre els “discs de fulles”. Es passa el teixit de call a un nou medi de culGu on posarem cinines >> auxines per que es formi la part aèria 8. Formació de gemmes i traspàs d’aquestes a un medi d’arrelament, el qual pot no contenir hormones o presentar una relació hormonal favorable per les auxines 9. Regeneració de les plantes transgèniques i traspàs d’aquestes a ex vitro. Requereix un pas intermedi d’aclimatge: cobertura de les plantes amb un plàs8c o una estructura d’urna que, progressivament, es va obrint per permetre l’adaptació de l’organisme a les noves condicions (ex: humitat). REGULACIÓ DE L’EXPRESSIÓ GÈNICA L’expressió d’un transgen està regulada a nivell espacial i/o temporal pel promotor. A parGr de la caixa TATA en direcció 5’ apareixen seqüències cis (específiques de cada promotor) les quals són llocs de reconeixement per proteïnes nuclears específiques, els factors de transcripció (element trans). Aquests s’uneixen a les seqüències cis i modulen la transcripció regulant l’acGvitat de la RNA polimerasa. 16  4t curs Farmàcia Tipus de promotors en plantes Cons:tu:us Específics de teixits Induïbles És un promotor que s’expressa Modulen l’expressió gènica Restringeixen l’expressió gènica a la en totes les parts de la planta i restringint-la a det cèl·lules, teixits presència d’esnmul. Responen a en qualsevol estat de o òrgans. (específics de llavors, esnmuls externs. desenvolupament. fruits, arrels, flors, pol·len...) Control de l’expressió de gens na?us Origen víric/bacterià: Control intern més precís de i transgens mitjançant un esBmul · 35CaMV (35 del virus del l’expressió de gens na?us i extern mosaic de la coliflor): el més transgens uGlitzat Sistemes derivats de plantes (A) · Promotors d’opines (Osc, Nos) · Fruit: E8, PG (poligalacturnoasa, Responen a esnmuls externs proteïna enzimàGca que (estrès biò:c o abiò:c): sequera, Origen vegetal: degrada la paret) Tª, ferida, llum, patògens... · Ubi: gen que codifica · Fulla: RCBS3A (subunitat peGta UbiquiGna (blat de moro, Ubi- del rubisco), cab19 (proteïna 1, Ubi-2) d’unió a clorofil·la a/b) Sistemes no derivats de plantes (B) · Act: gen que codifica AcGna · Llavors: proteïnes de reserva: Responen a compostos químics (arròs, Act-1) glutelina i globulina (arròs), específics (tetraciclina, coure, · Adh: gen que codifica alcohol lecGna i faseolina (soja), nabina esteroides) deshidrogenasa (blat de moro, (brassicàcies), zeïna (blat moro) Avantatge: són independents dels Adh-1) · Tubèrcul: pataGna processos normals de la planta Promotos induïbles A. Sistemes derivats de plantes: responen a esbmuls externs (estres biòGc o abiòGc). Cal destacar que, independentment de l’esnmul (biòGc o abiòGc), tots ells conflueixen en l’alliberació de determinades hormones de l’estrès (ABA). Promotors de resposta a sequera: elements Promotors de resposta a ABA (elements ABRE DRE (A/GCCGAC) (ACGTGG/T) Promotors induïbles per fred i deshidratació. Promotors induïbles per ABA. CBF1: factor de transcripció que s’uneix al EmBP1: factor de transcripció que s’uneix al promotor promotor i l’ac8va. ARBRE. DRE (element de resposta a deshidratació): CE (element d’acoblament): segon promotor del procés, promotor del procés. el qual se li uneix a un altre factor de transcripció. Important: els factors de transcripció sempre tenen una seqüència complementària a la del seu promotor i, generalment, una de localització nuclear. B. Sistemes no derivats de plantes: són promotors induïts per compostos químics específics (etanol, coure, tetraciclina...). El seu gran avantatge és que són independents dels processos normals de la planta i doncs, 17  4t curs Farmàcia només requereixen l’aplicació de substàncies específiques que indueixin la seva expressió. Són úGls en enginyeria metabòlica. Caracterís6ques requerides: - No ha d’haver expressió del transgen en absència del inductor - El sistema ha de respondre específicament al inductor - La inducció de l’expressió genèGca ha de ser ràpida després de l’aplicació del inductor - L’expressió genèGca ha d’acabar ràpidament després de la reGrada del inductor - El inductor no ha de ser tòxic - El inductor no ha de causar canvis no específics en l’expressió genèGca Tinc el promotors 35S modificat amb elements cis els quals són elements d’unió per un agent inductor. Després Gnc el terminador. El factor transcripcional que s’esta produïnt a la planta de forma consGtuGva només s’unirà a l’element cis del promotor modificat amb presència del agent inductor. Quan apliqui l’agent inductor, el factor transcripcional s’unirà al P35S. Expressió induïble per etanol amb el sistema alcR/AlcA Factor de transcripció ALCR: flanquejat pel terminador NOS (tNOS) i el promotor consGtuGu CaMV35S complet (p35S). Gen d’interès: flanquejat pel terminador 35S (t35S) i el promotor induïble PalcA. És un promotor quimèric AlcA- 35S que conté dos llocs d’unió ALCR del promotor d’Aspergillus nidulans alcA i un promotor mínim 35S. Expressió induïble per esteroides El factor transcripcional es podrà unir quan afegim l’esteroide o el coure, el factor transcripcional és capaç de reconèixer el lloc d’unió al promotor. El factor de transcripció quimèric GVG s'uneix, després del tractament amb dexametasona, a sis còpies del Gal4 UAS, acGvant així la transcripció del gen d'interès. Compar:mentació de proteïnes Quan estem fent un transgen, tenim en compte el promotor, la regió codificant i el terminador; però també hem de tenir en compte ON vull que vagi aquesta proteïna. La localització subcel·lular de les proteïnes ve determinada per seqüències específiques dels aminoàcids (relaGvament curtes) que es troben a la mateixa proteïna. Aquesta seqüència és responsable de que les proteïnes siguin: secretades (vagin a l’espai extracel·lular) importades al nucli dirigides a altres orgànuls Tenim dues principals vies de direcció de proteïnes: Co-traduccional Post-traduccional Ruta de secreció. Ruta d’importació al nucli o direcció a altres òrgans. 18  4t curs Farmàcia Síntesi de proteïnes per part de ribosomes anclats a Síntesi de proteïnes per part de ribosomes lliures (al la paret del RER, des d’on passen a l’Aparell de Golgi i, citosol), les quals posteriorment viatgen cap a la posteriorment, poden ser excretades (a través de la seva regió diana - gràcies a la presència de senyals membrana plasmàGca) o enviades als lisosomes (en de localització (als extrems). cèl·lules animals) i els vacúols (en cèl·lules vegetals). Exemples de seqüències senyals Bpiques: Si van a la via de secreció han de tenir una senyal a l’extrem amino, que fa que vagin al RE. Si tenen la senyal RDEL quedaran re8ngudes al RE i si tenen una altra senyal, seran secretades al Golgi (que en el cas de plantes, aniran a les vacuoles). Les que no van a la ruta de secreció van al citoplasma; i si tenen una seqüència nuclear van al nucli. Senyal SKL a l’extrem C terminal les envia als peroxisomes o glioxisomes. Mòdul d’expressió (gen quimèric): cal tenir en compte lo anterior alhora de sinte8tzar el gen quimèric. Així doncs, per tal de poder inserir un gen de forma correcta en una cèl·lula desU (p. ex. proteïnes bacterianes en cloroplasts vegetals) sempre caldrà incloure-hi un promotor, una seqüència de senyalització, la regió codificadora i un terminador. La regió codificadora és el gen que interessa, i en funció d’on es vulgui que vagi s’haurà de direccionar. Els procariotes no tenen compar?ments separats pel que no tenen senyals I per tant, s’hauran d’afegir. APLICACIONS D’ENGINYERIA GENÈTICA Objec:us de l’enginyeria genè:ca: En color verd → objec>us d’interès de la indústria farmacèu>ca Cal destacar que, en modificar una planta per tal d’incrementar-ne la producció de metabòlits secundaris els quals de manera natural es produeixen nomes sota certes circumstàncies, sempre es corre risc d’afectar el seu desenvolupament i viabilitat. 19  4t curs Farmàcia 1. Augmentar els nivells d’un fitoquímic desitjat en una cèl·lula o en una planta: enginyeria metabòlica aplicada a la millora de la producció d’alcaloides tropànics. · Millora en la producció d’alcaloides tropànics (1a) 2. Augmentar els nivells de compostos desitjats en alimentació: com podrien ser vitamines, anGoxidants o altres compostos. També es fa per metabolisme secundari. · Millora en la síntesi de flavonoides (2a) · Millora de la producció de pro-Vitamina A en arròs (2b) Millora en la producció d’alcaloides tropànics (1a) Atropa belladona: planta que produeix alcaloides tropànics (hiosciamina i escopolamina) - destacant que l’activitat carminativa de l’escopolamina és superior a la del seu precursor. Hiosciamina 6β-hidroxilasa (H6H): enzim que sintetitza escopolamina a partir de l’hiosciamina → S’utilitza EG per introduir una còpia d’aquest gen en les plantes, les quals ja el contenen (cas de cisgènesi), per incrementar- ne la producció en un 1,2%. Promotor usat: 35S (permet l’expressió contínua del gen). La cisgènesi es dona quan es sobreexpressa un gen que ja té la planta (no s’introduiex un gen nou). Millora en la biosíntesi de flavonoides en tomàquets (2a) Els fenols són agents promotors de la salut que actuen com a quelant i eliminen agents carcinògens. També modulen la divisió cel·lular, promouen l’apoptosi i incrementen els nivells d’enzims anGoxidants. Aquests efectes prevenen el càncer i malalGes CV ja que ↓ els nivells de colesterol i àcids grassos en plasma. Major capacitat anGoxidants quan més grups OH Gnguin els fenols. Dins dels polifenols hi ha: Solubles Insolubles Estructures simples i flavonoides. Estructures de tanins condensats i protoantocianidines. Actuen a nivell d’òrgans i teixits. Són + complexes i + ac8us com a segrestant de radical peròxid. Actuen a nivell del tracte diges8u. Flavonoides: tetracèGds de síntesi mixta amb un elevat poder anGoxidant gràcies als grups -OH, els quals s’acumulen, principalment, a la pell de certes fruites. A la polpa, la seva síntesi està limitada per l’enzim Chalcona isomerasa (CHI). Les antocianidines es troben en fruits vermells. Mecanisme de síntesi de les antocianidines: 1. CHS (Chalcona sintasa): sinteitza les xalcones 2. CHI (Chalcona isomerasa): sinteitza flavanones a parGr de xalcones. A parGr de les Flavanones es poden sinteitzar dihidroflavonols (pas 3) o bé flavones [amb l’enzim FNS] o Isoflavones [enzim IFS] 3. F3H (flavanona 3 hidroxilasa): sinteitza dihidroflavonols. A parGr del dihidroflavonol es pot sinteitzar Flavonols [enzim FLS] 20  4t curs Farmàcia 4. DFR (dihidroflavonol reductasa): sinteitza proantocianidines a parGr de dihidroflavonols 5. ANS (Antociadin sintasa): sinteitza antocianidines a parGr de les pro Una dieta rica en antocianidines té molta acGvitat anGoxidant. També es pot augmentar l’acGvitat anGoxidant en aliments que no són tan altes. Millora en la biosíntesi d’antocianidines Es poden incrementar els nivells d’antocianidines, per exemple, en tomàquets. Avui en dia hi ha tomàquets morats degut a això. La CHI és l’enzim limitant de la fase i el seu gen pràcGcament no s’expressa en la polpa. Volem que s’expressi per tal d’augmentar la producció d’antocianidines. Una opció seria sobreexpressar aquest gen i així es sobreexpressaria tant en la pell com en la polpa. Per augmentar la producció d’aquest compost hem d’augmentar l’expressió de la resta de gens que es troben en la ruta sintèGca, que, en total, són 5 gens → CHS, CHI, F3H, DFR i ANS. Se sap que les antocianidines són produïdes per les plantes com a productes de defensa en situacions d’estrès o de sequera (entre altres) i de fet, la planta es posa morada. Per tant, quan hi ha un estrès, s’expressen tots aquests gens i ho fan al mateix temps. Això vol dir que, en el seu promotor, els elements cis han de ser semblants → a aquest element cis de cada gen se li ha d’unir el mateix factor de transcripció que condueixi a que tots els gens s’expressin de manera homogènia. Per evitar sobreexpressar els 5 gens, podem sobreexpressar únicament els factors de transcripció que acGven la ruta, els quals són DEL i ROS1. En conseqüència, per evitar transformar les cèl·lules vegetals amb 5 gens més (procés molt costós), es pot seguir la següent estratègia: introducció dels gens reguladors que codifiquen pels factors de transcripció dels gens anteriors (DEL i ROS1; ja que tots tenen els mateixos elements cis) i acoblats a un promotor d’expressió EXCLUSIVA en fruits madurs (E8); tant a la polpa com a la pell. (u6litzem E8 perquè va en paral·lel amb la producció d’e6lè que només s’expressa en la maduració del fruit). Millora de la producció de pro-Vitamina A en arròs (2b) Pro-vitamina A: tetraterpè (beta-carotè) que actua com a precursor de la síntesi de reGnol en els animals (després d’ingerir-se) i, doncs, el qual és de gran importància per la seva visió. En arròs es produeix provitamina A (NO vitamina A). Ac6vitats biològiques dels carotenoides en l’home Funcions Accions Associacions Ac8vitat provitamínica A - An8oxidant Associació inversa front el risc de: (aquesta no és comuna). - Immunopotenciadores - Cataractes - Inhibició de mutagènesis i transformació - Degeneració macular - Inhibició de lesions premalignes - Diversos 8pus de càncers - Protecció front a fotosensibilització - Malal8es CV Totes aquestes funcions són molt beneficioses i comunes per a tots els carotenoides. Els carotenoides que tenen acGvitat provitamínica A és perquè tenen la capacitat de converGr-se a re:nol. 21  4t curs Farmàcia Biosíntesi dels carotenoides: té lloc als cloroplasts i al citosol de les cèl·lules vegetals. 1. Fitoè sintasa (Cloroplast): uneix dues molècules de GGPP (Geranil Geranil Piro-Fosfat; 20C), per donar lloc al fitoè (20C) que és el precursor dels carotenoides. 2. Deshidrogenases: catalitzen la formació de dobles enllaços a la cadena del fitoè (fitofluè, carotè i neurosporè) per tal de formar el licopè (coloració vermella). També hi actua la licopè ciclasa. 3. Licopè ciclases: ciclen el licopè per tal de formar els β-carotens (provitamina A), els quals poden tenir un cicle o en un o en ambdós extrems de la molècula (coloració taronja). 4. Monooxigenasa: oxigenen (introdueixen un OH) els carotens per formar les xantofil·les – ZeaxanGna – (coloració groga) En el pas 3 les ciclases catalitzen la formació de diferents anells de ionona, dels quals només els de Gpus β (β-ionona) tenen l’ac:vitat pro-Vitamina A (únic compost que es pot transformar a reGnol); tot i que la resta de components segueixen mantenint les accions descrites a la taula anterior (degudes a l’acGvitat anGoxidant). Carotenoids: terme que inclou les molècules de carotens i xantofil·les. β-carotè: únic carotè que presenta 2 anells de β-ionona, el qual permet obtenir el doble de re8nol després d’ingerir-se (més eficient). Vitamina A: en conseqüència a tot lo explicat, tenint en compte que la Vitamina A és un nutrient essencial que ha de ser aportat per la dieta (com a tal o com a provitamina A), s’ha començat a enriquir arròs per tal de facilitar-ne la ingesta en aquelles poblacions que pateixen escassetat d’aliments. Dèficit de vitamina A: causa ceguesa i debilitat del sistema immunitari (major risc d’infeccions, diarrees i malalGes respiratòries en nens). Enriquiment de l’arròs amb pro-Vit A: requereix de la introducció de tots els enzims encarregats de la síntesi del β-carotè a les cèl·lules de la planta (4). Fitoè deshidrogenasa del bacteri Erwinia (gen ctr1): duu a terme l'acGvitat de la fitoè deshidrogenasa i la ζ-carotè deshidrogenasa vegetals i, doncs, ens permet estalviar la introducció d’un gen (2 en 1). Mecanisme inicial d’enriquiment amb pro-Vitamina A A mode d’introducció, cal destacar que no és estrany que el bacteri Erwinia conGngui la Fitoè deshidrogenasa ja que els carotens es sinte:tzen als cloroplasts (els quals són orgànuls que provenen de cèl·lules bacterianes, fet que s’explica amb la teoria endosimbiòGca). 22  4t curs Farmàcia Així doncs, seguint amb l’anterior, per tal de transformar les cèl·lules d’arròs (i obtenir l’arròs daurat), és imprescindible emprar dos plasmidis amb dos gens cadascun: Gen psy: codifica per la Fitoè sintasa vegetal i, en conseqüència, ja conté inclosa la seqüència de senyalització de transport al cloroplast. Gt1 (promotor de la Glutenina): és específic de les llavors de les plantes. Gen crt1: codifica per la Fitoè desaturasa i la ζ-carotè deshidrogenasa bacteriana i, en consecuencia, cal incloure-li una seqüència de senyalització de transport al cloroplast (Tp) → aquesta seqüència s’afegeix a l’extrem N-terminal. 35S (promotor cons:tu:u): permet que s’expressi sempre però només als cloroplasts (atès que els ribosomes 35S es troben a aquest orgànul). Gen lyc (de narcís): (origen vegetal) codifica per la Licopè ciclasa vegetal i, en conseqüència, ja conté inclosa la seqüència de senyalització de transport al cloroplast Gt1p (promotor de la Glutenina9: és específic de les llavors de les plantes Gen aphIV: codifica per un gen de resistència a la higromicina (anGbiòGc) 35S (promotor cons:tu:u): permet que s’expressi sempre (per idenGficar-lo) Arròs daurat de 1a generació Com s’observa a la imatge de l’esquerra, tot i manipular metabòlicament l’arròs emprant ambdós plasmidis, només es podien obtenir 1,6 μg de provitamina A per 1g d’aliment; pel que aquest canvi seguia sent insuficient per cobrir els requisits nutricionals d’aquesta vitamina amb la dieta – caldria ingerir 1kg/dia d’arròs –. En conseqüència, a l’hora d’estudiar quin mecanisme causava la baixa eficiència, es va veure que l’enzim limitant de la ruta era aquell codificat pel gen psy – mentre que el lyc no ho era i per tant, no aportava cap uGlitat –. → per corregir això, es va desenvolupar un nou plasmidi amb el gen psy però sense el gen lyc i això va permetre obtenir plantes que produïen 6 μg de provitamina A per 1g d’arròs – de tal manera que amb 300g d’arròs es podien complir els requisits nutricionals de la dieta. Arròs daurat actual Tanmateix, determinats col·lecGus seguien sense poder ingerir 300 g d’arròs (nens) de manera que es va començar a crear un mètode més eficient → ús d’un promotor glu (de la Glutenina) pel gen psy (permet 23  4t curs Farmàcia concentrar l’acumulació dels productes en les llavors) i cerca d’un gen psy d’una altra espècie vegetal que acumuli més carotenoides (tomàquet, pebrot, blat de moro...). Important: no es pot fer servir el gen psy d’arròs ja que, al ser de la pròpia planta, es sotmet als processos de regulació d’aquesta (=silenciament del gen). Finalment, l’estratègia definiGva fou la introducció del gen psy de blat de moro amb un promotor glu i un terminador nos. Això ha permes obtenir plkantes transgèniques que produeixen 31 μg de provitamina A per 1 g d’arròs – amb 80 g d’ingesta es poden cobrir els RN. Esquema de la construcció final emprada per la transformació de l’arròs: Millora de la producció de carotenoides en patata Xantofil·les: també tenen efectes beneficiosos i ens pot interessar augmentar la seva concentració. Així doncs, es pot millorar la producció de carotenoides en la patata. Gen crtB (del bacteri Erwinia uredovora): codifica per una Fitoè sintasa pel que es relaciona amb l’increment de la producció de carotens i xantofil·les (p.ex. en introduir-se en les patates). B33 (promotor de la pata:na): és específic dels tubercles de les plantes. PTP: pèpGd de senyalització que indica el transport cap als plasts. EV (Efecte del Vector buit): és un control negaGu per estudiar l‘efecte de la transformació de cèl·lules amb un vector sense gen sobre l’expressió dels altres. Es fa per comprovar que els canvis són deguts al gen i no a altres causes. El geb crtB presenta diferents variants que produeixen diferents efectes sobre l’expressió de l’enzim – de les quals la crtB9 ha demostrat major eficàcia (=producció de 10,3 μg de xantofil·les i carotens per 1 g de patata, fet que els hi confereix la coloració groguenca). 24  4t curs Farmàcia Inhibició rutes compe::ves – supressió ac:vitat LYCe Una altra estratègia emprada per modificar la concentració de carotenoides en una determinada planta és la inhibició de rutes compeGGves de la síntesi del β-carotè. LYC-b: ciclasa que permet obtenir el β-carotè a parGr del licopè. LYC-e: ciclasa que inicia una ruta compeGGva del β-carotè. D’aquesta manera, per dirigir el flux metabòlic cap al compost d’interès (β-carotè), avui en dia es bloqueja l’expressió de LYC-e amb l’ús de RNA an:sen:t del gen LYCe (hibrida amb el RNA normal i, quan es construeix la doble cadena, no es dona la traducció pel que no es forma el LYC-e. Finalment, per poder incrementar els nivells de ZeaxanGna (important en la prevenció de malalGes degeneraGves a nivell ocular) en la patata, també es pot fer servir la tècnica anterior → ús d’un RNA an:sen:t del gen Zep. El gen Zep codifica per la Zeaxantana epoxidasa, la qual transforma la ZeaxanGna en altres xantofil·les de menor efecte (cosa que no ens interessa). Així mateix, al introduir el RNA anGsenGt d’aquest gen, aquest hibridarà amb el RNA missatger del gen Zep i formarà un híbrid no apte per la traducció, no es formarà el Zep i en conseqüència, tampoc la Zeaxantasa epoxidasa (incrementant així els nivells de ZeaxanGna). 25  4t curs Farmàcia TEMA 4. Producció de proteïnes terapèu:ques en plantes Producció de proteïnes terapèu:ques en plantes Les proteïnes terapèu:ques es fan servir com medicaments, vacunes, per diagnòsGc... i han de ser proteïnes d’origen humà. Hi ha una gran demanda de proteïnes recombinants a escala industrial (anGcossos, proteïnes derivades del sèrum com citoquinines, GH...). Tradicionalment s’uGlitzen culGus de bacteris, llevats, insectes i mamífers però les plantes són considerades com una plataforma de producció prometedora. Producció tradicional Producció prometedora Bacteris, llevats Plantes Insectes Mamífers Avantatges: - Cost-producció a gran escala Inconvenients: - No hi ha risc de contaminació del producte amb endotoxines o - Cost patògens humans - Escalabilitat - Com les cèl·lules vegetals són eucariotes tenen la capacitat de - Seguretat modificacions post-traduccionals (capaços de produir glicoproteïnes i complexes de proteïnes mulGmèriques) Criteris per a la valoració dels diferents sistemes - Biològic: producció i rendiment de proteïna acGva, modificacions post-traduccionals... és a dir, s’ha de produir la proteïna notablement i ha de ser acGva - Econòmic: cost total de producció, temps per arribar al mercat... *vermell → NO favorable // *verd→ SÍ favorable Així doncs, com s’observa a la taula, les cèl·lules vegetals (columna de la dreta) permeten dur a terme: · glicosilació de proteïnes (impossible en bacteris, incorrecta en llevats i parcialment correcta en insectes) · correcte plegament de proteïnes (requereix un refolding en bacteris i llevats) · síntesi de proteïnes mul:mèriques · evitar la contaminació per endotoxines · fabricar productes a escala industrial 26  4t curs Farmàcia Productes farmacèu:cs produïts en plantes Proteïnes terapèu:ques i Vacunes (comes:bles) An:cossos (plan_bodies) intermediaris - Vacunes per a porcs en blat de - Immunoglobulina A de secreció - SubsGtuts de sang moro - Proteïnes pel tractament de - Proteïna supressora de l’HIV en malalGes com: HIV, hepaGGs espinacs B... - Vacuna humana front l’hepaGGs B en la patata Aspectes crí:cs De proteïnes. En plantes no sempre és idènGca a la dels mamífers però existeixen estratègies Glicosilació per resoldre-ho (procés d’humanització de proteïnes). Temps Requereix de l’op:mització de l’esquema de producció Processos d’aïllament i purificació dels compostos fabricats, els quals són independents del sistema emprat (“sempre s’han de fer”, excepte alguns casos). Es fan emprant: DSP · oleosines · o secreció al medi (cul:us in vitro) Ha de ser com a mínim de l’1% de la proteïna soluble total, per poder ser compeGGu amb Rendiment altres sistemes → Op_mització a nivell d’enginyeria genèGca, d’acGvitat proteolíGca... Plataformes i tecnologies - Cul:u de cèl·lules o òrgans: bioreactors amb un MC definit Plataformes - Plantes senceres: sòl o culGus hidropònics (hivernacles per confinament) - Transformació estable: Agrobacterium, biolísGca Tecnologies - Transformació transitòria: biolísGca, Agrobacterium, altres - Transformació de cloroplasts Estratègies Biopharming El promotor o la regió reguladora és la part que regula la quanGtat de proteïna que es produeix. Es pot fer per dos mètodes: A. Produir la proteïna en un promotor cons:tu:u en TOTA LA PLANTA Avantatge Inconvenients Obtenció d’una gran quan:tat de proteïna – a Problemes de conservació, degut a la presència parGr de la part aèria de les plantes, ja que les d’enzims de degradació en la planta (com proteases). arrels no es tendeixen a recol·lectar (s’han de Important evitar la inacGvació. netejar). S’han de processar ràpid per evitar la degradació. B. Emprar promotors ESPECÍFICS. Aquests tenen avantatges i permeten l’acumulació de la proteïna en teixits de reserva, en llavors. Avantatge Obtenció d’una gran quan:tat de proteïna en les llavors, les quals estan especialitzades en l’emmagatzematge de substàncies durant molt temps i, per tant, no presenten enzims de degradació. Ex: soja, blat de moro, arròs, ordi... (millors → plantes oleaginoses). 27  4t curs Farmàcia Avantatges de l’acumulació de proteïnes terapèu_ques en LLAVORS L’elecció d’un promotor específic de llavors, com el de la glutelina, restringeix l’expressió del transgen a aquest òrgan vegetal, és a dir, que es doni l’expressió en aquesta part de la planta. - Absència de patògens endògens i pràcGca absència de fenols (l’eliminació de fenols i endo- i mico- toxines és necessària per a fer assajos clínics en humans) - Posseeixen una limitada gamma de proteïnes de reserva i, doncs, no tenen una alta concentració de proteïnes superabundants (p.ex. la RuBisCO). Si Gnc menys proteïnes, serà més fàcil purificar la meva - Les proteïnes romanen inalterades durant períodes de temps llargs, de manera que les llavors són considerades un bon sistema d’emmagatzematge i distribució - No es requereix un processament immediat → les proteïnes es poden extreure i purificar amb facilitat (amb l’ús de tecnologia de les oleosines/cossos lipídics) Acumulació de proteïnes en cossos lipídics Cossos lipídics: vesícules lipídiques amb membrana, que es troben arreu del citosol cel·lular i acumulen un seguit de substàncies de tot Gpus (com lípids de reserva). La seva membrana conté lípids, fosfolípids i proteïnes. La proteïna més abundant és la oleosina. Oleosina → presenta dues seqüències transmembrana, una part lipòfila (a l’interior) i els extrems N-terminal i C-terminal orientats cap al citosol (hidròfils i hidrosolubles). La tècnica es basa en l’ús de la proteïna anterior (oleoresina) per obtenir oleoresines recombinants (fusió traduccional de proteïnes) i facilitar el procés de purificació de gens). Composició oleoresina recombinant: - Promotor: comú d’ambdós gens (els expressa alhora) específic de llavors - Gen que codifica per les oleosines - Seqüència de reconeixement per una proteasa específica - Gen que codifica per una proteïna d’interès - Terminador comú d’ambdós gens Protease recogni_on: Entre els dos gens es posa una seqüència d’aminoàcids reconeguda per una proteasa específica. La proteïna d’interès esta unida a l’extrem carboxil de la oleosina a través d’una seqüència d’aa que serà reconeguda per la proteasa i es troba a la cara citosòlica. Fent extraccions i centrifugant es podrà alliberar la proteïna d’interès. Els cossos lipídics poden separar-se de l’extracte aquós total de les llavors per centrifugació (flotació) → procés fàcilment escalable i que pot desenvolupar-se de forma connnua. Procés d’extracció de proteïnes ob6ngudes amb oleosines recombinants: 1. Trituració de les llavors modificades amb aigua 2. Centrifugació de la mescla anterior i obtenció de la fracció oliosa 3. Neteja dels cossos lipídics (en afegir aigua) 4. Centrifugació de la nova mescla i obtenció de la fase oliosa 5. Addició de la proteasa específica (que talla les proteïnes recombinants) 28  4t curs Farmàcia Compar:mentació de proteïnes – via de secreció La localització de les proteïnes ve determinada, normalment, per les seqüències específiques d’aminoàcids, relaGvament curtes, que es troben a la mateixa proteïna. Així doncs, cal tenir en compte això a l’hora de fer el disseny dels transgens, per tal de permetre’n l’extracció: Seqüència ER TS a l’extrem N-terminal (Apoplast, Default pathway): Indueix la síntesi de la proteïna als ribosomes del RER i, des d’aquests, un transport vesicular cap a l’AG des d’on, posteriorment, serà excretada. Seqüència ER TS a l’extrem N-terminal i HDEL (o KDEL) al C-terminal (RE): Indueix la síntesi de la proteïna als ribosomes del RER on després queda reGnguda → permet incrementar el rendiment de l’obtenció de proteïnes amb un nº de sucres determinat. Seqüència ER TS a l’extrem N-terminal + ssVSD o ctVSD al C-terminal (vacúol): Indueix la síntesi de la proteïna als ribosomes del RER i, des d’aquests, un transport vesicular cap a l’AG des d’on, posteriorment, serà enviada al vacúol. Impacte de la glucosilació La glucosilació afecta a la qualitat de les proteïnes recombinants. La presència de diferents sucres pot afectar: - Estabilitat de les glicoproteïnes - Direccionalment (localització) subcel·lular - Immunogenecitat - FarmacocinèGca - AcGvitat biològica En conseqüència, aquests dos orgànuls, poden determinar la qualitat de les proteïnes. Estratègies per controlar la glucosilació de proteïnes recombinants en plantes: I. Localització subcel·lular: permet prevenir l’addició de sucres NO desitjats. II. Gluco-enginyeria: permet evitar l’addició de sucres vegetals i, fins i tot, reemplaçar-los per sucres humans (ja que s’està parlant de l’obtenció de proteïnes humanes). Esquema de glicosilació de proteïnes en vegetals: ER i Golgi 1. Síntesi co-traduccional de proteïnes als ribosomes de la membrana del RER – destacant que és imprescindible que Gnguin un pèpGd de senyalització per aquesta síntesi. 2. Transferència d’un N-oligosacàrid de la membrana del RER sobre els residus d’Asparagina (Asn) de les proteïnes (cada cop que aparegui un aa d’aquests). N-oligosacàrid = 2 N-ace6lglucosamines + 9 manoses + 3 glucoses 3. Inici del processament del N-oligosacàrid: ER AG Actuació de: Actuació de: 2 glucosidades → eliminen 3 residus de 1 manosidasa npica del orgànul → elimina 3 manoses glucosa 1 N- ace_lglucosaminatransferasa → afegeix una N- 1 manosidasa → elimina q residu de aceGlglucosamina) manosa 29  4t curs Farmàcia 4. Processament diferencial de les proteïnes animals i vegetals: Mamífers: addició de galactosa i àcid siàlic per enllaços β(1,4) Vegetals: addició de xilosa per enllaços β(1,2) i fucosa per ⍺(1,3) 5. Transport de les proteïnes al vacúol, on es seguiran processant mitjançant l’addició de sucres molt senzills (Gpus pausi-manosídic) Si es volen proteïnes sense sucres d’origen vegetal, una possibilitat és dirigir les proteïnes al RE. Així doncs, una estratègia que permet obtenir proteïnes animals a parGr de les vegetals es basa en parar el processament de les proteïnes vegetals al RER. D’aquesta manera evitarem l’addició de sucres diferencials però es manGndrà la glicosilació amb manosa (comuna en tots els eucariotes). → la retenció de les proteïnes al RER s’aconsegueix amb l’addició de seqüències HDEL o KDEL a l’extrem C-terminal (explicat anteriorment). Plantes productores de proteïnes terapèu:ques Malal_a de Gauscher: malalGa deguda a una deficiència de la hidrolasa lisosomal glucocerebrosidasa. Anys enrere, un fàrmac desenvolupat a parGr de l’enzim purificat de placentes humanes va resultar molt efecGu per reduït els símptomes clínics de la malalGa. Tanmateix, la necessitat de disposar de 10-12 tones/any de placentes per tal de produir suficient glucocerebrosidasa per al seu ús clínic, va converGr aquest fàrmac en un dels més cars del món – fins i tot, la seva recent producció per culGu de cèl·lules transgèniques de mamífers conGnua situant la glucocerebrosidasa entre els fàrmacs més cars. Cèl·lules animals: produeixen proteïnes glicosilades amb residus terminals d’àcid siàlic, els quals interfereixen en la interacció amb els macròfags i, doncs, s’han d’eliminar enzimàGcament (“això encareix el procés”). En conseqüència, per abaraGr el cost derivat de l’obtenció d’aquesta proteïna, es van començar a emprar culGus de cèl·lules de pastanaga en bioreactors → primera proteïna produïda per plantes transgèniques aprovada per la FDA (és de Pfizer). Cèl·lules vegetals: produeixen proteïnes glicosilades amb residus terminals de xilosa, els quals no causen problemes en pacients – fins i tot després d’una administració continuada → per tant, l’estratègia a seguir per mantenir l’estabilitat i viabilitat d’aquestes proteïnes és induir-ne l’acumulació al vacúol (així també tindran els residus de pauci-manoses. 30  4t curs Farmàcia Drug developement de la glucocerebrosidasa amb residus de manosa 1. Cul:u in vitro del T-DNA que conté el gen de la glucocerebrosidasa Promotor (CaMV o 35S): ha de permetre l’expressió constant de la proteïna Enhancer (TMV omega): element que acGva l’expressió del promotor Pèp:d senyal ER TS a l’extrem N-terminal (prové d’Arabidopsis thaliana) Gen de la glucocerebrosidasa humana Seqüència senyal pel vacúol (ssVSD N-terminal o ctVSD C-terminal) Terminador NOS (prové d’Agrobacterium tumefaciens) 2. Introducció del vector (amb el transgen) a les cèl·lules de pastanaga 3. Processament de la proteïna (glicosilació al RER i AG + transport al vacúol) Així doncs, l’avantatge d’aquesta tècnica és que no requereix de modificacions posteriors a la síntesi proteica, pel que disminueix el preu de manera important. Vacunes orals Vacunes orals: poden ser soques de virus o bacteris vius, atenuats i inacGvats o bé parts aïllades o simples proteïnes dels patògens (vacunes de subunitats, contenen només els epítops anGgènics primaris). La interacció amb les mucoses (nas, gola, intesn) elicita la resposta immune a nivell tant de Interacció mucosa (igA) i sistèmic (IgG). Es poden administrar en dosis controlades com aliments mínimament processats (purés, Administració pastes de farina o sucs vegetals). Aquest Gpus de vacunes es poden acumular de forma estable en teixits de reserva – com Estabilitat llavors de cereals o tubercles de patata. Això permet distribuir-les sense necessitat de mantenir una cadena de fred estricta per preservar la seva eficàcia. 31  4t curs Farmàcia La diferència principal entre les vacunes inacGvades (morts) i les vacunes atenuades (vives) cau en l’estat dels patògens que s’uGlitzen per elaborar-les i la seva capacitat per causar malalGa. Descripció de cadascun: Vacunes inac7vades (morts) Vacunes atenuades (vives) - Patògens que han estat morts o inac8vats amb - Patògens vius que han estat debilitats o atenuats en tractament gsic o químic (ús de calor o productes laboratori per reduir la seva virulència químics) - Poden replicar-se en el cos, però ho fan molt més - No poden replicar-se ni causar malal8es perquè han suaument que la seva contrapart morta perdut la capacitat de reproducció i infecció - Tendeixen a presentar una resposta immune més - Solen ser segures per a la majoria de persones, robusta i més duradora amb una sola dosi incloses les immunodeficients - Poden no ser del tot segures per a persones amb - Poden requerir dosis addicionals o adjuvants per sistemes immunològics dèbils o immunodeficients es8mular una resposta immune adequada (ja que no ja que hi ha un pe8t risc que el patogen atenuat són tan immunogèniques) causi la malal8a 32